聚苹果酸生产菌出芽短梗霉CCTCC M2012223的全基因组测序及序列分析

【目的】解析出芽短梗霉CCTCC M2012223的基因组序列信息,分析其代谢产物聚苹果酸、黑色素、普鲁兰多糖合成相关基因,为深入研究遗传多样性和代谢工程改造提供序列背景信息。【方法】使用Illumina Hi Seq高通量测序平台对出芽短梗霉CCTCC M2012223菌株进行全基因组测序,并对测序数据进行序列拼接,基因预测与功能注释,COG/GO聚类分析,比较基因组学分析等。下载其他5株出芽短梗霉基因组序列,比较分析6株菌的种内同源基因、全基因组进化以及代谢产物合成相关基因。【结果】出芽短梗霉CCTCC M2012223基因组序列全长30756831 bp,GC含量47.49%,编码9452个基因。比较基因组分析表明出芽短梗霉CCTCC M2012223的基因组组装长度最长,6株菌的同源基因数达到7092个,普鲁兰多糖和聚苹果酸合成相关基因的蛋白序列有很高的保守性。出芽短梗霉CCTCC M2012223和Aureobasidium pullulans var.melanogenum亲缘关系最近,而这2株菌的黑色素合成相关基因的蛋白序列有一些插入和突变。【结论】本研究解析了出芽短梗霉CCTCC M2012223的基因组序列信息,获得黑色素、普鲁兰多糖和聚苹果酸合成相关基因,为后续的代谢机制解析和改造提供相关依据。     

热稳定酯酰辅酶A合成酶的异源表达及酶学特性

【目的】为寻找能合成丙酰辅酶A和丁酰辅酶A等聚酮合成前体的生物催化剂,用体外酶学实验对一个酯酰辅酶A合成酶进行了表征。【方法】利用丙二酰辅酶A合成酶作为输入序列,通过BLAST程序在Caldicellulosiruptor owensensis OL的基因组中找到1个酯酰辅酶A合成酶基因。在大肠杆菌中进行了异源表达,并通过亲和层析进行纯化。底物谱、最适反应条件、稳定性和动力学参数通过体外酶学实验进行表征,而定点突变则用于活性中心的氨基酸残基的分析。【结果】该酶具有较好的底物宽泛性,可识别丙酸、丁酸、2-甲基丙酸、戊酸、3-甲基丁酸、2-甲基丁酸以及环己甲酸等一系列单酸。反应最适温度为30°C,最适p H为7.0。70°C保温8 h后仍有45%的活性残留,表明该酶相对比较稳定。通过活性中心3个位点的定点突变可以改变酶的底物特异性。【结论】C.owensensis OL来源的酯酰辅酶A合成酶是潜在的生物催化剂,可以用于聚酮前体的合成。     

农杆菌介导的出芽短梗霉遗传转化及高效筛选聚苹果酸高产菌株

建立根癌农杆菌介导的出芽短梗霉遗传转化方法及T-DNA突变库,高效筛选聚苹果酸高产菌株及功能基因。通过含潮霉素和草铵磷抗性基因的农杆菌转化出芽短梗霉,抗性压力筛选及PCR验证建立根癌农杆菌介导的出芽短梗霉遗传转化方法,结合发酵液p H与聚苹果酸含量响应变化,微孔板高效筛选高产聚苹果酸的T-DNA插入突变株,基因组步移确定T-DNA插入位点及功能基因。结果获得遗传稳定的抗性基因菌株,每107个细胞可获得80-120个转化子,出芽短梗霉H27号T-DNA突变株聚苹果酸摇瓶发酵产量提高24.5%,基因组步移证实糖酵解途径磷酸甘油酸变位酶基因被破坏。成功建立了根癌农杆菌介导的出芽短梗霉遗传转化方法和T-DNA插入突变库,结合高效筛选方法为聚苹果酸合成功能基因挖掘及高产机制解析奠定基础。     

