镉胁迫下麻疯树转录组测序分析

麻疯树是一种能适应多种恶劣环境条件的能源植物,目前关于其抵抗重金属胁迫的分子调控机理尚不清楚。从组学水平整体分析其基因表达模式对于筛选关键基因、解析镉胁迫响应调控网络和促进分子育种具有重要意义。利用Illumina测序技术对水培条件下培养的处理组(Cd 100)和对照组(CK)麻疯树幼苗叶的转录组进行高通量测序,两个数据库的测序数据经de novo组装得到50448条高质量的Unigene。两个样品中发现了2551条差异表达基因,其中539条上调基因,2012条下调基因。根据不同数据库的注释信息,发现麻疯树镉胁迫引起叶片中多种代谢途径的变化,包括碳代谢,光合作用,植物激素信号转导以及植物病原响应途径。DAVID分析显示镉胁迫引起了麻疯树叶中与离子转运相关基因的变化,导致叶片中Na离子和铁离子稳态的变化。转录因子分析发现WRKY和ZIP在镉胁迫中发挥重要作用。用qRT-PCR技术对随机挑选的5个基因进行荧光定量验证,结果与测序数据一致,证实了差异表达基因数据的有效性。深入探讨了麻疯树镉胁迫的分子机理,为进一步应用于基因工程和植物修复提供基础。     

交替氧化酶在麻疯树盐胁迫响应中的作用

麻疯树耐贫瘠,能在降水量少、环境恶劣的地区种植,但麻疯树的抗逆机理至今尚未揭晓。研究了盐胁迫对麻疯树生长的影响以及交替氧化酶(AOX)在麻疯树盐胁迫响应中的作用。结果表明,麻疯树具有较强的耐盐性,200 mmol/L和400mmol/L NaCl处理对麻疯树幼苗生长影响不大,叶片叶绿素含量和细胞含水量与对照组材料相比无明显差异。1 mol/L NaCl处理时麻疯树生长减缓,气孔开度降低,但未表现出明显的胁迫损伤。盐胁迫条件下,AOX呼吸和AOX基因的转录水平明显上升。与对照组材料相比,AOX基因转录水平在200 mmol/L和400 mmol/L NaCl处理时上升近两倍,而在1 mol/L NaCl处理时上升近3倍。结果表明,AOX可能在麻疯树盐胁迫应答过程中起关键作用,与减轻植株氧化损伤有关。     

麻疯树水通道蛋白新基因JcPIP干旱胁迫下的功能分析

采用RT-PCR和RACE技术,从大戟科(Euphorbiaceae)耐旱植物麻疯树(Jarropha curcas)cDNA中克隆得到了一个麻疯树质膜内膜蛋白(PIP)新基因,命名为JcPIP.聚类分析表明,麻疯树PIP蛋白与蓖麻、葡萄和菠菜的PIP蛋白在进化上有最近的亲缘关系.将JcPIP基因在非洲爪蟾卵母细胞(xenopus oocytes)中异源表达发现细胞膨胀率扩大了10倍,表明JePIP基因编码的是一个水通道蛋白.合成亲水性、抗原性好的JcPIP保守序列多肽,制备并纯化JcPIP多克隆抗体.Western-bbt检测显示JcPIP蛋白富集在29 kDa区段,且在麻疯树各组织中均有大量表达.PEG-6000干旱胁迫下麻疯树叶片JcPIP蛋白丰度增加,复水后丰度开始下降,表明JcPlP与麻疯树的耐旱性相关.     

