高山离子芥CbMAPK3基因克隆与原核表达

促分裂原活化蛋白激酶（MAPK）在信号传导过程中发挥着重要的作用。以高山离子芥叶片为材料,利用RT-PCR法克隆到全长CbMAPK3基因cDNA,将其与大肠杆菌表达载体pET-30a连接,构建原核表达载体pET-30a-CbMAPK3,并转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达后,SDS-PAGE以及Western blot检测结果表明该基因表达了1个约46kD的蛋白,为进一步研究目的蛋白的结构和功能提供了实验基础。     

高山离子芥MAP激酶基因CbMAPK3的克隆

从高山离子芥中克隆得到了一种新的MAPK基因的cDNACbMAPK3,全长1419bp,其中包括1110bp的开放阅读框、91bp的5＇非翻译区（5＇UTR）和218bp的3＇非翻译区（3＇UTR）。CbMAPK3基因编码369个氨基酸的蛋白质,分子量为42.5kDa,等电点为5.79,含有MAP激酶所具有的11个保守序列区以及MAP激酶的磷酸化位点TEY基序。CbMAPK3蛋白与响应环境胁迫有关的植物MAPK亚类有很高的同源性。半定量分析表明,该基因表达受低温胁迫诱导。     

高山离子芥铁转运蛋白基因编码序列的克隆及其抗逆性表达的实时定量分析

铁转运蛋白 (iron transport protein,IRT)是具有跨膜运输离子功能的特殊蛋白质,属于金属离子转运家族的成员．本研究运用RACE方法从高山离子芥（Chorispora bungeana）中克隆得到完整的铁转运蛋白cDNA,命名为CbIRT（基因登录号为EU330924）．该基因全长1 290 bp,包含1个1 035 bp的开放阅读框（ORF）,编码344个氨基酸的蛋白．系统进化树分析显示,该基因与拟南芥AtIRT1和遏蓝菜TcIRT-G的亲缘关系最近,同源性分别达到了87.4%和86.5%,而在氨基酸序列水平与拟南芥AtIRT1的同源性达到了89%,表明克隆得到的CbIRT属于金属离子转运体家族成员．实时荧光定量方法对高山离子芥CbIRT基因在不同温度和铁营养水平条件下的表达情况进行分析表明,CbIRT对零下低温和零上低温的表达水平呈截然不同的反应;正常铁营养状态下,CbIRT是微量表达的,而缺铁及低温处理都可以大幅度地促进该基因的表达,富铁可以抑制该基因的表达．显示了该蛋白在转运Fe离子方面的重要作用．     

H2S对干旱胁迫下高山离子芥的作用研究

以高山冰缘植物高山离子芥（Chorispora bungeana）试管苗为实验材料,研究了0.3 mol·L^-1甘露醇模拟干旱胁迫响应过程中硫化氢（H₂S）调节高山离子芥的膜系统损伤程度、渗透调节物质和抗氧化酶系的作用,以及磷脂酶D（PLD）、活性氧（ROS）与H₂S信号分子在高山离子芥中响应干旱胁迫中的作用和可能存在的信号关系。结果显示：干旱胁迫下,外施H₂S供体NaHS显著降低高山离子芥电解质渗漏率及MDA含量、抑制ROS产生,提高渗透调节物质和抗氧化水平,从而增强高山离子芥的抗旱能力;干旱可诱导PLD活性、H₂S含量、ROS发生显著变化;当分别外施PLD下游产物PA与ROS供体H₂O₂均可促进干旱胁迫下H₂S的释放,当同时外施PA和ROS抑制剂DPI时对干旱胁迫下H₂S含量没有显著影响,当同时外施PLD抑制剂正丁醇与ROS抑制剂DPI则显著抑制干旱胁迫下H₂S含量的产生,表明干旱胁迫下,高山离子芥中ROS位于PLD的下游、H₂S的上游发挥作用。     

