过表达miR-103促进猪前体脂肪细胞分化

为阐明miR-103在猪前体脂肪细胞分化过程中的调控作用,采用Real-time PCR检测猪前体脂肪细胞成脂分化过程中的miR-103表达谱,明确了其在分化过程中的表达趋势;使用miR-103的腺病毒超表达载体感染猪原代脂肪细胞,随后采用Real-time PCR和Western blotting分别检测成脂标记基因PPARγ、aP2的mRNA和蛋白表达量变化;油红O染色观察腺病毒miR-103侵染的前体脂肪细胞诱导分化第8天的成脂情况。结果显示,miR-103的表达量随着脂肪细胞分化而增加,在miR-103超表达的猪原代脂肪细胞的诱导分化过程中,成脂标记基因PPARγ、aP2的表达量与对照相比显著升高,分化第8天观察到明显的脂滴。说明miR-103能够促进猪前体脂肪细胞分化。     

CTSB超表达促进体外培养的猪前体脂肪细胞分化

为研究溶酶体组织蛋白酶B(cathepsin B,CTSB)对脂肪细胞分化的影响,本实验构建了Ctsb重组腺病毒超表达载体,包装并侵染体外培养的猪前体脂肪细胞,采用油红O染色,油红O提取比色法检测猪前体脂肪细胞分化的情况,并通过real-time PCR法检测成脂关键基因mRNA水平的变化.结果显示,重组腺病毒Ctsb载体构建成功,转染猪前体脂肪细胞后,使Ctsb的mRNA和蛋白质表达量分别提高了约16倍和12倍. CTSB超表达能促进脂肪细胞的分化和脂质积累,成脂关键基因过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator-activated receptor gamma, PPARγ)、脂肪酸结合蛋白2(adipocyte protein 2, aP2)的表达量均有显著升高. 研究表明,提高Ctsb的表达能促进猪前体脂肪细胞分化,揭示了Ctsb在猪前体脂肪细胞分化过程中可能发挥关键作用. 研究结果为进一步研究其作用机制奠定了基础.     

过表达RBP4抑制体外培养的猪前体脂肪细胞分化

为研究视黄醇结合蛋白4(retinol binding protein 4,RBP4)对猪前体脂肪细胞分化的影响,实验构建了RBP4重组腺病毒表达载体,包装并感染猪前体细胞,采用油红O染色和Real-time PCR等方法,检测了过表达RBP4对成脂分化的作用. 研究结果显示,重组腺病毒RBP4载体构建成功,转染猪前体脂肪细胞后,使RBP4的mRNA水平和蛋白水平分别增加了约400倍和20倍. 过表达RBP4能减少脂肪细胞的脂质积累,降低成脂关键基因过氧化物酶体增生物激活受体γ (peroxisome proliferator-activated receptor gamma, PPARγ)和脂肪酸结合蛋白2 (adipocyte protein 2, aP2)的表达. 结果表明,RBP4对猪前体脂肪细胞分化有抑制作用,为进一步研究RBP4对猪前体脂肪细胞分化的作用机制奠定基础.     

维生素C通过调控脂肪形成相关基因的转录促进猪前体脂肪细胞的增殖与分化

探讨维生素C（Vit C）诱导猪前体脂肪细胞增殖分化最佳浓度及在分化过程中,5种脂肪形成相关基因peroxisome proliferator activated receptor gamma(PPARγ)和retinoid X receptor alpha(RXRα),脂肪细胞分化标志基因lipoprotein lipase (LPL),生脂基因phosphoenolpyruvate carboxykinase(PEPCK)、stearoyl CoA desaturase(SCD) mRNA表达时序性的变化. 以3　d龄猪前体脂肪细胞为实验对象,用Vit C诱导猪前体脂肪细胞增殖分化,分别在增殖分化第2、4、6和8 d收获细胞,利用MTT测定其增殖程度;油红O染色提取法检测其脂肪含量;采用SQ RT PCR法检测脂肪生成相关基因PPARγ、RXRα、LPL、PEPCK和SCD mRNA表达的变化. 结果显示,PPARγ mRNA在诱导分化第2 d时有低水平表达,在诱导分化过程中表达量逐步升高,在终末分化阶段仍保持高水平表达;RXRα mRNA在诱导分化第2和4 d表达量很低,诱导分化第6 d时表达增加.在诱导分化第8 d,RXRα mRNA表达与第6 d相比差异不显著,直至终末分化. 脂肪细胞分化标志基因LPL在第2 d开始表达,第4和6 d逐步升高,在终末分化阶段仍保持高水平的表达;生脂基因PEPCK和SCD mRNA在第2和4 d开始表达,第6和8 d仍保持高水平的表达. 研究结果表明,100 μmol/L的Vit C促进猪前体脂肪细胞增殖能力最强;250 μmol/L Vit C能显著促进猪前体脂肪细胞分化. 其作用机制可能是通过对转录因子PPARγ和RXRα及标志基因LPL mRNA时序性表达的调控来进行的,促进生脂基因的表达,从而诱导脂肪细胞的分化.     

