盐胁迫下盐角草 Na ＋／H ＋转运基因表达分析

Na＋/H＋逆向转运蛋白具有调节细胞内离子浓度及维持pH值稳定的作用,是植物抵御盐胁迫的重要因子。从盐角草RNA-Seq数据中筛选Na＋/H＋逆向转运蛋白序列,利用生物信息学手段,拼接得到5条Na＋/H＋逆向转运蛋白完整cDNA序列,通过与NCBI已有序列比对分析,将其命名为SeNHX1、SeNHX3、SeNHX4、SeNHX5和SeN-haD。考察盐角草Na＋/H＋逆向转运蛋白在两种盐分变化情况下的表达变化：1）从无盐处理转移到200 mM NaCl处理;2）从200 mM NaCl培养基转移到无盐培养基。结果表明：SeNHX4的表达量非常低,在地下部几乎检测不到;SeNhaD在地上部的表达量是地下部的2倍左右,说明NhaD主要在盐角草地上部发挥作用;SeNHX1、SeNHX3和SeNHX5的表达量明显高于其他两个基因,对盐角草的耐盐机制起到更大的作用,并且SeNHX1和SeNHX5受盐分诱导表达,表达量与盐浓度呈正相关,可能在盐角草耐盐调控网络中发挥重要作用。综上,NHX基因家族和NhaD的表达量受到基质中盐分的调控作用,其表达在盐分处理或者盐分去除1～3d后发生变化。研究结果有助于阐明盐角草NHX基因家族和NhaD对盐分的响应特点。     

菊芋Na+/H+逆向转运蛋白基因的克隆与表达分析

根据同源序列设计简并引物,通过RT-PCR及RACE的方法从菊芋中克隆了Na /H 逆向转运蛋白基因。序列分析表明,该基因全长2148 bp,开放读码框为1647 bp,可编码长549个氨基酸的多肽,与其它植物已克隆的Na /H 逆向转运蛋白具有很高的同源性。系统发育分析表明该蛋白(HtNHX1)与液泡型Na /H 逆向转运蛋白的亲缘关系较近,与质膜型Na /H 逆向转运蛋白亲缘关系较远。NaCl胁迫条件下RT-PCR检测结果表明,HtNHX1随NaCl浓度增加和处理时间延长表达持续增强,但到了第3天表达量开始下降。HtNHX1逆向转运蛋白基因的转录调控可能是决定菊芋耐盐能力的一个重要因素。     

长叶红砂液泡膜Na~+/H~+逆向转运蛋白基因的克隆及表达特性

为研究长叶红砂(Reaumuria trigyna)离子转运分子机制,利用RT-PCR和RACE技术,克隆到其液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白基因(NHX1)的全长cDNA片段,命名为RtNHX1(NCBI序列号为KR919802)。结果表明:RtNHX1的cDNA片段全长2 622bp,开放阅读框1 662bp,5′非编码区509bp,3′非编码区451bp,编码553个氨基酸,推测分子量为60.91kD。该蛋白含有12个跨膜结构域,为疏水蛋白,与其他植物液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白NHX1的亲缘关系较近。实时荧光定量PCR对其在NaCl胁迫下的表达检测显示,不同时间和不同浓度NaCl胁迫下,RtNHX1表达量变化均呈先升高后降低趋势,在100mmol/L NaCl胁迫6h和200mmol/L NaCl胁迫后达到最高,表达量分别超过或约是对照的3倍,一定程度反应出RtNHX1参与长叶红砂的盐胁迫应答,是该植物离子转运体系的重要元件。     