出芽短梗霉产聚苹果酸发酵条件的优化

【背景】出芽短梗霉可发酵葡萄糖生成聚苹果酸,但存在转化率和转化效率低等瓶颈,阻碍其实现商业化生产。【目的】通过优化发酵培养条件,提高出芽短梗霉的聚苹果酸产量、糖酸转化率和生产强度。【方法】采用单因素试验优化适宜出芽短梗霉BK-10菌株产生聚苹果酸的培养条件,通过Plackett-Burman法对培养基组分筛选显著性影响因素,并对其培养基中无机盐进行正交试验优化,最后进行5 L发酵罐验证。【结果】最优培养基配方和培养条件:100 g/L葡萄糖,1.5 g/L尿素,0.20 g/L KH_2PO_4,0.20 g/L ZnSO_4,0.05 g/L MgSO_4,0.75 g/L KCl,30 g/L CaCO_3,0.01%吐温-80,发酵温度26°C,250 mL摇瓶装液量50 mL。【结论】通过优化,聚苹果酸的糖酸转化率达到0.71 g/g,生产强度达到0.89 g/(L·h),较优化前分别提高了18.33%和71.15%,为发酵葡萄糖合成聚苹果酸进而生产L-苹果酸工艺的工业化生产奠定经济性基础。     

毕赤酵母组成型表达脂肪酶及其高通量筛选方法

【目的】获得组成型表达脂肪酶毕赤酵母,建立利用橄榄油罗丹明B平板高通量筛选组成型表达华根霉脂肪酶基因的有效方法。【方法】运用PCR技术从pGAPZαA表达载体上扩增得到GAP启动子片段,插入到表达载体pPIC9K-proRCL中,构建组成型表达载体pGAPK-proRCL。在保留含有同源双交换重组序列的诱导型启动子AOX1序列的基础上,电转化后华根霉Rhizopus chinensis CCTCC M201021脂肪酶基因proRCL表达盒在毕赤酵母基因组上发生双交换整合事件,从而组成型表达单拷贝的华根霉脂肪酶基因。【结果】重组菌发酵144 h后,脂肪酶最高酶活为130 U/mL。利用橄榄油罗丹明B平板高通量筛选组成型表达华根霉脂肪酶基因。【结论】该方法将初筛时间从12 d缩短为3 d,排除了多拷贝突变株的干扰,为后续脂肪酶的定向进化及筛选奠定了基础。     

红色红曲菌M7的丝衣霉酸基因簇及其功能研究

【目的】明确红色红曲菌(Monascus ruber) M7的基因组中是否存在丝衣霉酸(byssochlamic acid, BA)基因簇,并探讨BA基因簇中聚酮合酶基因mr-Bys及3-羟酰基辅酶A脱氢酶基因mr-hdh对BA产生的影响。【方法】采用生物信息学方法对M7基因组进行分析,以确定BA候选基因簇;以基因敲除及过表达方法研究mr-Bys和mr-hdh对BA产生的影响;以超高效液相色谱(ultra-performance liquid chromatography, UPLC)和质谱(mass spectrometry, MS)方法分析BA。【结果】在红色红曲菌M7基因组中发现了BA基因簇,敲除mr-Bys后,BA消失,而敲除和过表达mr-hdh均可影响BA的产生。【结论】红色红曲菌M7基因组中存在BA基因簇,可产生BA。研究结果不仅丰富了红曲菌次生代谢产物及其合成途径的相关研究,也为以红曲菌为菌种开发新产品奠定了基础。     

山黧豆AAE超家族基因的鉴定及LsAAE3的酶活检测

【目的】为研究山黧豆（Lathyrus sativus L.）草酰辅酶A合成酶在三七素（β-N-草酰-L-α,β-二氨基丙酸,β-N-oxalyl-L-α,β-diaminopropionic acid,β-ODAP）生物合成途径中的作用。【方法】研究利用AMP结合结构域隐马尔科夫模型在山黧豆基因组中鉴定了酰基激活酶超家族（acyl-activating enzyme superfamily,AAE）基因,在此基础上,克隆了山黧豆草酰辅酶A合成酶基因LsAAE3,采用多序列比对、原核表达及酶活检测等方法分析LsAAE3基因功能。【结果】结果表明：山黧豆中至少存在22条AAE家族基因;系统发育分析表明,LsAAE3与拟南芥AtAAE3等聚为一支,隶属于酰基辅酶A合成酶家族。基因克隆及序列分析表明,LsAAE3基因cDNA全长为1 566 bp;LsAAE3和AtAAE3的保守结构域类似,均含有AMP结合位点、CoA结合位点、AAE保守结构域。SDS-PAGE检测表明,所获融合蛋白条带单一,大小在56 KD左右;利用His标签抗体进行Western blot分析发现,诱导后和纯化的融合蛋白均能检测到特征条带,说明所获融合蛋白为LsAAE3。体外酶活检测表明,LsAAE3具有草酰辅酶A合成酶活性,其活性发挥依赖于ATP、镁离子。【结论】研究在全基因组水平鉴定了山黧豆AAE超家族基因,并验证了LsAAE3具有草酰辅酶A合成酶活性,为进一步分析山黧豆LsAAE3在β-ODAP生物合成过程中的功能奠定基础。     

