重组DNA研究大事记

1871从莱茵河鲑鱼的精子中发现DNA。 1943证明DNA是一种能改变细菌遗传特性的物质。 1953提出DNA互补双螺旋结构假设。     

荷兰生物技术产业发展现状

荷兰以风车、郁金香、奶酪和木鞋闻名于世。荷兰国土面积为41864平方公里,位于欧洲西部,东面与德国为领、南接比利时、西北濒临北海,地处莱茵河、马斯河和斯凯尔特河三角洲,海岸线长1075公里。现在荷兰是全球第16大经济体。虽然荷兰国土面积较小,但拥有400多家生物技术企业,18所大学开设生物技术专业,成立了政府及公/私合作的生物技术研究机构。     

外源基因在莱茵衣藻叶绿体中的表达

把莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)叶绿体作为生物反应器来表达外源基因具有广阔的应用前景。人们利用莱茵衣藻叶绿体表达体系已成功表达多种重组蛋白,其中包括人类药用蛋白。综述了莱茵衣藻叶绿体转化的方法、影响外源基因表达的主要因素以及外源基因在莱茵衣藻叶绿体表达研究进展。     

4-香豆酰-CoA连接酶 (4CL) 和聚酮合酶 (PKS1) 的融合蛋白在莱茵衣藻中表达促进树莓酮积累

树莓酮具有重要的医药价值,如抗流感、预防糖尿病等。为了在莱茵衣藻Chlamydomonas reinhardtii中获得树莓酮,本研究将树莓酮合成的最后两个步骤中的酶,即4-香豆酰-CoA连接酶 (4-coumaryl-CoA ligase,4CL) 和聚酮合酶 (Polyketide synthase,PKS1) 通过甘氨酸-丝氨酸-甘氨酸 (Gly-Ser-Gly,GSG) 三肽接头融合在一起,构建莱茵衣藻表达载体pChla-4CL-PKS1。通过电转化的方法将由PSAD启动子驱动的融合基因4CL-PKS1插入野生型莱茵衣藻 (CC125) 和细胞壁缺失型莱茵衣藻 (CC425) 中。结果在表达4CL-PKS1融合蛋白的野生型莱茵衣藻和细胞壁缺失型莱茵衣藻中,树莓酮含量分别为6.7 μg/g (鲜重) 和5.9 μg/g (鲜重),高于天然植物中树莓酮的含量（2–4 μg/g）。     

以绿色科技开创健康未来

桂林莱茵生物科技股份有限公司(以下简称莱茵生物),成立于2000 年11 月,是一家专业从事天然植物产品的研发、生产及销售,具有自主知识产权和自主品牌的科技型、外向型民营企业.公司股票已于2007 年9 月13 日在深圳证券交易所中小企业板挂牌上市,股票简称" 莱茵生物", 股票代码:002166,是行业内第一家上市企业.     

4种常用抗生素对莱茵衣藻生长及光化学活性的影响

采用4种不同浓度的抗生素对(氨苄青霉素(Amp)、卡那霉素(Kan)、氯霉素(Cmp)及四环素(Tet))莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)进行无菌化处理,研究抗生素种类及浓度对莱茵衣藻的细胞密度、叶绿素a含量及光化学活性的影响,以确定对莱茵衣藻细胞无害并能抑制伴杂菌生长的抗生素种类及使用浓度。结果表明:低于100μg/mL的氨苄青霉素(Amp)及20μg/mL的氯霉素(Cmp)处理,会使莱茵衣藻的细胞密度及叶绿素a的含量增加,卡那霉素(Kan)及四环素(Tet)各浓度的处理都会使细胞密度及叶绿素a的含量下降,并呈现抗生素的剂量依赖效应;50μg/mL的Amp及10μg/mL的Cmp在处理3 d后会增加莱茵衣藻的实际光合效率(YII)及相对电子传递效率(rETR),而后下降;Kan及Tet各浓度的处理都会使YII及rETR显著下降。结合4种抗生素对莱茵衣藻伴生菌的抑菌实验结果,表明在4种抗生素中,Cmp在抑菌范围内并不会明显地抑制莱茵衣藻细胞的生长与光化学活性,可用于莱茵衣藻细胞无菌化培养中。     