花烟草NaNHX1基因的克隆及其在非生物胁迫下的表达模式

植物NHX家族基因,在植物的生长发育以及生物与非生物胁迫的应答反应中发挥着十分重要的作用。为了探究花烟草Na+/H+逆向转运蛋白的生理功能,为花烟草耐盐分子机制的研究提供参考。采用同源克隆的方法进行基因克隆,对花烟草进行非生物胁迫,并运用qPCR的方法进行基因表达模式分析。结果表明,从花烟草(Nicotiana alata)中克隆了一个属于Na+/H+逆向转运蛋白家族的基因NaNHX1。该基因的开放阅读框全长为1 599 bp,编码了532个氨基酸残基。生物信息学分析结果表明,该基因编码的蛋白分子量为58.4 kD,等电点为5.66;具有Na+/H+逆向转运蛋白家族典型的保守结构域NhaP2;该蛋白属于疏水性蛋白,包含10个跨膜区。NaNHX1基因主要定位于细胞质膜,并含有多个磷酸化位点。同源性分析的结果显示,NaNHX1基因与美花烟草(Nicotiana sylvestris)、茸毛烟草(Nicotiana tomentosiformis)以及番茄(Solanum lycoperisicum)NHX基因的亲缘关系最近,而与拟南芥的NHX基因同源性最低。NaNHX1基因的表达具有组织表达特异性,花中表达量最高,茎中次之,根和叶中表达量较低。在高盐、干旱、低温、ABA、低钾及H2O2等非生物胁迫下,NaNHX1的表达呈现3种不同的表达模式。其中,对高盐及低钾胁迫的响应强烈。本研究的结果表明,NaNHX1基因属于Na+/H+逆向转运蛋白家族,可能参与了花烟草高盐和低钾胁迫,以及其它非生物胁迫响应在内的众多生理过程。     

RLM-RACE法扩增獐茅液泡膜Na^＋/H^＋逆向转运蛋白基因5′-cDNA末端序列

根据已获得的盐生植物獐茅（Aeluropus littoralisvar.sinensisDebeaux）液泡膜Na^＋/H^＋逆向转运蛋白（Na＋/H＋antiporter）基因部分cDNA片段,设计2条特异引物（GSP1、GSP2）,采用RLM-RACE（RNA ligase-medi-ated rapid amplification of 5′and 3′cDNA ends）法获得了其5-′cDNA末端序列,并找出了转录起始位点。该片段长816 bp,与芦苇液泡膜Na^＋/H^＋逆向转运蛋白基因序列同源性最高达91%,与拟南芥、盐角草、水稻、大麦、小麦的同源性分别为81%、82%、86%、87%和81%,为该基因全长的克隆及启动子的研究奠定了基础。与其它测定基因转录起始位点的方法相比,RLM-RACE方法更快捷、简便、准确。     

新疆无苞芥Na~+/H~+逆向转运蛋白基因OpNHX1的克隆、表达分析与功能验证

从耐盐植物无苞芥中克隆获得了1个Na+/H+逆向转运蛋白基因NHX1,命名为OpNHX1(GenBank登录号:KC200248)。OpNHX1基因cDNA全长2 153 bp,包含一个1 605 bp的开放阅读框,编码534个氨基酸。系统进化树分析表明,OpNHX1编码产物与拟南芥、小盐芥亲缘关系较近,属于同一进化分支。实时荧光定量PCR分析表明,该蛋白基因在无苞芥根、茎、叶、花和荚果中均有表达,其中茎中表达量最高。半定量RT-PCR分析表明,该基因受高盐、干旱、低温及ABA的诱导上调表达。进一步将该基因在拟南芥中过量表达,显著提高了转基因植株在盐胁迫下的存活率,说明OpNHX1基因参与了植物的耐盐性。酵母功能互补试验结果显示,该基因转化酵母Δnhx1后可以补充NHX1的缺失,表明OpNHX1参与Na+/H+的转运。     

梭梭Na+/H+逆向转运蛋白基因克隆及分析

采用RT-PCR、RACE方法从超旱生、耐盐植物梭梭中扩增出Na+/H+逆向转运蛋白基因的开放阅读框架,其核苷酸序列长1 683bp,推测的氨基酸序列全长为560个氨基酸残基。含有多个物种Na+/H+逆向转运蛋白基因的高度保守序列氨氯砒嗪脒的结合位点(LFFIYLIPPI)。序列一致性分析结果显示,该cDNA片段与同科植物NHX基因的一致性为70%～80%,但与不同科植物的一致性较低,仅为60%,表明该基因在进化上存在多样性,但它们都具有氨氯砒嗪脒结合位点,对Na+具有高度专一性,对植物的耐盐性起着重要作用。     