麻疯树雌雄花中MADS-BOX基因的表达分析

麻疯树(Jatropha curcas)种子含油率高,种子中的油类物质可作为生物柴油被开发和利用,是极具潜力的生物质能源树种之一。麻疯树雌雄异花,在自然条件下雄花数量通常远远大于雌花,这大大限制了种子和油的产量,因此开展麻疯树性别分化与花发育分子机理的研究具有重要意义。该研究选取10个麻疯树的MADS-BOX基因(JcAGL1,JcAGL6,JcAGL9,JcAGL11,JcAGL15,JcAGL61-3,JcAGL62-1,JcAGL62-6,JcAGL62-7,JcAGL80-2),提取麻疯树早期发育各个阶段的雌雄花总RNA,并反转录成cDNA,采用实时荧光定量方法,探索早期发育不同阶段的麻疯树雌雄花目的基因的表达情况。结果表明:目的基因在发育起始的雌雄花中的表达具有差异,比如JcAGL6和JcAGL15在雄花中表达量要高于雌花,而JcAGL1,JcAGL9和JcAGL11在雌花中的表达量要高于雄花,这说明花原基中目的基因表达会直接或间接决定性别分化的方向;在之后的发育过程中,目的基因的表达情况在雌雄花中有所不同:随着花的发育,目的基因在雌雄花中的表达量变化存在差别,这反应出麻疯树雌雄花发育中目的基因表达模式上的差异;另外,也能看出在此过程中各个目的基因又发挥着不同的功能。该研究结果为进一步探究麻疯树雌雄花发育相关基因的表达提供了理论依据,为了解麻疯树性别分化和花发育的分子机理奠定了基础。     

麻疯树G蛋白γ亚基JcAGG3基因的克隆及表达分析

从麻疯树c DNA中克隆到一个与拟南芥AGG3同源的基因,命名为Jc AGG3。该基因开放阅读框为834bp,编码277个氨基酸,软件预测等电点为8.61,分子质量为30.514k Da。亚细胞定位预测显示其定位于细胞质膜上。在该基因的顺势作用元件上发现了与胚乳发育、激素调节、光响应和逆境胁迫相关的启动元件。荧光定量PCR(q PCR)检测发现,Jc AGG3在根、茎、叶和种子中均有表达,在发育中的种子中表达量最高,幼叶中的表达量显著高于老叶,在茎中只检测到极微量的表达;对麻疯树的幼苗进行黑暗处理后Jc AGG3基因表达显著下调,脱落酸(ABA)和干旱胁迫处理下Jc AGG3表达量显著增加。     

一个麻疯树花羧酸酯酶基因的克隆、表达分析和原核表达

基于麻疯树RNA-Seq数据,利用RT-PCR技术成功从麻疯树花器官中克隆获得JcCXE7基因的开放阅读框,长度为957 bp,编码318个氨基酸,预测该蛋白分子质量为35.55 kDa。对JcCXE7基因的时空表达进行分析,结果表明,JcCXE7基因可能参与了麻疯树雌花大孢子母细胞发生和减数分裂;且在雌花中的表达水平大大高于雄花。利用原核表达体系对JcCXE7基因进行诱导表达,随后对获得的蛋白进行了LC-MS/MS鉴定,并对JcCXE7蛋白的氨基酸序列与同源家族进行多重比对及其结构进行分析,结果表明JcCXE7蛋白可能为GID1家族蛋白。     

麻疯树种子的研究进展

麻疯树（Jatropha curcas L．）为大戟科（Euphorbiaceae）麻疯树属半肉质小乔木或大灌木,具有很强的抗旱、耐贫瘠的特性。麻疯树的根、树皮、叶和种子均可人药。种子中主要含有脂肪类物质、蛋白质和萜类物质,其毒素为麻疯树毒蛋白和种子油。种仁中的含油量约为50％,可作为理想的生物柴油;毒蛋白、种子油及其他种子提取物可作为生物农药。关于麻疯树种子的发育、脱水行为及其调控研究较少。麻疯树是二种具有重要经济价值的战略资源。     

酵母菌促进铅和镉胁迫下麻疯树生长的研究

为了筛选对铅和镉具有抗性和吸附性的酵母菌,构建麻疯树根系-酵母菌联合修复体系,促进高浓度铅和镉胁迫下麻疯树的生长。该研究分别从麻疯树的根段、珙桐的茎段、珙桐的根段分离到3株具有铅、镉抗性的酵母菌,分别命名为Jc、Di1、Di2,测定了三者对铅、镉的抗性和吸附性,并将筛选出的2株能吸附铅、镉的酵母菌菌株接种到麻疯树幼苗,研究接种两种酵母菌的麻疯树植株对铅、镉胁迫的响应。结果表明:经形态学和生理生化特征观察,Jc初步鉴定红酵母属(Rhodotorula sp.),Di1为假丝酵母属(Candida sp.),Di2为德巴利酵母属(Debaryomyces sp.)。三种酵母菌对铅、镉都有一定的抗性,其抗性能力的大小为JcDi2Di1。Di1和Jc对铅和镉都具有一定的吸附性将其用于接种麻疯树幼苗。与不接种酵母菌(CK)的麻疯树植株相比,接种Di1和Jc的麻疯树植株在根、茎、叶、全株干重方面显著增加,叶绿素、全株氮、全株磷浓度显著增加,SOD、POD、CAT的活性提高,丙二醛(MDA)浓度显著下降。从综合接种效应来看,Jc、Di1作为铅、镉的钝化剂,是铅、镉胁迫下促进麻疯树生长的备选菌株,这对于提高麻疯树对铅、镉污染土壤修复效率具有重要的意义。     

