油菜BnMKK2基因的克隆及表达分析

通过实验从陇油6号油菜中克隆得到了一种新的MAPK激酶基因BnMKK2基因的cDNA,全长1 344 bp,其中包括5′非翻译区（5′UTR）111 bp,3′非翻译区（3′UTR）165 bp,开放阅读框（ORF）长1 068 bp,编码355个氨基酸,该基因编码的蛋白质分子量为39.3 kDa,理论等电点为6.8。与拟南芥AtMKK2有很高的同源性,因此命名为BnMKK2(GenBank登录号:HQ848661)。该基因实时荧光定量PCR分析表明,BnMKK2基因的表达受低温胁迫诱导。     

油菜BnMKK4全长基因的克隆及表达分析

从‘陇油6号’油菜中克隆得到了一个新的BnMKK4基因的cDNA,全长1317bp,其中包括993bp的开放阅读框,159bp的5’非翻译区（5^1UTR）,165bp的3。非翻译区（3’UTR）。与拟南芥AtMKK4有很高的同源性,因此命名为BnMKK4（GenBank登录号JF268686）。该基因编码330个氨基酸的蛋白质,分子量36．5kDa,等电点为9．01。实时荧光定量PCR结果显示该基因表达受低温胁迫和盐胁迫的诱导,表明该基因在油菜适应低温胁迫和盐胁迫的过程中发挥作用。     

高山离子芥CbMAPK3基因功能分析

将高山离子芥丝裂原活化蛋白（MAP）激酶基因CbMAPK3编码区连接到表达载体pET-30a中,转化大肠杆菌JJ001（srlzTn10）,在1mol·L-1山梨醇的渗透胁迫及IPTG的诱导下,转化pET-30a—CbMAPK3的大肠杆菌JJ001（srl：Tn10）生长情况比转化pET-30a的好。免疫分析表明,在0℃下处理时,高山离子芥CbMAPK3激酶蛋白质水平没有明显的变化;在4℃处理下,高山离子芥CbMAPK3激酶蛋白质水平在处理前3h明显增加,并在3h后达到最高值。高山离子芥CbMAPK3在响应环境胁迫的过程中起作用。     

油菜BnHMGB2基因的克隆及表达分析

通过RACE技术从陇油6号油菜中克隆得到了一种新的BnHMGB2基因的cDNA,全长823 bp,其中包括438 bp的开放阅读框,131 bp的5′非翻译区（5′UTR）,253 bp的3′非翻译区（3′UTR）。与拟南芥AtHMGB2的同源性达到了87.4%,因此命名为BnHMGB2(GenBank登录号：JN807314)。该基因编码145个氨基酸的蛋白质,分子量15.9 KDa,等电点为5.63。实时荧光定量PCR结果表明该基因在油菜根、茎、叶、下胚轴均有表达,根中表达量最高。同时,该基因的表达受低温胁迫的诱导,表明该基因在油菜适应低温胁迫的过程中发挥作用。     

二色补血草硫氧还蛋白(Trx)的克隆和表达分析

从二色补血草cDNA文库中分离出1个硫氧还蛋白基因全长cDNA序列。基因全长1138bp,其中,5’非翻译（UTR）区128bp,3＇非翻译区212bp,开放阅读框（ORF）全长798bp,编码265个氨基酸,编码蛋白的分子量为28．58kDa,理论等电点（pI）为9．68。BlastP分析表明二色补血草Trx与拟南芥Trx序列同源性为52％,与葡萄7h序列同源性为76％,从11个物种的氨基酸多序列比对可以看出Trx氨基酸序列保守性较高。实时定量RT-PCR方法检测低温、NaCl和PEG胁迫不同时间后的基因在二色补血草中表达模式的结果表明,NaCl能诱导Trx基因在二色补血草叶中表达,胁迫24h后达到高峰,而聚乙二醇和低温处理则抑制Trx在二色补血草根和叶的表达。     

西伯利亚蓼中PsMnSOD基因的克隆及其抗逆性检测

采用RACE技术从西伯利亚蓼中克隆了锰超氧化物歧化酶基因PsMnSOD的cDNA（GenBank登录号FJ848572）。长为792bp的PsMnSODcDNA序列含有编码234个氨基酸的705bp的开放读码框、57bp的5＇非翻译区和30bp的3＇非翻译区。构建了PsMnSOD基因的酵母表达载体pYES2-PsMnSOD并将其转化到野生型酵母菌株中。分析PsMnSOD基因在酵母中的表达对酵母SOD酶活性的影响及其对盐胁迫、PEG胁迫、高温和低温胁迫下抗逆性影响的结果表明,PsMnSOD基因在酵母中表达后酵母SOD酶活性提高,酵母对盐渍、PEG、高温和低温等非生物胁迫的抗逆性也增强。     