同步化培养后莱茵衣藻生物量和总RNA含量的变化

为了探索莱茵衣藻经光/暗同步化培养后的细胞生长和总RNA的变化规律。本研究检测了16h光/8h暗同步化培养后莱茵衣藻的生物量和总RNA含量的变化规律。结果,在同步化培养结束后的前28h,莱茵衣藻的生物量呈现有节律的阶梯增长;在同步化培养结束后的28～48h,这种阶梯式增长方式逐步消失。在同步化培养结束后的前24h,总RNA含量呈现有节律的峰-谷-峰变化;在同步化培养结束后的24～48h,这种变化幅度逐步减小,节律周期也逐步缩短。对比同步化培养后莱茵衣藻生物量和总RNA含量的变化可以得出,同步化培养后莱茵衣藻的同步化节律仍然可以维持一定时间;但随着连续光培养时间的延长,这种节律逐步消失,通过测定生物量和总RNA含量的变化可以跟踪同步化培养后莱茵衣藻的同步化变化。     

农杆菌介导转化莱茵衣藻体系的优化

[目的]为建立根癌农杆菌介导的莱茵衣藻快速简便高效的遗传转化体系,本研究以模式生物莱茵衣藻为受体材料,从转化方法和转化子快速鉴定两个方面进行了优化.[方法]比较了固体培养基共培养转化方法和液体培养基共培养转化方法对根癌农杆菌LBA 4404介导的莱茵衣藻CC425转化效率的影响;研究并比较了(1)首先经过TE裂解再进行...     

小球藻和莱茵衣藻原生质体的电转化研究

以小球藻及莱茵衣藻原生质体为受体细胞,利用电击法将质粒p CAMBIA1301转入小球藻和莱茵衣藻,摸索电击转化条件并进行分子检测。结果表明:两类藻都对潮霉素敏感,小球藻及莱茵衣藻分别在含25 mg/L和100 mg/L潮霉素的固体培养基上的生长被完全抑制;小球藻和莱茵衣藻原生质体电击转化的最佳电击场强分别为0.8 k V/cm和0.6 k V/cm,最佳脉冲时间均为10 ms;制备原生质体和通过2-脱氧-D-葡萄糖处理可明显提高转化效率;分子检测说明GUS报告基因成功转入两种藻并可稳定遗传。     

RNA干扰20S蛋白酶体α亚基基因对莱茵衣藻油脂代谢的影响

为了解20S蛋白酶体α亚基(20S proteasome alpha subunit A, POA1)基因对莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)油脂代谢的调控,对莱茵衣藻CC425在低氮胁迫下的CrPOA1表达进行了分析,克隆POA1同源基因片段,构建pMaa7IR/XIR干涉载体并转化莱茵衣藻CC425,对CrPOA1进行有效沉默,测定转基因藻株细胞干质量和油脂含量;克隆全长基因,构建CrPOA1-GFP融合表达载体并转化洋葱表皮细胞,进行亚细胞定位。结果表明,莱茵衣藻在低氮培养下,CrPOA1 mRNA水平比对照(正常培养)显著降低(P0.01),RNAi转基因藻株CrPOA1 mRNA水平比对照pMaa7IR/XIR(maa7)降低79.36%～85.35%,沉默效果较好;RNAi转基因藻株细胞干质量与对照maa7无显著差异,油脂含量比对照maa7显著降低6.38%～24.63%,CrPOA1正向调控莱茵衣藻油脂;亚细胞定位于细胞核。这表明CrPOA1参与了莱茵衣藻的油脂代谢过程。     

莱茵衣藻E2泛素结合酶CrUBC23调控油脂积累

【目的】为研究莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)泛素结合酶(ubiquitin-conjugating enzymes,E2)CrUBC23在莱茵衣藻油脂代谢中的作用,为高产油微藻基因工程改良和揭示藻类油脂合成及代谢调控机理奠定基础。【方法】qRT-PCR分析莱茵衣藻在低氮、低磷胁迫下泛素结合酶CrUBC23表达情况;克隆CrUBC23同源基因干涉片段和全长基因,构建RNAi干涉载体和过量表达载体,转化莱茵衣藻并检测生物量和油脂含量;构建CrUBC23-GFP融合表达载体,用农杆菌浸染洋葱表皮细胞进行亚细胞定位。【结果】莱茵衣藻在低氮、低磷胁迫下CrUBC23基因表达量显著增加,增加幅度分别为正常培养的4.98–5.80倍和1.85–5.20倍。RNAi干扰结果显示,转基因藻细胞中性脂含量降低5.5%,总脂含量降低3.16%–17.6%。过量表达结果显示,转基因藻细胞中性脂含量增加8.8%,总脂含量增加4.51%–14.03%。【结论】CrUBC23正向调控莱茵衣藻油脂代谢,该基因定位于细胞核。     