特异腐质霉内切葡聚糖酶Ⅱ基因在毕赤酵母中的表达及酶学性质

【目的】在毕赤酵母中表达特异腐质霉Humicola insolens的中性内切葡聚糖酶Ⅱ,并对其性质加以研究。【方法】利用RT-PCR的方法,以特异腐质霉(Humicola insolens)NC3总RNA为模板,克隆到中性内切葡聚糖酶Ⅱ基因(egⅡ)的cDNA。将其插入表达载体pPIC9K,重组质粒经线性化后电击转化毕赤酵母(Pichia pastoris)菌株GS115。【结果】SDS-PAGE和酶活的检测结果均表明:egⅡ基因在毕赤酵母中成功表达。重组酶的部分酶学性质研究表明,该酶的最适反应温度为70°C,且在65°C以下具有较好的热稳定性。最适反应pH为6.5,在pH 6.0?7.0之间有较好的稳定性。【结论】用重组毕赤酵母可高效表达外源中性内切葡聚糖酶,为其今后在工业应用奠定了基础。     

原玻璃蝇节杆菌D-氨基酸氧化酶及突变体的酶学特性

【目的】研究原玻璃蝇节杆菌(DSM 20168)中D-氨基酸氧化酶的酶学特性。【方法】通过PCR从原玻璃蝇节杆菌(DSM 15035,20168)中克隆获得D-氨基酸氧化酶基因apdaao-1和apdaao-2,构建原核表达载体,以表达质粒pET-ApDAAO-2为模板,采用QuickChange Site-Directed Mutagenesis技术构建定点突变体,经过原核表达及纯化获得重组型和突变体酶蛋白,分析其酶学特性。【结果】通过原核表达及纯化成功获得了2个重组蛋白和4个突变体酶蛋白,SDS-PAGE检测显示其分子量均约为36 kDa;酶学特性分析表明,ApDAAO-2和突变体蛋白的最适反应温度为30℃;ApDAAO-2和T286A的最适反应pH范围为7.0-11.0,其它突变体为8.0-11.0;ApDAAO-2和突变体都具有较广泛的底物特异性,除T256K的最适底物为D-Phe外,其余均为D-Met;动力学参数测定结果显示,以二级表观常数kcat/Km表示,对于底物D-Met或D-Phe,ApDAAO-2和4个突变体的kcat/Km值均比ApDAAO-1和pKDAAO高数倍以上。【结论】ApDAAO-2及突变体具有比ApDAAO-1和pKDAAO更广泛的底物特异性和较高的催化效率,有一定的商业应用价值。     

源于红树林土壤宏基因组文库的新型磷脂酶A1基因的筛选、克隆表达及酶学性质

【目的】利用宏基因组学的方法从红树林土壤中筛选新型酯水解酶类。【方法】构建红树林土壤宏基因组文库,采用以三丁酸甘油酯为底物的功能筛选方法,对筛选出的阳性克隆进行系统发育树分析,实现新型磷脂酶A1基因的原核表达,研究重组酶的酶学性质。【结果】筛选到一个新的磷脂酶A1编码基因phop1413 (GenBank登录号KF767097),测序表明其全长1 413 bp,可编码470个氨基酸残基,表达蛋白约51.7 kD,表达量高达220 mg/L,NCBI中Blast比对及系统进化树分析显示该蛋白属于磷脂酶类的fAMILY Ⅵ家族;酶学性质分析表明,该重组酶的最适反应底物为对硝基苯酚己酸酯,比酶活为124 U/mg;最适反应温度为54 °C,最适pH 7.8;50 °C热处理1.5 h剩余相对酶活为44%,表现出很好的热稳定性。【结论】通过构建宏基因组文库利用功能筛选方法获得一个新型磷脂酶A1基因;研究中获得的新型磷脂酶A1性质较好,可用于植物油酶法脱胶。     