一氧化氮参与调控油菜素内酯增强高山离子芥悬浮细胞抗寒性

为探究油菜素内酯(BRs)诱导提高植物的抗寒性是否受一氧化氮(NO)信号分子调控，以高山离子芥(Chorispora bungeana)悬浮细胞为材料，分别用24-表油菜素内酯(EBR)、NO供体SNP、NO清除剂PTIO、一氧化氮合成酶(NOS)抑制剂L-NAME、EBR+PTIO以及EBR+L-NAME进行处理，分析在低温胁迫下以上处理对细胞抗寒性、活性氧(ROS)水平以及抗氧化防御系统的影响。结果表明：(1)外源EBR处理可以缓解低温胁迫对悬浮细胞活力的抑制以及离子渗漏和膜脂过氧化程度的加剧，从而增强细胞对低温的抗逆能力。SNP处理对上述生理指标的影响与EBR类似。(2)在低温胁迫下，与EBR处理细胞相比，EBR+PTIO以及EBR+L-NAME处理会导致悬浮细胞活力下降，离子渗漏和膜脂过氧化程度显著升高，表明阻断NO信号会降低EBR诱导提高的抗寒性。(3)与仅受低温胁迫的细胞相比，外源EBR处理导致细胞NO含量和NOS活性进一步升高，而EBR诱导的NO积累可以被PTIO或L-NAME所抑制。(4)EBR、SNP处理均可以明显抑制低温胁迫下离子芥悬浮细胞过氧化氢(H_2<...     

高山离子芥CBF/DREB1转录因子基因的分离与表达

以冷胁迫和脱水处理的高山离子芥幼叶为材料,采用RT-PCR技术获得1条新的C重复/脱水应答元件结合因子(CBF/DREB1)基因(CbCBF,登录号AY994127).该基因含651 bp的开放阅读框(ORF),编码216个氨基酸的蛋白质,预测该蛋白具有一个AP2 DAN结合域,一个核定位信号和碳端酸性激活域.多序列比对结果表明,CbCBF蛋白与拟南芥及其他植物CBF具有较高的相似性.Northern杂交结果显示,CbCBF基因不能被冷处理诱导表达,但可被脱水和ABA处理快速诱导;同时发现CbCBF基因也能被紫外辐射和机械刺激诱导表达.表明高山离子芥CbCBF基因可能参与应答多种非生物胁迫过程.     

高山离子芥试管苗在PEG-6000模拟干旱条件下的生理响应

以高山离子芥(Chorispora bungeana)为试材,采用固液培养法,设置对照(不添加PEG-6000,CK)、5%PEG-6000、10%PEG-6000、20%PEG-6000、40%PEG-6000五个干旱处理水平,研究了不同浓度PEG-6000模拟干旱环境下,对高山离子芥幼苗生理生化特性的影响。结果表明:干旱胁迫下,随着不同的处理时间,脯氨酸含量始终保持上升的趋势且含量显著高于对照;可溶性蛋白的含量也有波动,呈现先上升后下降的趋势;丙二醛(MDA)含量,随着时间的延长,呈现先升高再下降的趋势且含量显著高于对照。幼苗叶片叶绿素总含量呈现先升高后下降的趋势,在浓度为40%PEG-6000胁迫下,叶绿素总含量均显著低于对照;叶绿素a则有显著降低的趋势;叶绿素b在浓度为5%PEG-6000胁迫下显著升高,在浓度为10%、20%、40%PEG-6000胁迫下也呈现显著升高的趋势;但其含量总体低于叶绿素a;Chla/Chlb的值经历了先升高后下降的趋势且均高于对照。在各浓度及不同时间处理胁迫下,高山离子芥叶片K+、Na+、Ca2+、Mg2+含量有明显波动:K+、Ca2在5%和10%PEG-6000胁迫6、12、24、48、72h后均显著高于对照,而40%PEG-6000胁迫后均显著低于对照。Na+在5%PEG-6000各时间段胁迫后含量较对照有所增加,在其它浓度和时间处理下其含量均低于对照;而Mg2+含量在40%PEG-6000胁迫下虽有下降趋势但均显著高于对照。表明在干旱胁迫下,高山离子芥通过改变渗透调节物、光合系统中叶绿素含量及离子含量等,启动应对外界干旱环境的耐旱响应机制,从生理角度揭示了高山离子芥响应耐旱的生理生态机理。     

