包含体内重组蛋白质的复性

具有临床、工业生产、药用功能的真核生物蛋白质的供给常常受到其天然来源的限制。可喜的是基因工程技术的发展使许多真核生物蛋白质能在细菌细胞中进行表达[1] 。大肠杆菌由于培养和基因操作容易而成为最受欢迎的表达系统 ,但是重组蛋白质在大肠杆菌中的高水平表达常常导致以包含体形式存在的胞內聚集的变性蛋白质的形成。这种变性蛋白质的量可高达总的重组蛋白质量的95%。由于以包含体形式存在的聚集蛋白质分子不具有正确的三维结构 (天然结构 ) ,它们在水溶液中通常不溶解且没有活性 ,因此大肠杆菌中包含体的形成就意味着可溶性重组蛋白…     

包含体蛋白质的复性研究进展

包含体的形成是异源蛋白质在大肠杆菌中高效表达的必然结果,也是目前产生重组蛋白质最有效的方法之一。不可溶、无生物活性的包含体必须经过变性、复性才能获得天然结构,完整特定的生物学功能。聚集是造成重组蛋白质复性产率低下的主要因素,因此理解蛋白质聚集机制,减少和防止聚集的发生是建立高效、高产率复性方法的关键。分子伴侣、低分子量添加物等在复性过程中的应用及新的复性方法的建立都大大提高了重组蛋白质复性产率。     

蛋白质复性

重组ＤＮＡ技术为大规模生产目标蛋白质提供了崭新的途径。但人们在分离纯化基因工程表达产物时却遇到了意想不到的困难 :很多利用大肠杆菌为宿主细胞的外源基因表达产物如尿激酶、人胰岛素、人生长激素、白介素 6、人γ 干扰素等 ,不仅不能分泌到细胞外 ,反而在细胞内聚集成没有生物活性的直径约 0 .1～ 3.0 μｍ的固体颗粒———包含体[1] 。这些基因表达产物的一级结构 (即氨基酸序列 )虽然正确 ,而其立体结构是错误的 ,所以没有生物活性。因此 ,为获得天然状态的目标产物 ,必须在分离回收包含体后 ,溶解包含体并设法使其中的目标蛋白质…     

杆状病毒表达载体系统

杆状病毒表达载体系统是近年来发展起来的较高效的表达外源基因系统。由于多角体病毒中多角体蛋白基因的非必需性、高表达性、重组病毒的易鉴定等特性,以及多角体蛋白基因的强启动子使其特别适于基因工程中作为表达载体,借助于转移载体可将外源目的基因转移到野生型AcMNPV中,在一个被转移载体和野生型AcMNPV共转染的细胞内,可以通过同源重组完成目的基因的转移。应用不同的转移载体可表达出融合及非融合蛋白质。经该系统表达的重组蛋白质具有生物学活性,其中大部分进行翻译后剪接产生与天然蛋白质相似的重组蛋白质。这些产物的抗原性,免疫原性和功能都与天然蛋白质非常相似。目前,应用该系统已成功地表达了许多酶、生长因子、病毒抗原包括病毒的外壳蛋白等有生物活性的蛋白质。本文对如何最大限度表达外源基因及该表达系统的发展前景作了讨论。     

蛋白质复性技术

重组蛋白质的过表达常导致其在胞内发生错误折叠和聚集,形成被称为包含体的聚集体。因此,蛋白质复性是许多基因重组蛋白质药物生产过程的重要步骤。本文简要介绍包含体提取、纯化和溶解工艺,重点阐述蛋白质复性技术,包括稀释复性、稀释添加剂、人工分子伴侣、柱色谱复性和反胶团溶解复性等。最后展望蛋白质复性技术的发展和应用,特别是荷电介质对同电荷蛋白质复性的促进作用。     

包含体的体外复性研究进展

在大肠杆菌中大量表达的重组蛋白质常常形成无活性的、不溶性的包含体。包含体经过液固分离、洗涤、变性溶解后,经过一个合理的复性过程可重新折叠成有活性的蛋白质。本文概述了常用的包含体复性方法,并对近年来出现的色谱复性法和应用一些低分子量添加剂等来提高蛋白质复性的产率做了简述。     

重组蛋白包涵体的复性研究

重组蛋白在大肠杆菌中的高表达往往形成不可溶、无生物活性的包涵体,需经过变性溶解后,在适当条件下复性形成天然的构象,才可恢复其生物活性．变复性实验是建立在对蛋白质体外折叠机制的了解的基础上．根据近年来对蛋白质折叠机制的认识和重组蛋白包涵体在复性方面的主要进展,论述以下3个方面的内容：1)蛋白质在细胞内的折叠机制;2)蛋白质体外折叠机制;3)蛋白质复性的策略和方法．     