聚苹果酸的发酵培养条件优化

对出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)BS02发酵制备生物降解材料聚苹果酸的摇瓶发酵条件进行研究,确定了出芽短梗霉发酵制备聚苹果酸的摇瓶培养条件。由实验结果可知:优化的培养基(g/L)为葡萄糖120.0、丁二酸铵3.0、丁二酸2.0、MnSO4.H2O 0.005、MgSO4.7H2O 0.1,另外每升发酵液加玉米浆0.5 mL,CaCO350 g/L,培养条件为pH4.0～4.5、24℃、500 mL摇瓶装发酵液100 mL、摇床转速220 r/min,在最优条件下,聚苹果酸产量可达到30 g/L。     

利用Ⅲ型聚酮合酶CsyB起始单元的底物多样性体内合成csypyrone类化合物

作为新型Ⅲ型聚酮合酶,米曲霉来源的CsyB能够依次接受一个起始单元为短链脂肪酰辅酶A、一个延伸单元为丙二酰辅酶A和另一个延伸单元为乙酰乙酰辅酶A的3个底物形成短链的csypyrone B1-3。基于CsyB的晶体结构分析,显示它的活性中心存在一个长约16?的能够接受脂肪酰辅酶A结合通道,这个通道很可能能够接受多种底物。为了检测该酶的底物多样性,将CsyB基因导入到存在长链脂肪酰辅酶A前体的大肠杆菌中表达。高效液相结果显示,相比对照菌株,重组菌株产生了一系列长链的csypyrone衍生物。利用紫外可见光特征吸收值和高分辨液相色谱-质谱联用仪对这些新产物作了初步分析。对3个具有羟基的csypyrone产物的结构进行了核磁共振一维谱和二维谱的详细鉴定,确定了其羟基的位置。上述结果显示,CsyB具有广泛的底物特异性,不但可以接受多种长链饱和或不饱和脂肪酰辅酶A,还可以接受具有羟基修饰的长链脂肪酰辅酶A作为底物。     

D190V点突变提高华根霉Rhizopus chinensis CCTCC M201021脂肪酶的最适温度和热稳定性

【目的】对来源于Rhizopus chinensis CCTCC M201021的脂肪酶进行了D190V定点突变, 提高该酶的最适温度和热稳定性。【方法】对毕赤酵母表达的突变酶D190V与野生型酶r27RCL进行酶学性质比较。【结果】D190V的最适温度比r27RCL高5 °C, 65 °C下的半衰期提高了一倍, 在其他性质方面, 突变酶D190V与r27RCL基本相似。【结论】通过结构分析表明, 定点突变D190V提高该酶稳定性的主要原因可能在于提高了突变位点所在的α螺旋的稳定性以及增强了稳定蛋白质结构的氢键作用力。     

灰盖鬼伞过氧化物酶功能表达及部分酶学特性

摘要:【目的】旨在用毕赤酵母高效表达灰盖鬼伞过氧化物酶。【方法】借助DNAworks 3.1软件设计、优化引物,用自己构建的基因合成、定点突变平台合成了毕赤酵母密码子偏好性的灰盖鬼伞过氧化物酶基因,测序后构建在表达载体pPICZαA上,整合于巴斯德毕赤酵母GS115染色体,来自酿酒酵母的α因子作为信号肽序列指导重组蛋白的分泌表达。从82个PCR检测为阳性的酵母转化子中筛选出6株高Zeocin抗性的菌进行表达,选表达酶活性最高的作为实验菌株命名为CIP/GS115。【结果】以ABTS为底物时,CIP/GS115 在甲醇诱导第4天酶活最高达到487.5 U/mL,是目前摇瓶培养诱导表达灰盖鬼伞过氧化物酶活性最高报道。纯化后的酶最适反应温度为25℃,45℃酶反应速度是最适温度时的61.5%,在低于40℃时比较稳定,超过45℃稳定性迅速下降。最适反应pH 为5.0,在pH 4.5－6.5之间比较稳定。以不同的底物研究纯酶底物特异性发现最适底物的顺序是:ABTS ＞ 愈创木酚＞ 2,6-二甲氧苯酚＞ 2,4-二氯苯酚＞ 苯酚。【结论】灰盖鬼伞过氧化物酶在毕赤酵母中的高效分泌表达和高的特殊活性为该酶在废水处理、染料脱色等方面的工业化应用奠定了一定基础。     