干旱胁迫对高山离子芥试管苗抗氧化系统及其活性氧代谢的影响

该试验以高山离子芥试管苗(Chorispora bungeana)为试材,采用固液培养法,设置对照(不添加PEG-6000,CK),轻度干旱胁迫(5%PEG-6000)、中度干旱胁迫(20%PEG-6000)、重度干旱胁迫(40%PEG-6000)4个干旱处理水平,分析干旱胁迫对高山离子芥幼苗抗氧化系统、活性氧代谢等部分生理特征的影响,以揭示高山离子芥在干旱胁迫下的生理响应特征,为进一步探讨其对干旱环境的适应机制奠定基础。结果显示:(1)随着干旱胁迫程度的增加以及在各时间胁迫处理下,抗氧化酶SOD活性及可溶性糖含量显著升高,POD活性、丙二醛含量、CAT活性和APX活性均经历了先升后降的过程。(2)超氧阴离子(O-·2)的产生速率和过氧化氢(H2O2)的含量均显著升高;高山离子芥试管苗叶片相对电导率呈现出升-降-升的变化趋势。(3)相关分析结果显示,MDA与相对电导率、可溶性糖、SOD、APX、O-·2及H2O2呈极显著正相关关系,可溶性糖与SOD、POD、O-·2及H2O2呈极显著正相关关系;相对电导率以及保护酶系均与O-·2、H2O2呈极显著正相关关系。研究表明,高山离子芥具有较强的耐旱性,高山离子芥试管苗在响应干旱胁迫过程中,抗氧化酶系、活性氧代谢、脂质过氧化及渗透调节物等共同参与了高山离子芥试管苗对干旱胁迫的综合抗逆性形成,从而积极启动应对外界干旱环境的耐旱响应机制。     

大蒜芥属一新变种

发表了大蒜芥属一新变种,无毛全叶大蒜芥(Sisymbrium luteum (Maxim.)O. E. Schulz var. glabrum F. Z. Li et Z. Y. Sun.)。     

新疆无苞芥锌指蛋白基因的克隆及表达分析

利用同源克隆法从新疆无苞芥中克隆获得1个锌指蛋白基因(OpZFP)。序列分析表明,OpZFP基因的开放阅读框为684bp,推测编码含227个氨基酸的蛋白质。生物信息学分析显示,OpZFP蛋白含有1个典型的C2H2型锌指结构,在C端含有一个可能具有转录抑制功能的EAR结构域。系统进化树分析表明OpZFP编码产物与拟南芥AtZFP1、琴叶拟南芥AlZFP1的进化关系较近。分离了OpZFP基因2 095bp的启动子序列,发现该启动子与拟南芥AtZFP1基因的启动子序列只有84.4%的相似性,启动子分析表明二者存在多处不同的顺式作用元件。半定量RT-PCR分析表明,OpZFP在根、茎、叶、花和果荚中均有表达,在根中的表达量最高。OpZFP基因受高盐、干旱和低温等胁迫的诱导表达,表明该蛋白涉及多种胁迫相关的信号传导途径。     

Inhibition of glutathione synthesis decreases chilling tolerance in Chorispora bungeana callus

The possible roles of reduced glutathione (GSH) in chilling tolerance were studied in callus generated from a representative alpine plant, Chorispora bungeana Fisch. & C.A. Mey (C. bungeana). The callus grew well under low-temperature and chilling treatment led only to slight injury, as indicated by a low level of ion leakage (IL). Malondialdehyde measurements also were not elevated, however GSH was. Exogenously application of l-buthionine-(S R)-sulfoximine (BSO), an inhibitor of γ-glutamylcysteine synthetase (γ-ECS), arrested the GSH accumulation induced by chilling and resulted in a significant decrease in cell growth and an increase in IL and malondialdehyde. These results implied that C. bungeana is a plant with a strong low-temperature tolerance mechanism, and the tolerance of C. bungeana may be associated with GSH accumulation. Under chilling treatment, the proportion of unsaturated fatty acid in the plasma membrane (PM) increased significantly in callus of C. bungeana mainly due to increases in C18:2 and C18:3, the membrane fluidity (indicated by DPH fluorescent polarization) however was maintained. High PM H⁺-ATPase activities were also induced by chilling. Exogenously application of BSO blocked the effects of chilling treatments on the changes of fatty acids and PM H⁺-ATPase activities, reducing the PM membrane fluidity. On the other hand, simultaneous application of GSH and BSO to callus under chilling treatments reversed the effects of BSO on the changes of fatty acids, PM fluidity and PM H⁺-ATPase activities. These results suggested that GSH induced by low-temperature treatments may confer chilling tolerance to C. bungeana, probably by increasing unsaturated fatty acid compositions and maintaining PM fluidity and high enzymatic activity.     