西伯利亚蓼钙调蛋白基因的克隆及其在盐胁迫下的表达

已从西伯利亚蓼叶中cDNA文库中获得的钙调蛋白EST序列,采用cDNA末端快速扩增（RACE）技术克隆了具有完整编码区的钙调蛋白基因的cDNA序列（GenBank登录号GQ988382）,命名为PsCaM。该基因全长615bp,编码区为450bp,编码149个氨基酸,5＇非翻译区为63bp,3＇非翻译区为102bp。同源性分析表明,该蛋白与其他植物钙调蛋白高度保守,氨基酸同源性高达98%。用实时荧光定量PCR研究3%NaHCO3胁迫下西伯利亚蓼基因表达的结果显示,自然条件下,该基因在叶中表达量最高,地下茎次之,茎中最低;盐胁迫下CaM在西伯利亚蓼的地下茎、茎和叶中均有表达,表达模式不同。     

3株肠道病毒71型毒株的全基因组序列分析

目的：对获得的3株肠道病毒71（EV71）型毒株进行全基因组序列测定,并对其进化特点及分型进行初步分析。方法：提取病毒RNA,反转录得到eDNA,PCR分段扩增覆盖病毒全长序列的6个重叠片段（不包括多聚腺苷酸尾）;用软件将3株EV71的备片段序列进行拼接、编辑和校正,随后进行氨基酸翻译及序列比较;用MEGA4.1软件构建系统进化树。结果：获得了3株EV71的全长序列：GDV103株基因组全长7404 nt,包括741bp的5’端非编码区（UTR）、6582bp的病毒基因组编码区（ORF）及81bp的3’UTR;安徽株（Anhui2007）基因组全长7405nt,包括742bp的5＇UTR、6582bp的ORF及81bp的3＇UTR;VR1432株基因组全长7408nt,包括743bp的5’UTR、6582bp的ORF及83bp的3’UTR长。经同源性比对和进化树分析,证实GDV103和安徽株EV71属于C基因型的C4基因亚型。而VR1432株则属于C基因型的C2基因亚型。结论：获得了3株EV71的全长基因组序列,并进一步探讨了其型别,为下一步的干扰素保护宴,哈重定了基础．     

小麦富含亮氨酸重复（LRR）蛋白基因TaLRI1的克隆及其特征分析

在水分胁迫反应基因表达谱分析的基础上,采用RACR技术,从‘洛旱2号’小麦中克隆了一个编码富含亮氨酸蛋白的cDNA全长,命名为TaLRI1。序列分析显示,TaLRI1的cDNA全长为2657bp（GenBank登录号为GU593320）,其中5＇-非翻译区47bp,3＇-非翻译区1314bp,开放阅读框1296bp,可编码431个氨基酸。进一步分析显示,TaLRI1基因编码的蛋白具有典型的富含亮氨酸N末端保守域和富含亮氨酸的核酸酶抑制因子保守域,该蛋白为弱酸性蛋白,等电点为5.69,无明显的疏水/亲水区域。三维结构预测显示,TaLRI1蛋白以α-螺旋、β-折叠和无规卷曲为骨架,可形成弧状的螺线管结构以及一对侧臂凸起。RT-PCR分析表明,水分胁迫过程中,TaLRI1基因在根系中的表达量呈先升高后降低的趋势,以胁迫处理12h的表达量最高,推测该基因在水分胁迫反应过程中发挥重要功能。     

水稻(Oryza sativa L.)苹果酸酶(OsNADP-ME3)基因在逆境下的表达特性研究

水稻苹果酸酶（NADP-ME）是多基因家族,由3个胞质型NADP-ME和1个质体型NADP-ME构成。本研究针对水稻胞质型成员（命名为NADP-ME3）（NM₀01061367）进行初步的功能解析。克隆获得的NADP-ME3基因的cDNA序列全长为2240bp,其中5’非翻译区为151bp,3’非翻译区为376bp,开放读码框（ORF）长1713bp,编码570个氨基酸。为研究NADP-ME3在逆境胁迫下的表达量变化,Northern blot检测结果显示,在NaCl、NaHCO3和PEG胁迫条件下,NADP-ME3随胁迫处理时间的不同表达量呈现不同程度的变化,推断NADP-ME3可能与非生物胁迫有应答关系,将NADP-ME3转入拟南芥中并通过观察转基因拟南芥在非生物胁迫下表型变化,发现NADP-ME3能够在一定程度上提高植物对非生物胁迫的耐受性。     

