EMA-LAMP方法快速检测鉴别副溶血性弧菌

建立将DNA染料EMA(ethidium bromide monoazide)结合环介导等温扩增技术(loop-mediated isother-mal amplification,LAMP)的方法(EMA-LAMP),用于检测鉴别副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)死/活菌细胞。针对副溶血性弧菌不耐热溶血素基因tlh(thermolabile hemolysin)特异性序列的6个位点设计4条引物及2条环引物,进行检测。结果表明,浓度为8.0μg/mL或更高浓度的EMA,至少经25 min的曝光处理,能够有效抑制浓度为1×108cfu/mL的副溶血性弧菌死细胞的扩增,而对用相同浓度EMA处理的副溶血性弧菌活细胞扩增没有影响。经EMA处理,含有不同比例的副溶血弧菌死细胞和活细胞的混合液中,活菌的最小检测限为1.0×102cfu/mL。EMA-LAMP方法比EMA-PCR方法区分死活细胞中的活细胞更为有效,是一种能够快速、灵敏且更为有效鉴别副溶血性弧菌死活细胞的新方法。     

副溶血性弧菌脂蛋白定位系统转运蛋白结构与功能的生物信息学分析

【目的】副溶血性弧菌是一种重要的人畜共患病原菌,脂蛋白定位系统(Localization of lipoprotein system,Lol)负责该菌脂蛋白的转运与定位,与其致病力及耐药性密切相关,对Lol系统转运蛋白进行系统的生物信息学分析,有助于推动副溶血性弧菌致病与耐药机理的进一步研究。【方法】本文通过生物信息学分析技术,结合ExPASy在线工具、SignalP 4.0 Server、TMHMM-2.0、STRING、SWISS-MODEL等软件,分析了副溶血性弧菌Lol系统转运蛋白LolA-E及LolCD_2E的基本性质、蛋白互作关系及三级结构。【结果】LolA和LolB为酸性亲水蛋白,含信号肽位点,无跨膜区域。LolC和LolE为碱性疏水膜蛋白,LolCD_2E为中性疏水膜蛋白,LolC-E及LolCD_2E均无显著的信号肽位点。蛋白相互作用网络显示,LolA–E五个蛋白的编码基因均共表达,负责脂蛋白的合成与转运,并与BamA、Pal、MacB、CmeC等外膜蛋白具有密切的互作关系。三级结构同源建模发现,副溶血性弧菌与大肠杆菌拥有相似的LolA和LolB结构,LolC-E含有MacB蛋白的同源结构,赋予了该系统消耗ATP运输脂蛋白的重要功能。此外,本研究还首次发现了副溶血性弧菌LolC和LolE中存在一段保守的Hook结构,是LolCD_2E复合物与LolA结合并转运脂蛋白的关键区域。【结论】本研究为副溶血性弧菌Lol系统转运蛋白的表达纯化、结构与功能的研究提供了重要的数据基础,为后续抗菌药物的研发提供了新型作用靶点。     

致病性副溶血性弧菌菌落杂交检测体系的优化

对常见食源性致病菌副溶血性弧菌的杂交条件进行了优化。基于副溶血性弧菌的tdh,trh,toxR基因选用了3种探针序列,从菌落杂交样品的预处理方法、杂交时间和显色检测等方面对基于副溶血性弧菌毒力基因的原位杂交实验进行了条件优化。结果表明,采用80℃热固定2 h,37℃预杂交10 min后杂交8 h以及封闭1 h的改良方法可获得高特异性、低背景且着色清晰的实验结果。优化的菌落杂交技术检测副溶血性弧菌与传统检测方法相比,具有高效、准确、可区分致病性菌株的优点,为水产品中副溶血性弧菌致病菌株和非致病菌株的同步检测和筛选提供参考。     

副溶血性弧菌显色培养基检测效果初步评价

副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)是一种重要的食源性致病菌, 广泛存在于各种海产品中。由于传统培养基和检测方法费时费力, 本研究设计开发了一种新型显色培养基HKC vibrio, 通过应用于人工污染样品和实际样品检验, 以法国科玛嘉弧菌显色平板CHROMagar vibrio和柠檬酸钠-硫代硫酸钠-氯化钠-蔗糖琼脂平板(TCBS)为对照, 对显色培养基HKC vibrio的灵敏性、特异性和检测效果进行了初步评价。结果表明, HKC vibrio的灵敏性与CHROMagar vibrio和TCBS相当, 并具有较好的特异性, HKC vibrio是非常有价值的分离平板, 可大大提高副溶血性弧菌的检测效率。     