一株出芽短梗霉全基因组序列测定及其分析

出芽短梗霉因其发酵产物种类的多样性而具有广阔的工业应用前景。本研究利用下一代测序技术,对一株高产普鲁兰多糖的出芽短梗霉菌株(Aureobasidium pullulans CCTCC M 2012259)全基因组进行测序、组装和生物信息学分析。研究表明,该菌株的基因组全长约为26.37 Mb,共包含36条scaffolds和76 contigs,Gen Bank登录号:PRJNA350822。利用Gene Mark-ES软件对该基因组进行基因预测,共得到10 069个编码蛋白的基因。使用Blastp将其与Uniprot KB数据库中所有已知真菌蛋白进行比对,发现有6 218个预测蛋白与Uniprot KB数据库中的4 925个已知蛋白高度相似。利用DAVID工具对这些蛋白进行GO基因功能注释、KEGG通路注释和蛋白酶分析,分别注释得到4 444条GO功能条目、1 566条KEGG通路条目和1 740条蛋白酶信息。测定与分析为今后针对出芽短梗霉的功能基因挖掘以及分子遗传改造等工作的开展奠定了坚实的理论基础。     

一种新型(S)-羰基还原酶的克隆及其功能表达

【目的】从近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis CCTCC M203011)基因组中钓取新型(S)-羰基还原酶基因(scrⅡ),对其生物转化手性醇的功能进行了验证。【方法】采用PCR的方法,从C.parapsilosis基因组中扩增出一段可能的羰基还原酶基因scrⅡ。以构建的重组菌Escherichia coli BL21/pET28a-scrⅡ为生物催化剂,2-羟基苯乙酮为底物进行催化反应,经HPLC分析,计算终产物的光学纯度和产率,确定了转化反应的最适温度和pH值。【结果】scrⅡ基因全长为840bp,编码279个氨基酸,与已报道的(S)-羰基还原酶基因scr的一致性为85%。氨基酸序列分析表明SCRⅡ具有典型短链醇脱氢酶的功能域:辅酶结合区域Thr40-Gly41-(X)3-Gly45-X-Gly47和催化三联体结构Ser172-(X)n-Tyr187-(X)3-Lys191。在30℃,0.1mmol/LIPTG的诱导下,(S)-羰基还原酶(SCRⅡ)在E.coli中过量表达。以10%(w/v)的重组菌为催化剂,高浓度(6g/L)2-羟基苯乙酮为底物,在最适反应温度35℃和pH5.5的条件下,转化产物(S)-苯基乙二醇的光学纯度高达99.1%e.e.,产率为89.6%。与(S)-羰基还原酶SCR相比较,底物浓度提高了一倍,产物的光学纯度和产率分别提高了10%和28%。【结论】采用分子克隆技术分离出新型羰基还原酶SCRⅡ的编码基因,该酶的发现为手性醇的高效制备奠定了坚实的研究基础。     