GFP基因转化藿香的研究

以藿香无菌苗幼嫩茎段为受体,利用根癌农杆菌介导法进行了绿色荧光蛋白基因(GFP)的遗传转化研究。经农杆菌侵染,通过共培养、选择培养后获得其抗性愈伤组织,对抗性愈伤组织的诱导过程进行了GFP荧光检测。结果表明,GFP基因能在抗性愈伤组织中强烈表达,证明GFP基因能够在藿香遗传转化中得到应用。对抗性愈伤组织的PCR检测初步证实外源GFP基因已整合到藿香愈伤组织的基因组中。     

紫花苜蓿F-box蛋白基因MsFTL的克隆及功能分析

FTL(F-box Triple LRR protein)是F-box蛋白家族的成员,具有F-box保守结构域,在植物抵御逆境胁迫过程中起重要作用。本研究参考低温胁迫下紫花苜蓿转录组数据设计引物,通过RT-PCR克隆获得紫花苜蓿MsFTL基因,该基因的全长1422 bp,编码473个氨基酸。该蛋白含有1个F-box结构域及3个LRR重复。系统进化分析表明,MsFTL与蒺藜苜蓿XP_003626345.1 F-box/FBD/LRR-repeat protein亲缘关系最近。两者蛋白序列比对发现共有11个差异位点。在低温、盐、干旱以及外源ABA处理下,MsFTL基因受到诱导,表达量上调。构建植物过表达载体pCBM-MsFTL,通过农杆菌介导法转化烟草。对经过抗性筛选、PCR和Real-time PCR验证的转基因植株进行低温抗性鉴定。在-4℃低温胁迫下,野生型烟草叶片出现了明显的萎蔫失水现象,而转基因烟草萎蔫程度相对较轻。生理检测结果表明,4℃处理24 h之后,转基因烟草的可溶性蛋白含量、可溶性糖含量、SOD活性,CAT活性高于野生型,MDA含量低于野生型。本研究表明,MsFTL基因在提高植物对低温胁迫的抗性方面具有重要的作用。     

MADS-box基因家族基因重复及其功能的多样性

基因的重复(duplication)及其功能的多样性(diversification)为生物体新的形态进化提供了原材料。MADS-box基因在植物(特别是被子植物)的进化过程中发生了大规模的基因重复事件而形成一个多基因家族。MADS-box基因家族的不同成员在植物生长发育过程中起着非常重要的作用,在调控开花时间、决定花分生组织和花器官特征以及调控根、叶、胚珠及果实的发育中起着广泛的作用。探讨MADS-box基因家族的进化历史有助于深入了解基因重复及随后其功能分化的过程和机制。本文综述了MADS-box基因家族基因重复及其功能分化式样的研究进展。     

Regulation of the plasma membrane during exposure to low temperatures in suspension-cultured cells from a cryophyte (Chorispora bungeana)

Summary. As the outermost boundary of the cell, the plasma membrane plays an important role in determining the stress resistance of organisms. To test this concept in a cryophyte, we analyzed alterations of several components in plasma membranes isolated from suspension-cultured cells of Chorispora bungeana Fisch. & C.A. Mey in response to treatment at 0 and −4 °C for 192 h. When compared with the controls growing at 25 °C, both the membrane permeability and fluidity showed recovery after the initial impairment. Linolenic acid and membrane lipid unsaturation increased by about 0.8-fold following cold treatments, although the kinetics of the increase varied with the temperatures examined. During the treatments, the plasma membrane H⁺-ATPase (EC 3.6.1.3) activity increased by 78.06% at 0 °C and 100.47% at −4 °C. However, the plasma membrane NADH oxidase (EC 1.6.99.3) activity only decreased when exposed to a lower temperature (−4 °C), and remained at 63.93% after being treated for 192 h. After the treatments, the physical properties of the plasma membranes of suspension-cultured cells, especially the −4 °C treated cells, were similar to those in the wild plants. These findings indicate that the specific mechanism of cold resistance of C. bungeana is tightly linked with the rapid and flexible regulation of membrane lipids and membrane-associated enzymes, which ensure the structural and functional integrity of the plasma membrane that is essential for withstanding low temperature. Correspondence: Lizhe An, Cold and Arid Regions Environmental and Engineering Research Institute, Chinese Academy of Sciences, Lanzhou 730000, People’s Republic of China.