木薯MeHB2转录因子的克隆与表达分析

该研究以木薯(Manihot esculenta Crantz)Ku50为实验材料,采用RT-PCR方法从叶片中克隆了1个HD-Zip基因MeHB2。MeHB2基因含有882bp的开放阅读框,编码293个氨基酸。蛋白质保守结构预测显示,MeHB2编码的蛋白含有Homeodomain、Leu zipper和HD-Zip_N等结构域,属于HD-Zip II成员。进化树分析表明,MeHB2与麻疯树、杨树和杞柳中同源基因的亲缘关系较近。实时荧光定量PCR分析表明,低温胁迫、渗透胁迫、ABA和H2O2均可诱导MeHB2基因的表达,而盐胁迫抑制其表达。此外,MeHB2的表达量还受到遮荫胁迫的诱导。研究表明,MeHB2在木薯非生物逆境调控中扮演重要角色。     

麻疯树两种核糖体失活蛋白的表达模式分析

目前,麻疯树核糖体失活蛋白已发现2种:种子中的毒蛋白curcun和叶片中的逆境诱导蛋白curcin-L,其基因的表达模式均呈现出器官特异性.mRNA和蛋白质水平分析显示,curcin只在种子的胚乳中积累,且表达开始于心型胚时期,成熟时达到最高;而curcin-L在正常生理条件下并不表达,但受脱落酸、水杨酸、干旱,高低温等胁迫诱导时仅在叶片中表达.     

不同非生物胁迫对麻疯树幼苗光合速率等生理指标的影响

对麻疯树(Jatropha curcas L.)幼苗在不同非生物胁迫下的净光合速率(Pn)和蒸腾速率(Tr)等生理指标的变化进行了研究。结果表明,在缺磷处理中,麻疯树叶片Pn保持在对照的90%左右,气孔导度(Gs)和胞间CO2浓度(Ci)在处理2 d后显著增加,Gs上升20%～40%,Ci升高4%～16%,Tr变化不大;处理17 d时,麻疯树的P含量下降55%～85%,而干重只下降3%。缺氮处理9 d时麻疯树叶片的Pn下降到最低,之后维持在对照的64%左右,Gs在处理2～7 d显著高出对照15%～57%,处理9～16 d恢复到对照水平,Ci从第2天开始上升,高出对照4%～24%,Tr变化不大;处理17 d时组织中N含量显著下降47%～78%,植株干重下降23%。盐胁迫处理5 d后,麻疯树叶片Pn降低到对照的54%,之后维持在对照的48%左右,Gs、Ci和Tr与Pn的变化一致,均呈下降趋势;处理17 d,叶柄和茎中P含量增加37%～54%,组织中K+/Na+下降87%～96%,植株干重下降18%。干旱胁迫处理6 d,叶片Pn快速下降至29%,Gs、Ci和Tr与Pn整体变化趋势一致;处理第7天,叶片细胞膜透性增加67%,停止浇水17 d后植株干重下降55%,同时叶片卷曲下垂,老叶脱落。麻疯树植株Pn在缺磷胁迫过程中最早达到相对稳定状态,其次为盐胁迫和缺氮胁迫。这说明麻疯树植株对缺磷环境具有良好的适应性,而对缺氮环境适应性相对较差;耐盐类型可能属于逃避盐害中的聚盐植物,适应干旱环境的机制属于御旱性类型。     