副溶血性弧菌免疫逃逸及其可能机制的研究进展

副溶血性弧菌是全球范围内威胁人体健康和食品安全的食源性致病菌。在感染人体的过程中,副溶血性弧菌通过将其效应蛋白直接注射至宿主细胞中操纵宿主,介导毒力的发挥,并进化出了一套完美的免疫逃逸策略,成功躲避免疫系统的攻击,引起急性肠胃炎、败血症和坏死性筋膜炎等疾病。副溶血性弧菌入侵上皮细胞,使胞内囊泡酸化,在与溶酶体融合之前逃逸到细胞质中,并且限制活性氧的产生,促进其在胞内生存。副溶血性弧菌可以诱导自噬,抑制NLRC4炎症小体介导的caspase-1的激活,还可以通过抑制TAK1激酶,阻止MAPK和NF-κB信号通路的激活,干扰免疫系统激活,借助多种手段共同协作从而达到免疫逃逸。本文系统总结了副溶血性弧菌现已研究的免疫逃逸机制,并对其可能存在的免疫逃逸机制提供了新的见解和方向,对深入了解副溶血性弧菌的致病机理和防控药物靶向位点的选择及研发具有重要意义。     

一起副溶血性弧菌引起食物中毒的实验室检测

目的对某集团公司食堂发生的一起食物中毒病原菌进行实验室检测。方法参照GB/T4789-2008、WS/T8-1996、GB17012-1992和《卫生防疫检验》对采集的47份样本进行肠道致病菌检测,对检出的副溶血性弧菌用VITEK全自动微生物分析系统进行生化鉴定,以及神奈川试验、血清分群分型及药敏试验。结果从47份样本中检出40株副溶血性弧菌,检出率高达85.1%,神奈川试验均阳性,生化反应呈五种模式,血清分群有O3、O4、O1三种,血清分型有K6、K8、K29、K68、KUT五种,均对氨苄西林、头孢噻吩、阿莫西林/克拉维酸耐药,对头孢曲松、头孢哌酮、头孢克肟、阿米卡星、氟派酸、复方新诺明、链霉素、庆大霉素、环丙沙星、亚胺培南、氯霉素等药物敏感。结论本次食物中毒是由副溶血性弧菌引起。     

副溶血性弧菌生物被膜形成及其调控机制研究进展

副溶血性弧菌是一种广泛存在于海产品中并可引起人类急性肠胃炎的食源性致病菌。该菌形成的生物被膜能够增强体外环境中的存活率,促进对宿主的定殖和感染,还会导致被污染的加工设备与食物之间发生交叉感染。深入了解生物被膜形成背后的调控机制,有助于制定有针对性的策略,干扰其适应环境变化的过程,从而降低副溶血性弧菌对人类的危害。本文主要综述了鞭毛、菌毛和胞外的多糖等基质组分在生物被膜形成中的作用以及c-di-GMP和群体感应对生物被膜形成的调控。     

副溶血性弧菌分子标志基因研究概况

副溶血性弧菌是重要的食源性致病菌,其中,O3:K6血清型是1996年后导致多个国家多起食物中毒暴发的病原菌。中国1992-2001年的统计数据表明,由副溶血性弧菌引起的胃肠炎占由微生物引起的食源性疾病暴发的31.1%。副溶血性弧菌环境株大部分是非致病性的,而临床株则能产生耐热直接溶血素、耐热相关溶血素以及其它毒力因子。本文综述了3种重要的副溶血性弧菌的分子标志物,包括种特异性基因、毒力基因以及大流行菌群特异基因,旨在为研究者们针对性的选取基因开展快速检测副溶血性弧菌和鉴别其致病因子的研究提供参考依据。     

副溶血性弧菌食物中毒及腹泻菌株III型分泌系统的检测及分析

目的了解副溶血性弧菌食物中毒和临床腹泻株Ⅲ型分泌系统的分布以及耐药特征。方法对食物中毒和临床腹泻分离到的共21株副溶血性弧菌进行毒力基因tdh、trh、T3SS1、T3SS2α、T3SS2β和toxR检测,并用VITEK 2 compact全自动微生物鉴定系统进行了耐药性分析。结果 21株菌株中tdh+/trh-占90.48%(19/21),tdh-/trh+和tdh-/trh-分别占4.76%、4.76%,未检测到tdh+/trh+菌株。T3SS1广泛存在于所有菌株中。T3SS2α存在于tdh+/trh-菌株,T3SS2β存在于tdh-/trh+菌株。1株食物中毒菌株毒力基因携带情况为tdh-/trh-/T3SS2α-/T3SS2β-。21株副溶血性弧菌对阿莫西林、头孢吡肟、抗菌素B、庆大霉素、环丙沙星和复方新诺明敏感,对氨苄西林完全耐药。结论食物中毒和临床腹泻分离到的菌株大多携带tdh基因,T3SS2α与tdh相关,而T3SS2β则存在于trh+菌株。未携带tdh和trh基因的食物中毒分离株表明副溶血性弧菌不仅仅依赖TDH和TRH发挥毒力作用,其致病机制具有多样性和复杂性。     