白藜芦醇对猪原代前体脂肪细胞的增殖与分化及Sirtl基因转录表达时序的影响

分别以0μmol/L (对照组)、10μmol/L (低剂量组),20μmol/ L (中等剂量组),50μmol/L, 100μmol/ L (高剂量组)的白藜芦醇（Resveratrol,RES）处理体外培养1～3日龄健康仔猪前体脂肪细胞,采用MTT比色法检测细胞活性及增殖状况;油红O染色化学比色法定量分析细胞内脂肪生成及细胞分化程度;RT-PCR法分析Sirt1 (sirtuin1) mRNA 表达情况,探讨Sirt1对猪前体脂肪细胞增殖分化的影响及其分子机制。结果表明,脂肪细胞经RES处理后,各组MTT和油红O染色测得的光密度值(OD值)均低于对照组, 50μmol/L, 100μmol/L组在96～120h作用极显著(P<0.01),与中低剂量组差异显著(P<0.05);以20μmol/L,100μmol/L RES处理细胞后,Sirt1 mRNA表达量随细胞分化的进行而逐渐升高,100μmol/L组均显著高于对照组和20μmol/L组(P<0.05)。RES对猪前体脂肪细胞增殖分化均有一定抑制作用,高剂量RES (50μmol/L和 100μmol/L)可显著减少细胞内脂肪的合成、抑制脂肪细胞增殖与分化, Sirt1 mRNA表达量显著升高可能是RES抑制细胞分化的重要原因之一。     

miR-23b-3p通过靶向PDE4B基因调控山羊肌内前体脂肪细胞的分化

本研究旨在明确miR-23b-3p对山羊肌内前体脂肪细胞分化的影响,并确定这种作用是通过靶向基因PDE4B来实现的。基于实验室前期转录组测序结果,以筛选得到的山羊肌内脂肪细胞分化前后差异表达的miR-23b-3p为切入点,利用实时荧光定量PCR (real-time quantitative-polymerase chain reaction, qPCR)技术检测miR-23b-3p在山羊肌内前体脂肪细胞分化过程中的表达模式,从形态学水平和分子水平确定miR-23b-3p对脂肪分化及脂肪分化标志基因的影响;利用生物信息学预测以及双荧光素酶报告基因试验确定miR-23b-3p的下游靶基因,明确miR-23b-3p与预测靶标基因的靶向关系。结果表明,过表达miR-23b-3p后山羊肌内脂肪细胞脂滴积聚减少,成脂标志基因AP2、C/EBPα、FASN、LPL表达水平极显著下调(P＜0.01),C/EBPβ、DGAT2、GLUT4和PPARγ的表达水平显著下调(P＜0.05)。干扰miR-23b-3p表达后,山羊肌内脂肪细胞中脂滴积聚增多,ACC、ATGL、AP2、DGAT2、GLUT4、FASN和SREBP1表达水平极显著上调(P＜0.01),C/EBPβ、LPL和PPARγ的表达水平显著上调(P＜0.05)。通过生物信息学分析预测,PDE4B可能为miR-23b-3p的靶标基因,且过表达miR-23b-3p后极显著降低PDE4B的mRNA表达水平(P＜0.01),干扰miR-23b-3p后PDE4B的mRNA水平得到了显著提升(P＜0.05)。双荧光素酶报告基因试验结果表明,miR-23b-3p与PDE4B基因存在靶向关系。miR-23b-3p通过靶向PDE4B基因调控山羊肌内前体脂肪细胞的分化。     

BAMBI通过促进ERK1/2磷酸化抑制猪前体脂肪细胞分化

为了研究BAMBI在猪前体脂肪细胞分化过程中的作用,构建了BAMBI慢病毒干扰载体,包装并感染猪前体脂肪细胞,采用油红O染色、油红O提取比色法检测猪前体脂肪细胞分化情况,采用Real-time qPCR、Western blotting检测成脂标志基因mRNA以及蛋白水平表达的变化情况。结果表明,BAMBI慢病毒干扰载体感染前体脂肪细胞后显著降低了BAMBI的表达,shRNA2干扰效率最高,达到了60%以上,干扰BAMBI后能增加猪脂肪细胞的脂质积累,增加了成脂标志基因过氧化物酶体增殖物激活受体γ(Peroxisome proliferator-activated receptorγ,PPARγ)和脂肪酸结合蛋白2(Adipocyte protein 2,ap2)的表达。此外,干扰BAMBI后ERK1/2的磷酸化水平减少了。这些结果表明,BAMBI可能通过促进ERK1/2的磷酸化抑制脂肪细胞分化。     