漾濞大泡核桃WRKY转录因子基因JsWRKY1的克隆及表达特性分析

WRKY转录因子普遍存在于植物体内,在植物的抗病防御反应中起重要作用。本实验基于漾濞大泡核桃（Juglans sigillata）中编码WRKY转录因子的EST序列设计引物,采用快速扩增cDNA末端技术,克隆得到一个新的脓Ky基因的全长cDNA序列,命名为JsWRKY1（KJ170895）。JsWRKY1的cDNA全长为1012bp,含有564bp的开放阅读框,154bp 5’-非翻译区以及294bp的3＇-非翻译区,编码具有187个氨基酸的蛋白质。JsWRKY1编码的氨基酸序列与已知植物WRKY家族成员间的同源性和聚类分析表明JsWRKY1与来源于可可树（Theobroma cacao）和大豆（Glycinemax）中的wRKY相似性较高,属于IIc类wRKY。qRT-PCR分析结果显示,信号分子水杨酸、茉莉酸、H2O2和乙烯处理可以不同程度地诱导漾濞大泡核桃叶片中JsWRKY1的表达。此外,接种胶孢炭疽菌后JsWRKY1的表达量迅速上升,在接种后4h时达到最高水平,之后表达量逐渐下降,暗示JsWRKY1参与漾濞大泡核桃抗胶孢炭疽菌的防卫反应。     

粘虫核糖体蛋白S7cDNA的克隆和表达分析

运用RT—PCR和RACE技术克隆了粘虫Mythimnaseparata（Walker）核糖体蛋白s7基因（RPS7）的全长eDNA序列（GenBank登录号：JN582331）,并对其进行生物信息学分析。结果表明,粘虫RPS7全长eDNA序列为762bp,包括5’非编码区32bp和3’非编码区67bp。其开放阅读框（573bp）编码190氨基酸肽链,具有核糖蛋白S7e蛋白家族典型特征。该肽链理论分子量为21．924ku,等电点为9．82,富含4种类型的特定功能位点。该蛋白序列与其他动物RPS蛋白序列具有96．8％-98．2％高度同源性。应用荧光实时定量技术建立了粘虫脑部胚后发育RPS7表达模式。RPS7表达量随胚后发育脑部重建呈现出动态变化,这一结果显示RPS7是在转录水平上呈现发育性调节。     

粘虫β-actin基因cDNA的克隆、序列分析及表达量检测

β-actin基因作为actin家族的一员,在基因定量实验中常用作内参基因。本实验运用RT-PCR和RACE技术,以粘虫Mythimna separata(Walker)cDNA为模板,对β-actin基因进行克隆获得全长cDNA序列,并利用生物信息学方法,对β-actin基因全长cDNA序列及推测得到的β-actin蛋白序列进行分析。结果表明,获得的粘虫核β-actin基因cDNA序列长度为1 472 bp,其中包括68 bp的5′非编码区、273 bp的3′非编码区和1 131 bp的开放阅读框,编码一个376个氨基酸蛋白,具有actin蛋白家族典型特征。推测得到的粘虫β-actin蛋白理论分子量为41.7497 ku,等电点为5.29,富含6种类型的特定功能位点。该蛋白序列与其他动物β-actin蛋白序列具有97.9%～99.7%高度同源性。β-actin表达量检测结果显示β-actin在6种不同组织间表达无显著差异(P>0.05),表明β-actin可作为研究粘虫不同基因表达水平高低的可靠内参基因。该基因的cDNA序列已经递交GenBank并获得登录号为GQ856238。     

漾濞大泡核桃病程相关蛋白10基因JsPR10-1的克隆与表达分析

病程相关蛋白（pathogenesis related protein, PR） 10的激活与积累在植物抗逆境胁迫中有非常重要的作用。根据漾濞大泡核桃（Juglans sigillata）编码PR10的EST（expressed sequence tag）序列设计引物,利用快速扩增cDNA末端技术,克隆得到PR10基因的全长cDNA序列,并命名为JsPR10-1。JsPR10-1全长cDNA为776 bp,含有483 bp的开放阅读框、74 bp 5′-非编码区以及219 bp 3′-非编码区,编码含有160个氨基酸的蛋白质。全长基因序列中含有1个124 bp的内含子。JsPR10-1编码的蛋白质与栎树（Quercus suber）、欧洲山毛榉（Fagus sylvatica）以及欧洲板栗（Castanea sativa）的PR10相似性较高,并且在PR10的系统进化树中与双子叶植物聚为一支。qRT-PCR分析结果表明,植物信号分子水杨酸、茉莉酸、乙烯以及过氧化氢处理均可诱导JsPR10-1表达。在接种胶孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）后,JsPR10-1的表达量迅速上升并在接种8 h时达到最大值,表明JsPR10-1参与漾濞大泡核桃对胶孢炭疽菌的防卫反应。本研究为揭示漾濞大泡核桃抗性机制奠定了理论依据。     