响应面分析法优化副溶血性弧菌生长条件

通过单因素分析, 确定最适于副溶血性弧菌VPJ33生长的pH、温度和盐度。在此基础上, 综合考虑3个因素对VPJ33生长的影响, 用Design-Expert软件进行响应面分析, 优化VPJ33的培养条件得到了菌体生长模型, 以及取得模型最优值时各因素的水平。结果表明, VPJ33的最优培养条件为：pH 8.41、温度34.1℃和盐度2.47％; 菌体生长过程中, pH和盐度以及pH和温度对VPJ33生长的交互作用显著, 盐度和温度对VPJ33生长的交互作用不显著。菌体生长模型达到显著水平, 可以对VPJ33在不同条件下的生长情况进行分析和预测。     

副溶血性弧菌-霍乱弧菌混合生物被膜形成过程研究

【目的】研究副溶血性弧菌(Vibrioparahaemolyticus,VP)和霍乱弧菌(Vibriocholera,VC)混合生物被膜的形成过程。【方法】在4、8、12、24、36、48、60、72 h测定单独条件下VP、VC及其混合后生物被膜的形成情况,通过结晶紫染色法、平板菌落计数法、测定胞外多糖、胞外蛋白,通过荧光原位杂交(FISH)观察混合生物被膜形成。【结果】虽然形成的混合生物被膜量介于VC和VP之间,但混合生物被膜在形成过程中,成熟期后生物被膜量的变化较小,对环境的抗性增强。混合生物被膜中拥有更多的活菌,混合生物被膜形成过程中胞外蛋白和胞外多糖的变化体现出其可能在对抵御不适应环境中起重要作用,通过FISH可观察到不同时期生物被膜的变化过程。【结论】VC与VP共同形成生物被膜的过程中,混合生物被膜总量虽然减少,但混合生物被膜中拥有更多的活菌,这可能引起更大的危害。研究混合生物被膜形成过程中被膜的变化,可为有害生物被膜的控制提供基础。     

ToxR负调控副溶血弧菌中c-di-GMP的合成

副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)是世界范围内引起海产品相关食物中毒的主要致病菌,具有很强的生物膜形成能力。ToxR是一种膜结合调控蛋白,对副溶血弧菌生物膜形成具有一定的调控作用,但具体机制尚未见报道。c-di-GMP是一种普遍存在于细菌中重要的第二信使,参与调控细菌的多种生物学行为包括生物膜的形成。本文探究ToxR对副溶血弧菌中c-di-GMP代谢的调控作用。利用酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)测定副溶血弧菌野生株(wild-type,WT)和toxR突变株(ΔtoxR)中c-di-GMP水平的差异。挑选c-di-GMP代谢相关基因scrA、scrG和vpa0198为进一步研究的靶标,采用实时定量qPCR实验检测靶基因在WT和ΔtoxR中的转录水平差异;将靶基因调控区DNA序列克隆入pHRP309质粒中无启动子的β半乳糖苷酶基因上游,采用lacZ报告基因融合实验进一步研究ToxR对靶基因的转录调控关系;将重组质粒分别导入含有pBAD33或pBAD33-toxR的EC100lpir中,采用lacZ报告基因融合实验研究ToxR是否能在异体宿主中调控靶基因的表达;PCR扩增靶基因上游调控区DNA序列,并纯化His-ToxR蛋白,用凝胶阻滞实验(electrophoresis mobility shift assay,EMSA)研究His-ToxR与靶基因启动子区DNA序列是否具有结合作用。ELISA结果显示ΔtoxR中c-di-GMP含量显著性高于WT中的,说明ToxR抑制c-di-GMP的产生;实时定量qPCR结果表明WT中scrA、scrG和vpa0198的转录水平显著性高于ΔtoxR中的,表明ToxR抑制它们的转录;lacZ报告基因融合实验结果表明ToxR可抑制副溶血弧菌和EC100lpir中scrA、scrG和vpa0198的启动子区活性;EMSA实验显示His-ToxR能特异性地结合到scrA和scrG的上游调控区DNA序列上,而对vpa0198的上游调控区DNA序列无结合作用。综上所述,ToxR通过直接调控相关酶蛋白基因的转录来抑制副溶血弧菌内c-di-GMP的合成,从而有助于精确调控生物膜形成等细菌行为。     