盐处理下ZxSOS1调控旱生植物霸王Na~＋、K~＋转运蛋白基因的表达

本研究以多浆旱生植物霸王（Zygophyllum xanthoxylum）野生型（WT）及质膜Na＋/H＋逆向转运蛋白基因ZxSOS1-RNAi（RNA干扰）株系（L9）为材料,采用实时荧光定量PCR的方法分析了ZxSOS1被干扰后,霸王各组织中参与Na＋、K＋转运的重要通道或转运蛋白编码基因表达丰度的变化。结果显示,50 mmol·L-1 NaCl处理下,随处理时间延长,WT和L9根和茎中ZxSOS1和ZxSKOR、叶中ZxSOS1、ZxNHX和ZxVP1的表达丰度逐渐增加;ZxHKT1;1和ZxAKT1在WT根中的表达丰度呈增加趋势,而在L9根中则呈降低趋势;盐处理48 h后,L9株系中上述各基因的表达丰度均显著低于WT。由此从基因表达水平解析了ZxSOS1-RNAi株系叶和茎中Na＋的分配比例显著下降、根中显著增加,而K＋在其叶和根中的分配比例下降、茎中显著增加的调控机制。可见,ZxSOS1可通过调节各组织中参与Na＋、K＋转运的重要通道或转运蛋白编码基因的表达以调控霸王体内Na＋、K＋转运、空间分配和稳态平衡,进而调节植株的生长。     

跨膜逆向转运蛋白NHXFS1多克隆抗体的制备及应用

NHXFS1基因是通过DNA家族改组（DNA family shuffling）技术,以拟南芥、水稻和菊花的液泡膜Na＋/H＋逆向转运蛋白基因（NHX1）为亲本获得的活性显著增强的新基因。为制备该蛋白的多克隆抗体,对该蛋白进行跨膜结构分析,选取跨膜蛋白的C末端为靶标,并将其克隆到原核表达载体pET32a中,成功构建了原核融合蛋白pET32a-NHXFS1-抗原表达载体,转化大肠杆菌BL21（DE3）并诱导表达。通过镍柱亲和层析纯化该融合表达蛋白,获得了纯度约为80%的纯化蛋白,用于免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体。ELISA实验表明,该抗体的效价达到1：128 000,提取表达NHXFS1蛋白的酵母液泡经该多克隆抗体Western blot检测,证明该抗体具有较好的NHXFS1蛋白特异性。NHXFS1多克隆抗体的制备为进一步认识NHXFS1新蛋白结构与功能以及植物耐盐分子生物学的研究奠定了基础。     

北美海蓬子SbNHX1基因耐盐性及功能结构域分析

对从北美海蓬子中分离的Na+/H+逆向转运蛋白基因SbNHX1进行了耐盐性及功能结构域分析.利用套叠PCR技术去除SbNHX1基因C末端162个核苷酸,得到SbNHX1-C基因,然后将SbNHX1、SbNHX1-C和拟南芥Na+/H+ 逆向转运蛋白基因AtNHX1分别插入pET22b(+)表达载体,转化大肠杆菌B菌株,进行各种金属盐离子胁迫分析.结果表明,北美海蓬子Na+/H+ 逆向转运蛋白基因SbNHX1只对Na+ 、K+离子有抗性,且耐盐性强于拟南芥Na+/H+ 逆向转运蛋白基因AtNHX1.缺失C末端的SbNHX1-C基因对Na+、K+离子胁迫无抗性,说明北美海蓬子Na+/H+ 逆向转运蛋白基因SbNHX1的耐盐作用与该基因C末端1 353 bp至1 514 bp的序列密切相关.     