流域生态学及模型系统

流域生态学是一门复杂的交叉学科,主要研究流域自然、社会和经济之间的动态关系。虽然流域生态学的发展较晚,尚处于初期阶段,但却有重要的研究意义和应用前景。分析了目前国内外流域生态学研究的现状和存在的问题,然后结合在荷兰参与流域生态研究的经验探讨流域生态学研究的一些思路和框架;重点论述了如何应用现代计算科学和信息技术建立流域生态学研究的定量方法和模型系统,最后给出了荷兰Veluwe湖和莱茵河下游的流域生态研究及模型实例。     

“世界洪水”的神话与现实

在举世闻名的北京人遗址所在的周口店龙骨山的山顶上,覆盖着一层浑圆而光滑的河卵石。是谁把这些石头搬到了山顶上呢?如果我们离开龙骨山到别处去旅行,在世界上许许多多的地方都可以发现类似的砾石分布在高高低低的山顶上,砂砾成层,分选好,磨圆度高。显而易见,这绝不是人为的,它是天然形成的,而且是水流搬运来的。水流怎么能把石头冲到这样高的山顶上去呢?是不是在远古时期地球上发生过特大洪水? “世界洪水”的神话我国广泛传说,在古时候,天帝因为人类有忤逆他的行为而生了气,便降下洪水来惩罚人类。世界     

单细胞光合生物莱茵衣藻光系统Ⅱ产生超氧阴离子自由基的ESR研究

强光辐照下高等植物光系统Ⅱ(PSⅡ)会产生超氧阴离子自由基(O-2),该过程中产生的O-2在高等植物光合作用活性氧自由基代谢中具有重要作用.莱茵衣藻光系统结构与高等植物非常相近.应用新型高特异性自旋捕获.ESR方法及四唑氮蓝还原法,首次在莱茵衣藻的类囊体膜和PSⅡ中检测到O-2的生成,通过与有关菠菜的ESR实验结果对比发现两者的O-2产生分子机制可能极为相似.相比高等植物,单细胞莱茵衣藻具有结构简单、遗传背景清晰与基因组测序工作完备等诸多特点.因而,针对莱茵衣藻的O-2分析可能为深入研究高等植物光合系统中的活性氧代谢机制提供新的契机.     

莱茵衣藻中Limp77基因干涉后油脂含量升高

随着能源危机问题日益严重,可再生能源的研究渐渐成为目前研究的热点.微藻生物能源又以众多的优点成为目前可再生能源的研究重点.我们发现,在减氮培养下的莱茵衣藻,其油脂含量增加,Limp77基因的表达量明显下降.Limp77基因编码的是一类CCCH型锌指蛋白,具有通过与DNA、RNA结合来实现转录的调控或通过调控其它基因转录的锌指蛋白来实现转录调控的功能,极可能参与到莱茵衣藻油脂代谢调控中.通过利用RNAi干涉技术构建Limp77基因的干涉载体,并通过玻璃珠法转入莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）2A38中,研究其与油脂相关的生理生化指标的变化.实验结果表明,Limp 77基因明显抑制莱茵衣藻油脂的积累.     

液相色谱-串联质谱法定量分析莱茵衣藻1,3-二油酸-2-棕榈酸甘油三酯

研究建立了基于超高效液相色谱串联三重四级杆质谱技术的1,3-二油酸-2-棕榈酸甘油三酯(1,3-Dioleoyl-2-palmitoylglycerol, OPO)分析方法。在正离子模式下, 以[876>577]为定量离子对, 通过多反应监测模式(Multiple Reaction Monitoring, MRM)扫描, 采用内标法对OPO进行定量分析。对缺氮胁迫条件下一株野生型莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)cc-5325及其半乳糖基水解酶基因敲降突变体M08的OPO进行了定量分析, 研究结果发现莱茵衣藻中OPO在缺氮胁迫期间显著积累, 且不同遗传背景的莱茵衣藻OPO积累量不同。在缺氮第1至第3天, M08的OPO含量相较于cc-5325分别提高了3.70、3.04和2.74倍, M08的OPO产量相较于cc-5325分别提高了1.13、1.53和1.33倍, 说明通过遗传改造莱茵衣藻的某些脂质代谢途径相关基因可以增加其OPO含量, 因此莱茵衣藻具有改成为商业化油脂新食品原料的潜在应用价值。研究建立的功能脂质OPO的定量分析方法对进一步研究不同遗传改造的莱茵衣藻中OPO结构脂的检测提供了技术支持和分析基础。     