一个麻疯树RING型锌指蛋白基因JcRFP1的克隆及表达

首次从麻疯树胚乳cDNA丈库中克隆得到一个RJNG型锌指蛋白基（GenBank登录号为JF920726）,命名为JcRFP1。该cDNA长度为728bp,包含编码JcRFP1蛋白的完整开放阅读框（516bp）。脚,基因在麻疯树各器官中均检测到表达且表达量依次为：叶〉茎〉花〉果实〉种子〉根。将克隆到的JcRFP1基因的cDNA序列连接到表达载体pET32a（＋）上,导入BL21（DE3）pLysS菌株,成功诱导表达相对分子质量为33．2kDa的可溶性融合蛋白。该融合蛋白免疫新西兰大白兔,得到效价为1：6500的抗血清。研究表明,JcRFP1蛋白具有体外泛素连接酶E3活性,在麻疯树体内可能参与油菜素甾醇信号转导途径。     

麻疯树curcin启动子的分离及其在转基因烟草中的功能分析

核糖体失活蛋白是一类可以使核糖体28S rRNA的保守α茎环结构域脱嘌呤的蛋白质。麻疯树毒蛋白（curcin）前体基因编码麻疯树胚乳I型核糖体失活蛋白。从麻疯树基因组中克隆得到其5＇侧翼区0.6 kb长的片段,将该片段插入pBI121载体置换其中的CaMV 35S启动子并在相应的转基因烟草中检测报告基因GUS的表达情况。经过GUS活性检测分析发现,该0.6 kb长的片段能够启动报告基因在种子中的表达,并且其在种子不同发育阶段的表达活性存在差异。同时,GUS组织化学染色定位分析表明,在双子叶植物中该启动子片段是胚乳特异性表达的,它从心形胚时期开始持续地在烟草的胚乳中发挥启动活性。     

麻疯树curcin 启动子的分离及其在转基因烟草中的功能分析

核糖体失活蛋白是一类可以使核糖体28S rRNA的保守a茎环结构域脱嘌呤的蛋白质。麻疯树毒蛋白(curcin)前体基因编码麻疯树胚乳I 型核糖体失活蛋白。从麻疯树基因组中克隆得到其5'侧翼区0.6 kb长的片段, 将该片段插入pBI121载体置换其中的CaMV 35S启动子并在相应的转基因烟草中检测报告基因GUS的表达情况。经过GUS活性检测分析发现, 该0.6 kb长的片段能够启动报告基因在种子中的表达, 并且其在种子不同发育阶段的表达活性存在差异。同时, GUS组织化学染色定位分析表明, 在双子叶植物中该启动子片段是胚乳特异性表达的, 它从心形胚时期开始持续地在烟草的胚乳中发挥启动活性。     

麻疯树的二萜成分

从麻疯树（Jatropha curcas L.)的根中分离得到3个二萜,鉴定为麻疯树酚酮A（iatropholone A)。麻疯树酚酮B（jatropholone B)和一个新的二萜,其结构推定为16－羟基麻疯树酚酮（16-hydroxyjatropholonc),定名麻疯树醇（jatrophol),同时还得到麻疯素（jatrophin),β-谷甾醇－β-D－葡萄糖甙（β－D－glucoside-β-sitosterol),tomentin,蒲公英脑（taraxerol)以及β-谷甾醇。     