黄花草木樨MoSOS1基因克隆及表达分析

植物质膜Na+/H+逆向转运蛋白基因SOS1是植物耐盐性必需的基因之一,在抵御盐胁迫过程中发挥十分重要的作用。以黄花草木樨叶片总RNA为模板,通过RT-PCR结合RACE方法克隆得到黄花草木樨MoSOS1基因全长序列,命名为MoSOS1。序列分析表明该基因全长为3 931 bp,开放阅读框(ORF)为2 874 bp,编码957个氨基酸,分子量为112.8 k D,等电点为5.31。TMHAM软件跨膜区的预测分析表明,黄花草木樨MoSOS1蛋白具有8个跨膜结构区域,N端和C端都位于细胞外。氨基酸序列分析表明,MoSOS1蛋白含有1个Na+/H+Exchanger superfamily和一个c NMP(Cyclic nucleotide-monophosphate)结合位点以及1个CAP_ED(Catabolite gene activator protein-effector domain)superfamily结构域。生物信息预测显示,MoSOS1的编码蛋白为不稳定酸性蛋白,不存在信号肽,二级结构多为α-螺旋和无规则卷曲。荧光实时定量RT-PCR分析表明:随着Na Cl浓度的增加,黄花草木樨地上部和根中MoSOS1基因表达水平呈增加趋势,根中表达量大于地上部,表明MoSOS1基因的表达受盐胁迫诱导和调节。     

盐桦BhNHX的克隆及其与CaM在胁迫下的协同表达

以盐桦组培苗为材料,通过RACE技术克隆了液泡膜Na /H 反向运输体基因BhNHX,采用DNAman软件和BLASTN对cDNA序列进行分析并与其他植物的NHX基因进行同源性比较,最后对BhNHX和钙调蛋白基因(CaM)在各种胁迫条件下的协同表达进行半定量的RT-PCR分析.结果显示:(1)获得了BhNHX的全长cDNA序列,包含1 623 bp的开放阅读框架,编码一个540个氨基酸的多肽,有11个推测跨膜区,与已报道的液泡膜Na /H 反向运输载体蛋白跨膜区数目一致;(2)BhNHX的核酸序列与其他植物NHX具有较高同源性,与葡萄NHX序列一致性达到76%;(3)BhNHX和钙调蛋白基因CaM可同时被盐、低温、干旱所诱导;但ABA只能较明显诱导BhNHX的表达,而对CaM的诱导表达不明显.研究表明,在盐桦受到盐、低温及干旱胁迫时BhNHX和CaM可能协同表达,而在ABA诱导时两者可能具有不同的表达调控模式.     

Na+/H+ 逆向转运蛋白与植物耐盐性关系

Na+/H+ 逆向转运蛋白与植物的耐盐性有密切的关系。在高等植物体内,主要存在两种Na+/H+ 逆向转运蛋白,分别为位于细胞质膜上的逆向转运蛋白SOS1,以及存在于液泡膜上的AtNHX1。质膜Na+/H+ 逆向转运蛋白主要负责Na+ 的外排,液泡膜Na+/H+ 逆向转运蛋白主要负责把Na+ 区隔化入液泡。过量表达质膜Na+/H+ 逆向转运蛋白SOS1或液泡膜Na+/H+ 逆向转运蛋白AtNHX1能够明显提高植物的耐盐性。本文对植物中Na+/H+ 逆向转运蛋白及其与植物耐盐性之间的关系研究最新进展作一概述。     

水稻NHX1基因启动子和C末端的调控功能研究

为了解水稻Na+/H+逆向转运蛋白(OsNHX1)在植物应答非生物胁迫中的分子调控机制,采用RT-PCR方法克隆OsNHX1基因上游2 000bp的启动子序列,并通过基因枪轰击瞬时转化洋葱表皮细胞,检测不同非生物胁迫下启动子的活性和表达模式;同时,分别克隆全长和C末端缺失的OsNHX1基因,通过花序浸染法转化拟南芥,研究OsNHX1基因及其C末端的功能。结果显示:OsNHX1启动子受逆境胁迫诱导,在盐、干旱、脱落酸胁迫处理下GUS表达活性明显升高;过表达OsNHX1的转基因拟南芥中,种子萌发率、根长、丙二醛含量和相对含水量的测定结果均显示其胁迫耐受性得到改善,但过表达OsNHX1C末端缺失基因对转基因植株的胁迫耐受性无明显影响。研究表明,Na+/H+逆向转运蛋白有助于提高植物耐盐性,且其C末端区域对该转运蛋白活性的发挥具有关键作用。     