细菌麦芽糖淀粉酶在枯草芽孢杆菌中的诱导型异源表达

【目的】实现地衣芽孢杆菌麦芽糖淀粉酶在枯草芽孢杆菌中的高效异源表达,并研究该重组酶的酶学性质。【方法】克隆巨大芽孢杆菌木糖异构酶基因的启动子区域及其调控蛋白,构建一个大肠杆菌/芽孢杆菌穿梭型诱导表达质粒,使用该诱导型启动子介导麦芽糖淀粉酶编码基因,实现其在枯草芽孢杆菌中的功能表达。对重组枯草芽孢杆菌的诱导条件进行优化,提高麦芽糖淀粉酶的产量。【结果】获得了诱导表达麦芽糖淀粉酶基因的重组枯草芽孢杆菌菌株。最适诱导温度为45°C,最适诱导剂添加浓度为1%,最适添加诱导剂时间为接种培养9 h后。重组酶蛋白分子量大小为67 k D,对该酶的酶学性质研究发现,以可溶性淀粉为底物,反应生成麦芽糖和葡萄糖,其中麦芽糖含量为60.42%。重组酶最适作用温度为45°C,最适作用p H为6.5,Ca2+、Co2+、EDTA对该重组麦芽糖淀粉酶具有激活作用。【结论】通过木糖诱导表达系统可以实现麦芽糖淀粉酶在枯草芽孢杆菌中的高效诱导型表达,酶活最高可达296.64 U/m L发酵液,在工业上有着较好的应用前景。     

华根霉Rhizopus chinensis CCTCC M201021脂肪酶基因的分子改造及酶学特性的探究

本文对华根霉Rhizopus chinensis CCTCC M201021脂肪酶(r27RCL)的氨基酸序列(A149C、V180C和F196C)进行定点突变。以未突变的野生型脂肪酶r27RCL作为对照,借助pPIC9K载体表达系统将野生脂肪酶及突变体在GS115中实现异源表达,并研究野生型脂肪酶r27RCL及突变体的酶学性质。结果表明,三个单突变体均不能与氨基酸残基C177形成二硫键,但是突变体r27RCL-V180C最大催化效率是野生型脂肪酶r27RCL的1.43倍,与不同碳链长度的p-NP(p-硝基苯酚)底物亲和力也相对提升,酶最适反应温度降低5℃。突变体r27RCL-A149C和r27RCLF196C较野生型具有更宽的p H作用范围。本文研究为探究华根霉来源的脂肪酶蛋白空间结构及酶基因改造提供了理论依据。     

来源于海洋细菌Altererythrobacter epoxidivorans CGMCC 1.7731T的新型碱性酯酶E22的酶学性质

【目的】克隆表达海洋细菌Altererythrobacter epoxidivorans CGMCC 1.7731~T中的酯酶基因e22,并研究其酶学性质。【方法】分析菌株的全基因组序列,筛选获得一个酯酶基因e22,将其克隆至p ET-28a载体上,并转化至大肠杆菌BL21(DE3)细胞中表达,研究纯化后表达产物的酶学性质。【结果】通过氨基酸序列分析,确定酯酶E22属于脂类水解酶第二家族(Family Ⅱ)。酶学性质研究结果表明,该酶最适反应底物为对硝基苯酚丁酸酯(C4);最适反应pH 10.5,为碱性酯酶;最适反应温度为55°C,并在60°C孵育2 h后仍保留超过50%的活性,显示了良好的热稳定性;1%甲醇、1%Triton X-100或0.1%SDS对酯酶E22的活性无显著影响,而10 mmol/L的Ba~(2+)或Ca~(2+)则对其活性有抑制作用。【结论】E22是一个新型海洋来源酯酶,具有耐碱性、热稳定性、有机溶剂和去垢剂耐受性等优良特性,在工业生产中具有较好的应用潜力。     

华根霉前导肽和成熟肽脂肪酶基因的克隆表达及性质研究

以华根霉(Rhizopus chinensis CCTCCM201021)为出发菌株,提取总DNA,PCR扩增出前导肽脂肪酶基因(proRCL)及成熟肽脂肪酶基因(mRCL),克隆到原核载体pET-28a,转化E-coli BL21(DE3),诱导表达并纯化出活性目的蛋白.经SDS-PAGE分析,重组蛋白ProRCL和MRCL的分子量分别约43 kD和33 kD.两重组脂肪酶主要酶学性质基本相似,最适反应温度均为35℃,40℃下较为稳定;最适反应pH相近,分别为8.0和8.5;以pNP脂肪酸酯为底物,均对短链脂肪酸酯底物特异性较高.MPCL上述性质与野生型RCL基本一致.研究结果表明,通过条件控制可以利用E.coli表达系统表达具有活性的华根霉前导肽脂肪酶ProRCL和成熟肽脂肪酶MRCL.与米根霉脂肪酶(ROL)不同,前导序列对华根霉脂肪酶的主要酶学特性没有显著影响.