重金属铜、锌、镉复合胁迫对麻疯树幼苗生理生化的影响

该研究以Cu~(2+)、Zn~(2+)、Cd~(2+)单一胁迫为对照,探讨不同浓度的Cu~(2+)、Zn~(2+)、Cd~(2+)复合胁迫对麻疯树幼苗生理生化指标的影响。结果表明:随着Cu~(2+)、Zn~(2+)、Cd~(2+)浓度的增加,麻疯树幼苗叶片中的蛋白质(Pro)、丙二醛(MDA)含量均逐渐增加,其叶片叶绿素含量随着Zn~(2+)胁迫浓度的增加呈现出先降后升的趋势,在中等浓度(100 mg·L-1)的Zn~(2+)胁迫时含量最低、随着Cu~(2+)胁迫浓度的增加叶绿素含量先升高后降低,在Cu~(2+)浓度为200 mg·L-1时含量最高,达到1 200 mg·g-1FW; Cd~(2+)胁迫对叶绿素含量和根系活力无明显影响。根系活力在Zn~(2+)浓度为100 mg·L~(-1)时最强,随着Cu~(2+)浓度的增加而减弱。低浓度的Cu~(2+)、Zn~(2+)、Cd~(2+)对过氧化物酶活性和可溶性糖含量都具有促进作用。Cu~(2+)、Zn~(2+)、Cd~(2+)复合胁迫时对可溶性蛋白、叶绿素和丙二醛含量均无明显影响,随着复合胁迫时浓度的增加,可溶性糖含量和根系活力先增后减。这表明麻疯树对三种重金属的胁迫具有一定的抗性,过高浓度的胁迫会影响麻疯树幼苗生理生化的一些指标,但是麻疯树可以通过自身的防御系统使伤害降到最小。此外,重金属复合胁迫可以在一定程度上减轻单一胁迫对麻疯树幼苗造成的毒害作用。     

土壤含水量对麻疯树幼苗生长及其生理生化特征的影响

以麻疯树(Jatropha curcas L.)1年生盆栽幼苗为材料,通过设置3个土壤水分(分别为80%、50%和30%田间持水量(FC))处理,研究土壤含水量对麻疯树幼苗生长及生理生化指标的影响,探讨麻疯树的水分适应性。结果表明:随土壤含水量的降低,麻疯树的株高、生物量等均呈下降趋势,根重比、根冠比和比叶面积无显著变化;蒸腾速率和气孔导度显著降低,净光合速率和PSII的光能转换效率无明显变化;叶片色素含量显著升高。在80%FC下,丙二醛和过氧化氢含量、可溶性糖和游离脯氨酸含量、超氧化物歧化酶活性和抗坏血酸含量均呈现最大值。在本实验条件下:麻疯树作为一种抗旱性较强的树种,30%FC没有对其造成干旱胁迫;而从生理生化代谢方面看,80%FC不能为麻疯树生长提供最适宜的条件,主要体现在体内自由基积累、膜脂过氧化程度加重以及叶绿体色素含量的降低,但体内抗氧化防御系统的积极防御和渗透调节物质含量的增加缓解了水分过多对麻疯树造成的伤害,从而没有对净光合速率造成影响。因此,在当地土壤养分状况下,以30%-50%FC的土壤含水量栽培,更有利于麻疯树的生长。     

麻疯树的二萜成分

从麻疯树（Jatropha curcas L.)的根中分离得到3个二萜,鉴定为麻疯树酚酮A（iatropholone A)。麻疯树酚酮B（jatropholone B)和一个新的二萜,其结构推定为16－羟基麻疯树酚酮（16-hydroxyjatropholonc),定名麻疯树醇（jatrophol),同时还得到麻疯素（jatrophin),β-谷甾醇－β-D－葡萄糖甙（β－D－glucoside-β-sitosterol),tomentin,蒲公英脑（taraxerol)以及β-谷甾醇。     

麻疯树种子发育过程中JcOle14.3和JcOle16.6基因的表达模式研究

油质蛋白基因对种子中油体的形成至关重要,该研究通过实时荧光定量PCR,对麻疯树的两个油质蛋白基因JcOle14.3和JcOle16.6在种子不同发育时期的表达模式进行了分析。结果表明:两个基因在种子发育初期(10~30 d)表达量逐渐升高,但表达水平均较低;40 d时表达量急剧增加并达到最高,而种子发育后期(50~55 d)两个基因表达水平均逐渐降低。由此可初步推测,JcOle14.3和JcOle16.6基因的表达量可能与种子油脂积累量存在正相关。该研究结果为麻疯树油体形成机理和油质蛋白的深入研究提供了理论基础。     

能源植物麻疯树分子育种研究进展

麻疯树作为一种重要的能源植物,虽然在常规育种方面的研究比较多,但在分子育种上仍处于起步阶段。在详细综述了国内外能源植物麻疯树基因的克隆,组织培养再生体系的建立相关研究进展的基础上,重点介绍了农杆菌介导转化法、基因枪介导转化法和纳米载体转化法等几种新技术在麻疯树育种中的应用,提出了当前麻疯树分子育种中存在的问题,并对其前景进行了展望。