茉莉酸对莱茵衣藻代谢降解杀菌剂三氯生的影响机制

三氯生是一种广谱抗菌剂,广泛应用于日用化学品之中。长期以来,三氯生随生活污水排放至水环境中,对动植物产生毒性作用,进一步通过食物链对人类健康产生威胁。开发高效绿色的三氯生降解方法具有重要的现实意义。微藻作为重要的水环境分解者,参与水体中外源化学物的代谢降解。茉莉酸是一种常见的植物激素,能诱导高等植物对环境胁迫的抗逆性,但其对微藻类低等植物防御体系的影响还未见报道。因此,本文中,笔者考察了不同浓度茉莉酸处理对莱茵衣藻应答三氯生胁迫作用及对三氯生代谢的影响。结果发现,0. 05、0. 15和0. 45μmol/L茉莉酸处理不同程度缓解了三氯生对莱茵衣藻的氧化胁迫,但高浓度茉莉酸(0. 45μmol/L)会抑制莱茵衣藻的生长。与三氯生单独处理的莱茵衣藻样本相比,0. 15μmol/L茉莉酸处理显著提高了谷胱甘肽S-转移酶和多酚氧化酶活力,降低了体内过氧化物酶活力。此外,茉莉酸处理莱茵衣藻体内三氯生积累量显著小于未处理组,而培养液中三氯生残留量无显著差异,说明茉莉酸促进了衣藻对三氯生的代谢降解。进一步通过高分辨质谱鉴定了6种三氯生在莱茵衣藻体内的代谢产物,其中有4种只在茉莉酸处理组中检出,说明在茉莉酸处理下莱茵衣藻代谢三氯生的方式更加多样化,降解效率更高。     

小G蛋白BBS3b的原核表达纯化及其多克隆抗体制备北大核心

[目的]制备莱茵衣藻小G蛋白BBS3b的多克隆抗体。[方法]利用莱茵衣藻bbs3b基因的c DNA序列分别构建了带有GST和6×His标签的原核表达载体p GEX-2T-BBS3b和p ET-28a(+)-BBS3b并转化至大肠杆菌BL21(DE3)诱导表达,以12%SDS-PAGE鉴定。用纯化的GST-BBS3b融合蛋白免疫新西兰大白兔,采集第4次免疫后血液并分离血清,利用间接ELISA法进行效价测定,并将抗血清依次经过Protein A纯化和硝酸纤维素膜纯化,用Western Blotting检测抗体特异性。[结果]GST-BBS3b和6×His-BBS3b融合蛋白的分子量分别为46、20 k Da。用ELISA的方法测定抗血清效价为512 000,Western Blotting检测结果显示制备的多克隆抗体能够特异性识别莱茵衣藻BBS3b蛋白。[结论]制备的多克隆抗体效价为512 000,能够特异性识别莱茵衣藻中BBS3b蛋白,为利用莱茵衣藻作为模式生物进行BBS3b在纤毛信号传导中的作用机理研究奠定了基础。     

Hsp70A-RBCS2融合启动子调控PHB合成酶基因在莱茵衣藻中的表达

利用Hsp70A-RBCS2融合启动子构建了新型的莱茵衣藻表达载体,并获得了聚-β-羟基丁酸（PHB）合成酶基因（phbC）的衣藻表达载体p105C124和pH105C124.通过＂珠磨法＂分别将上述两个衣藻表达载体导入细胞壁缺陷的莱茵衣藻CC-849（Chlamydomonas reinhardtii CC-849）中,得到了具有Zeomycin抗性的转基因藻株.Hsp70A-RBCS2启动子介导的外源基因遗传转化效率明显高于RBCS2启动子,Southern杂交结果显示,phbC基因以低拷贝数整合进莱茵衣藻的基因组DNA中.在光照下,Hsp70A-RBCS2融合启动子能够有效调控phbC基因在莱茵衣藻中的转录和翻译,得到的蛋白产物具有PHB合成酶活性,40℃热激诱导可使PHB合成酶的酶活性提高到1.8倍.因此,Hsp70A-RBCS2融合启动子可使phbC基因在莱茵衣藻中实现可诱导的表达,该研究对利用衣藻合成PHB具有重要的学术意义,进一步的研究将通过＂共转化＂法获得二价或三价的转基因藻,最终实现在转基因藻中合成PHB.     

衣藻叶绿体表达系统的研究

真核藻类作为一种新型的蛋白表达系统,因其培养方法简单,成本低廉并且能大规模繁殖,最近几年成为人们关注的焦点.作为一种模式生物,单细胞的真核生物莱茵衣藻已经成为人们研究的重点.外源蛋白不仅能在衣藻核中进行表达而且也能在叶绿体中表达,但衣藻叶绿体的表达系统较之核表达有巨大的优越性.在到目前为止,已经有许多的药用蛋白在莱茵衣藻的叶绿体中成功表达的报道,证明了莱茵衣藻叶绿体作为生物反应器的能力.将对衣藻叶绿体的表达做详细的描述.