白藜芦醇对猪原代前体脂肪细胞的增殖与分化及Sirt1基因转录表达时序的影响

分别以0μmol/L(对照组)、10μmol/L(低剂量组),20μmol/L(中等剂量组),50μmol/L,100μmol/L(高剂量组)的白藜芦醇(Resveratrol,RES)处理体外培养1~3日龄健康仔猪前体脂肪细胞,采用MTT比色法检测细胞活性及增殖状况;油红O染色化学比色法定量分析细胞内脂肪生成及细胞分化程度;RT-PCR法分析Sirt1(sirtuin1)mRNA表达情况,探讨Sirt1对猪前体脂肪细胞增殖分化的影响及其分子机制。结果表明,脂肪细胞经RES处理后,各组MTT和油红O染色测得的光密度值(OD值)均低于对照组,50μmol/L,100μmol/L组在96~120h作用极显著(P<0.01),与中低剂量组差异显著(P<0.05);以20μmol/L,100μmol/LRES处理细胞后,Sirt1mRNA表达量随细胞分化的进行而逐渐升高,100μmol/L组均显著高于对照组和20μmol/L组(P<0.05)。RES对猪前体脂肪细胞增殖分化均有一定抑制作用,高剂量RES(50μmol/L和100μmol/L)可显著减少细胞内脂肪的合成、抑制脂肪细胞增殖与分化,Sirt1mRNA表达量显著升高可能是RES抑制细胞分化的重要原因之一。     

Errα通过抑制β-Catenin促进猪前体脂肪细胞成脂分化

雌激素相关受体α（Errα）和Wnt/β-Catenin 信号通路都能够调控成脂分化.研究表明Errα和wnt/β-Catenin信号通路之间存在互作,β-联蛋白（β-Catenin）是Wnt/β-Catenin 信号通路的关键因子. 为了研究Errα和β-Catenin在脂肪生成中的相互作用,在293A细胞中包装得到Errα腺病毒并侵染猪前体脂肪细胞. LiCl 和XCT790被用于不同处理的猪前体脂肪细胞. 蛋白质印迹实验发现,在成脂分化过程中,Errα表达升高,β-Catenin表达降低. 显微观察绿色荧光发现,Errα腺病毒能够侵染猪前体脂肪细胞. 蛋白质印迹实验显示,在猪前体脂肪细胞中,Errα腺病毒促进Errα表达,XCT790抑制Errα表达. 油红O染色结果表明,β-Catenin抑制成脂分化,而Errα通过抑制β-Catenin促进成脂分化. 进一步的蛋白质印迹实验表明,在猪前体脂肪细胞成脂分化过程中,LiCl能够稳定β-Catenin表达,Errα抑制β-Catenin表达. 这些发现提示,Errα通过抑制β-Catenin表达来促进成脂分化.     

CircECH1通过充当miR-365-5p海绵抑制猪前体脂肪细胞增殖（英文）

环状RNA (circRNA)是一种共价封闭RNA,在脂肪发育过程中具有重要作用。本研究旨在探讨猪环状RNA ECH1 (circECH1)对前体脂肪细胞增殖的调控机制。本研究通过实时荧光定量PCR (qRT-PCR)分析、Sanger测序和RNase R酶消化法成功鉴定circECH1的稳定环状结构,其在马身猪各个组织中均有表达,并且其在脂肪组织中的表达量随日龄增加呈上升趋势。功能研究证明,干扰circECH1后,增殖相关基因PCNA、CDK1和MKi67极显著升高(P<0.01),增殖细胞数量极显著增加(P<0.01)。为进一步探究其分子机制,使用miRDB、miRWalk和RNAhybrid预测circECH1的下游靶基因。通过双荧光素酶报告基因分析和RNA结合蛋白免疫沉淀技术,验证circECH1能靶向结合miR-365-5p。在猪前体脂肪细胞中过表达miR-365-5p会增殖相关基因PCNA和CDK1的表达量极显著升高(P<0.01),增殖细胞数量极显著增加(P<0.01);干扰miR-365-5p后增殖相关基因PCNA、CDK1和MKi67的表达量极...