包含体的体外复性策略

外源基因在大肠杆菌中高水平表达时,通常会形成不溶性、无活性的蛋白聚集体即包含体。包含体富含表达的重组蛋白,经分离、变性溶解后须再经过一个合适的复性过程实现变性蛋白的重折叠,才能够得到生物活性蛋白。近年来,发展了许多特异的策略和方法来从包含体中复性重组蛋白。介绍稀释法、透析及分子排阻、固定化金属离子亲和层析、疏水层析复性等策略和进展;物理化学因素、前导肽协助蛋白折叠;人工分子伴侣辅助蛋白折叠及反胶束、多聚物用于蛋白复性。     

包涵体蛋白体外复性的研究进展

外源基因在大肠杆菌中高水平表达时 ,通常会形成无活性的蛋白聚集体即包涵体。包涵体富含表达的重组蛋白 ,经分离、变性溶解后须再经过一个合适的复性过程实现变性蛋白的重折叠 ,才能够得到生物活性蛋白。近年来 ,发展了许多特异的策略和方法来从包涵体中复性重组蛋白。最近的进展包括固定化复性以及用一些低分子量的添加剂等来减少复性过程中蛋白质的聚集 ,提高活性蛋白的产率。     

重组人血管生成素制备和生物活性鉴定

血管生成素（angiogenin,ANG）是一种很强的促血管生成因子,与肿瘤的发生发展有着密切的关系,拮抗ANG被认为是抗肿瘤血管靶向治疗的一个有效途径. 同时,ANG具有促进伤口愈合、保护神经元以及抗细菌感染等活性.但是,开展相关研究所需的最基本的天然ANG蛋白来源非常有限,大规模表达和纯化有生物活性的重组血管生成素蛋白（rANG）具有广泛的应用前景. 我们可以在大肠杆菌中表达rANG,但表达产物在胞内聚集形成不溶性的包含体,需经变性、复性、阳离子交换层析和反向C18的HPLC方法纯化后,才能获得高纯度的rANG. 经SDS-PAGE鉴定,纯化蛋白质为单一条带,质谱鉴定蛋白分子量与理论分子量一致. 经体外活性检测,证实纯化的蛋白质具有核糖核酸酶活性、促内皮细胞管腔形成和细胞核转位等生物学活性.本文详细描述了rANG的表达、纯化、活性鉴定等过程和所使用的方法与技术.     

离子束重组酵母菌N6076的基因表达与蛋白质组学初步研究

利用低能氮离子注入介导外源DNA转化酵母菌,获得了遗传稳定的产醌类物质的重组酵母菌株N6076。利用抑制差减杂交(SSH)技术从重组菌N6076的DNA中分离获得了14个差异表达基因片断,其中由于碱基突变造成其蛋白质氨基酸序列变化的差异表达基因有4个。这些差异表达基因的功能分别涉及遗传信息的转录和翻译。应用2-D荧光差异双向电泳-质谱(2-D DIGE-MS)技术,在重组菌N6076中共检测到56个蛋白质表达量变化的差异点(p0.05),其中26个蛋白质表达量上调,编号为273和1 294的蛋白质可信度指数分别为81.37%和12.86%。本研究为离子束重组酵母菌生物合成醌类物质的代谢通路研究提供了一定的帮助。     

功能性包涵体的研究进展

利用原核系统表达外源重组蛋白的一个特点是表达蛋白多以包涵体形式存在。在过去人们一直认为包涵体是错误折叠、无生物活性的蛋白,需要经过变复性的过程重新获得有生物活性、可溶的蛋白,因而变复性条件的摸索迄今仍然是该领域的难点。但近几年的研究表明包涵体并非都是无生物活性的,功能性包涵体(或者称为非传统意义包涵体) 概念的提出是该领域的一个重大研究进展。由于功能性包涵体本身具有生物活性,可在非变性条件下提取,目前已经在生命科学的基础研究、生物制药、生物材料、生物催化等领域展现出良好的应用前景。重点从功能性包涵体的定义、形成机理、提取条件等近期研究进展进行综述,以期为原核细胞表达和工业生产重组蛋白药物提供新的思路。     

重组蛋白质纯化中切割蛋白酶的选择与应用进展

现代生物医药的发展越来越依赖大分子药物的开发与应用,其中蛋白质药物所占的比重越来越高,生产需求进一步加大.重组蛋白质技术作为一种方便的蛋白质生产来源,日益得到广泛运用.重组蛋白质纯化过程中往往使用到融合亲和纯化标签,然而这些冗余的标签在蛋白质精细化生产中,尤其是作为蛋白质医药存在时,是必须被予以去除的.切割蛋白酶发挥着不可替代的作用.本文就现有的各种常用切割蛋白酶进行比较和总结,为重组蛋白质生产与科研者提供参考.     