质膜Na^＋／H^＋逆向转运蛋白与植物耐盐性

土壤盐碱化是造成农作物减产的主要原因之一。质膜Na^＋／H^＋逆向转运蛋白能够介导植物根部Na^＋的外排和体内Na^＋的长距离运输, 并能够调控细胞K＋的稳态平衡及细胞内pH值和Ca^2＋的转运, 因此其在植物耐盐性方面具有重要作用。该文概述了植物质膜Na^＋／H^＋逆向转运蛋白的分子结构、功能、表达调控及其与植物耐盐性关系等方面的研究进展, 并对今后有关该蛋白的主要研究方向作了分析和展望。     

拟南芥液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白的研究进展

拟南芥液泡膜Na /H 逆向转运蛋白是由AtNHX1基因编码的一个在盐胁迫中起重要作用的蛋白。本文综述了AtNHX1的基本结构、功能及作用机制,展望其作为有效植物耐盐基因的前景,并对拟南芥液泡膜Na /H 逆向转运蛋白基因家族其他成员的研究,也做了相应的概括。     

Na^＋／H^＋逆向转运蛋白及其与植物耐盐性的关系

在概述了Na^ /H^ 逆向转运蛋白的分子组成、生化性质、生理功能的基础上,介绍了此种蛋白对胁迫的响应及其与耐盐性的关系,并对有关Na^ /H^ 逆向转运蛋白的植物耐盐基因工程研究的可行性及前景作了分析和展望。     

拟南芥液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白研究进展

盐分是植物生长发育的主要限制因素之一,而离子在胞内区室之间的选择性运动对提高植物耐盐性是至关重要的。来自于拟南芥(Arabidopsis thaliana)的AtNHX1基因可编码Na /H 逆向转运蛋白,而Na /H 逆向转运蛋白AtNHX1可将细胞质中多余的Na 排进液泡来消除Na 的毒害,维持细胞的渗透平衡,提高植物的耐盐性。简要综述了AtNHX1基因及Na /H 逆向转运蛋白AtNHX1的特征,AtNHX1的耐盐机制以及植物耐盐基因工程改良等方面的研究进展。     

农杆菌介导转AtNHX1基因杨树的获得

采用根癌农杆菌介导法,将拟南芥Na＋/H＋逆向转运蛋白（Na＋/H＋ antiporter）基因（AtNHX1）转入杨树.建立了杨树的继代及高频再生系统.经抗生素筛选,对再生植株进行PCR检测、PCR产物基因测序和杨树基因组DNA的Southern检测,证实已获得126株转AtNHX1基因的杨树植株.     

中间偃麦草Na+/H+逆向转运蛋白的分子克隆及生物信息学分析

根据小麦液泡膜Na /H 逆转运蛋白基因TaNHX1的全长序列设计引物,通过RT-PCR直接扩增的方法从中间偃麦草(Elytrigia intermedia)中克隆到了TaNHX1的同源基因,命名为TiNHX1(Acession Numeber:EF409418).TiNHX1最大开放阅读框为1 641 bp,编码含有546个氨基酸残基、分子量为59.8 kDa的蛋白,预测等电点8.0.TiNHX1含有38个碱性氨基酸,36个酸性氨基酸,256个疏水氨基酸及129个极性氨基酸.二级结构预测表明该蛋白含约44%的a-螺旋、21%的p-折叠、4%的p-转角和29%的不规则卷曲.亲疏水性分析显示,TiNHX1含有12个连续的疏水片断,其中10个可能构成穿膜螺旋.序列分析显示,TiNHX1与小麦(Triticum aestivum)、长穗偃麦草(Elytrigia elongate)、水稻(Oryza sativa)、小盐芥(Thellungiella halophila)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)等植物的液泡膜Na /H 逆向转运蛋白高度同源,序列相似性分别为97%、96%、85%、68%、67%.序列比对结果以及进化树分析均表明TiNHX1应为定位于中间偃麦草液胞膜上的Na /H 逆向转运蛋白.