苎麻小分子G蛋白Racl基因的克隆及表达分析

植物Rac是植物中特有的小分子G蛋白,我们从苎麻转录组中获得一个小分子G蛋白基因eDNA,．5部分序列,设计引物后采用RT-PCR结合RACE技术克隆了该基因的cDNA。序列分析表明,所克隆的RaclcDNA全长为l043bp,包括594bp开放阅读框、214bp的3’端非编码区和235bp的5’端非编码区,能编码一个197氨基酸的推导蛋白。该蛋白包含G蛋白典型的效应因子结合位点、GTP／GDP结合位点和碱性氨基酸区,c末端具有保守的异戊烯基化位,CSIL。采用半定量RT-PCR分析了该基因在5个苎麻品种及不同组织器官中的表达情况,结果表明Racl基因在苎麻根、茎、叶中均有表达,其中在叶中的表达量最高。纤维木质素含量不同的品种中,Racl基因的表达量存在明显差异。木质素含量高的品种具有较高的Racl基因表达,表明该基因可能在苎麻木质素合成过程中发挥作用。     

岷江百合类萌发素蛋白基因LrGLP2的克隆及表达特性分析

类萌发素蛋白是植物中普遍存在的一类可溶性糖蛋白,在植物抗逆胁迫中起着重要作用。依据岷江百合编码GLP的EST序列设计引物,采用快速扩增cDNA末端技术,从岷江百合犯ilium regale Wilson）克隆得到一个新的GLＰt基因的全长eDNA序列,命名为LrGLP2。LrGLP2全长cDNA为921bp,含有654bp的开放阅读框,49bp5’非编码区以及218bp3’UTR,编码217个氨基酸的蛋白质。LrGLP2编码蛋白质与已知植物GLPs家族成员间的同源性和聚类分析表明LrGLP2与来源于水稻（Oryza sativa）、节节麦似egilopstauschii）、葡萄（Vitis vinifera）中的GLPs具有较高的相似性。qRT-PCR分析显示,LrGLP2在岷江百合正常生长发育的根中有一定量的表达,而在茎和叶中几乎检测不到表达量。水杨酸、茉莉酸以及H202处理均不同程度抑制LrGLP2的转录水平,但乙烯处理能明显诱导LrGLP2的表达。此外,岷江百合接种尖孢镰刀菌（Fusari—umoxysporumfsp．tiliO后,LrGLP2在接种后2h表达迅速上调,12h表达量急剧上升,至24h表达量达到最大值,之后表达量下降,可见￡rGLP2参与岷江百合对尖孢镰刀菌的防卫反应。     

日本蟳高血糖激素基因的克隆与表达分析

通过RACE技术克隆获得日本蟳Charybdis japonica高血糖激素基因（CjCHH）全长cDNA序列;运用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）方法分析该基因的组织差异性表达;利用原核表达技术获得CjCHH重组蛋白。序列分析表明：CjCHH cDNA全长1754 bp,包含111bp的5’末端非编码区（UTR）,423 bp的开放阅读框（ORF）,以及1236 bp的3’UTR,该基因可编码140个氨基酸。序列比对结果显示：CjCHH的成熟肽序列与其它甲壳动物CHH的一致性为41%~88%。系统进化树显示：CjCHH与其它梭子蟹科的CHH聚在一起,这与日本蟳所处的分类地位一致。组织差异性表达研究显示：CjCHH在检测的10个组织中均有表达,其中眼柄中表达量最高,肠和Y-器次之,其余组织表达量较低。成功构建了CjCHH重组表达质粒pET-CHH,并在大肠杆菌（Escherichia coli）中获得了高效表达,重组蛋白的相对分子量约11 kDa,与预测的相对分子质量大小相一致,表达水平在5 h的IPTG诱导过程中呈现上升趋势。     

棉铃虫活化的蛋白激酶C受体1(RACK1)基因的分子鉴定

活化的蛋白激酶C受体l(receptor for activated C kinase1,RACKl)广泛分布于真核生物和原核生物中,在生物体内具有极其重要的调节功能。本实验利用RT-PCR和RACE的方法扩增获得了棉铃虫Helicoverpa armigera (Hübner)RACK1基因全序列,序列分析结果表明,该基因开放阅读框为957bp,编码319个氨基酸残基。5'端非编码区长为36bp,3'端非编码区长为112bp。发育时相表达发现RACK1基因在棉铃虫的蜕皮时期大量表达,进一步的激素处理实验发现,蜕皮激素诱导RACK1基因表达,保幼激素和饥饿抑制RACK1基因表达。这些研究结果为进一步研究RACK1基因的功能奠定基础。