EB病毒感染相关外泌体的研究进展

外泌体(exosome)是由机体多种细胞释放的一种纳米级膜性小囊泡,包含母细胞来源的蛋白质、脂质以及核酸等物质,参与细胞间的信号传递,在疾病的发生、发展中起着重要作用。EB病毒(epstein-barr virus,EBV)是一种嗜人类淋巴细胞的双链DNA疱疹病毒。研究证实EBV感染的细胞分泌外泌体,其携带有EBV编码的功能性蛋白和核酸等多种生物活性分子,且这些生物活性分子在EBV感染相关疾病的发生、诊断及治疗中具有重要意义。现就近年来EBV感染相关外泌体中蛋白和核酸等方面的研究现状作一概述。     

间充质干细胞来源的外泌体治疗缺血性脑卒中的研究进展

外泌体是直径为30～150 nm的细胞外囊泡,内含细胞来源的核酸和蛋白质等生物活性分子,在细胞间通讯过程中发挥重要作用。间充质干细胞来源的外泌体可有效转运mRNA、microRNA及蛋白质等生物活性物质,具有促进血管生成、减轻炎症反应、调节自噬水平、抑制细胞凋亡和焦亡等重要生物学功能,其在改善神经系统疾病预后方面有着良好的临床应用前景。该文就间充质干细胞来源的外泌体对缺血性脑卒中的神经保护作用及机制进行了综述,并讨论了靶向修饰的外泌体在治疗缺血性脑卒中的应用,以期为后续研究提供参考。     

重组蛋白质在大肠杆菌体系中的可溶性表达策略

大肠杆菌表达体系因其表达量高、周期短、成本低等诸多优势特征而被广泛用作重组异源蛋白质的表达宿主。据统计超过30%的重组蛋白质药物和50%重组蛋白质的制备是使用大肠杆菌作为表达宿主。蛋白质错误折叠或未折叠以及包涵体形成是大肠杆菌表达体系更广泛应用的主要阻碍。因此,重组蛋白质在大肠杆菌体系中可溶性表达策略探索意义重大。综述了重组蛋白质在大肠杆菌表达系统中不可溶性表达的原因、机制以及影响大肠杆菌表达系统重组蛋白质可溶性的一些关键因素,并基于外源蛋白质在大肠杆菌中表达的各个步骤,总结了目前促进蛋白质在大肠杆菌表达系统中高效、可溶性表达的策略,为进一步拓展大肠杆菌表达体系在重组异源蛋白质可溶性表达中的应用提供参考。     

相思豆毒蛋白—a A链在大肠杆菌中的表达及体外生物活性的测定

用RT PCR方法克隆了相思豆毒蛋白 aA链 (ABRaA)的cDNA编码序列 ,并将其重组到原核表达质粒 pET2 8b中。成熟的ABRaA在大肠杆菌中得到高效表达 ,可溶性重组蛋白质的获得率达 4mg/L培养物 ,而且具有较好的纯度。重组蛋白质体外生物活性的测定结果表明 ,其对兔网织红细胞裂解液的体外蛋白质生物合成具有较强的抑制作用 ,IC50 为 0 .0 8nmol/L ,与天然ABRaA的 (0 .0 6nmol/L)相差不大 ;重组ABRaA蛋白表现出较强的N 糖苷酶活性 ,其可切割大鼠肝脏核糖体 2 8SrRNA的A4 32 4位点 ,释放出一条约 4 2 0nt的小片段RNA。这些结果提示重组的ABRaA具有有效的生物活性 ,可以作为一种潜在的肿瘤化疗药物而用于制备免疫毒素。     

本期重点推介

将特定的金属元素结合到蛋白质上,在生物学研究中有助于蛋白质定位等,而在技术应用中有助于开发功能性生物-无机纳米复合器件。北京化工大学生命科学与技术学院宋磊和陈劲春基于已报道的杆状病毒表面展示技术,利用Bac-to-Bac表达系统,将金特异性结合短肽基因Au-bp同家蚕核型多角体病毒BmNPV的gp64基因进行连接,重组到AcMNPV中,构建成多角体启动子控制下表达融合     

包涵体复性研究进展(英文)

用基因工程技术在大肠杆菌高水平表达重组蛋白时,通常形成无生物活性的包涵体。包涵体在体外经分离、溶解与重折叠后可实现复性,表现为具有生物活性的蛋白。总结了包涵体的相关复性技术,重点介绍重折叠的最新进展情况 。     

SARS冠状病毒M基因的克隆及其表达

从SARS冠状病毒(GD322株)组织培养上清中提取RNA,进行RTPCR扩增其M基因并克隆到巴氏毕赤酵母表达载体pPICZaB,电穿孔法将重组体整合人酵母菌P．pastoris,经抗生素Zeocin筛选产生的转化子进行表型鉴定,取Mut^-菌用甲醇诱导表达,SDS-PAGE检测其表达产物。Mut^-酵母转化菌经甲醇诱导可分泌表达约65kDa和42kDa的蛋白质,与SARS恢复期病人血清的免疫印迹证实它们为特异的重组M蛋白质,且获得的重组M蛋白质具有免疫反应性。