H-NS蛋白对副溶血弧菌hcp1的转录调控

【目的】研究调控子H-NS对副溶血弧菌T6SS1结构蛋白基因hcp1的转录调控机制。【方法】利用Western blot检测Hcp1蛋白在野生株(WT)和hns基因敲除株(Δhns)中表达水平的差异。提取WT和Δhns的总RNA,采用实时定量RT-PCR的方法验证H-NS对hcp1的转录调控关系。进而采用引物延伸实验研究hcp1的转录起始位点,并根据产物的丰度判断H-NS对hcp1的调控关系。PCR扩增hcp1的整个启动子区DNA序列,并纯化His-H-NS蛋白,通过凝胶阻滞实验(EMSA)验证His-H-NS对hcp1启动子区是否具有直接的结合作用。【结果】Western blot和实时定量RT-PCR结果显示H-NS能抑制hcp1的表达;引物延伸结果显示hcp1只有一个转录起始位点T(–62)(翻译起始位点为+1),且其转录活性是H-NS和σ54依赖性的;EMSA实验表明H-NS对hcp1的启动子区具有直接的结合作用。【结论】H-NS能直接结合到hcp1启动子区而抑制其转录表达。     

基于RNA-Seq技术分析白藜芦醇对副溶血弧菌生物被膜的抑制作用

【目的】利用可食用植物素抑制致病菌生物被膜受到广泛的关注。本文研究分析白藜芦醇对水产品致病菌副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)生物被膜形成的影响及重要的调控基因。【方法】研究测定亚抑菌浓度白藜芦醇对V.parahaemolyticus生物被膜形成和胞外多糖分泌的影响,采用RNA-Seq技术分析白藜芦醇作用下V.parahaemolyticus基因表达水平变化,并利用荧光定量PCR方法验证部分差异表达基因。【结果】白藜芦醇对V.parahaemolyticus的最小抑菌浓度为20μg/m L,亚抑菌浓度5μg/m L和10μg/m L作用下能显著抑制该菌的生物被膜形成和胞外多糖产量(P0.05),扫描电镜观察发现细菌的粘附量和胞外分泌物显著减少。V.parahaemolyticus在10μg/m L白藜芦醇作用下共检测到106个基因表达量发生显著变化(P0.05),其中上调基因约占22.6%,下调基因约占77.4%。这些基因主要在7条代谢通路中被显著富集,其中外膜蛋白(W,Yed S,Omp K)、群体感应(Lux S)、鞭毛蛋白(Fla A)、菌毛蛋白(Pil Q)、溶血素分泌蛋白等14个调控基因可能与V.parahaemolyticus生物被膜有关,呈现显著下调表达。荧光定量PCR发现lux S、trh、tlh和fla A 4个基因在白藜芦醇作用后表现不同程度的显著下降,与转录组结果一致。【结论】白藜芦醇抑制V.parahaemolyticus生物被膜形成是一个多基因参与、多个生物过程协同调控的过程,其主要通过干扰V.parahaemolyticus新陈代谢过程、群体感应系统、膜蛋白分泌通路,抑制细胞的粘附和生物被膜形成。研究为揭示白藜芦醇抗生物被膜的分子机制提供参考。     

副溶血弧菌的毒力基因表达调控的分子机制

副溶血弧菌是革兰氏阴性嗜盐细菌,是海洋脊椎动物和无脊椎动物中主要致病菌,也是引起人类急性肠胃炎、败血症和坏死性筋膜炎等疾病的主要病原体。在过去,由副溶血弧菌引起的致病感染在世界范围内有不断增加的趋势。副溶血弧菌的致病性与其自身产生的多种毒力因子有关,这些毒力因子包括粘附因子、脂多糖、溶血素、III型分泌系统、VI型分泌系统、铁摄取系统、蛋白酶、外膜蛋白等。然而,这些毒力因子的表达都受到环境因子以及宿主体内信号因子的调控。副溶血弧菌通过感知外界生存环境的各种信号因子,从而激活体内不同的信号通路,进而诱导不同的毒力因子的表达。本文主要对副溶血弧菌毒力因子表达调控的分子机制进行综述,为更好地理解宿主与病原体的相互作用对副溶血弧菌的致病机制的影响,以及为今后预防和治疗由副溶血弧菌所引起的疾病提供理论参考。     

基于高通量共聚焦激光扫描显微镜方法定量分析副溶血性弧菌生物被膜结构

【目的】副溶血性弧菌是水产品中常见的食源性致病菌,生物被膜的形成对副溶血性弧菌的环境生存和传播至关重要。这项工作的目的是评估临床和环境中分离出的44株副溶血性弧菌菌株形成的生物被膜的结构多样性。【方法】该研究基于共聚焦激光扫描显微镜的高通量方法,使用与高分辨率成像兼容的96孔微量滴定板,结合结构分析软件ISA-2来研究生物被膜形成和结构,分析22株食品与22株临床来源的副溶血性弧菌菌株形成的生物被膜结构参数(生物体积、平均厚度、粗糙系数)。【结果】CLSM图像显示,44株副溶血性弧菌菌株在培养48h后能够形成3D结构,进一步比较分析了临床来源菌株与环境来源菌株形成的生物被膜结构异同,发现临床菌株生物被膜的变异系数比环境菌株生物被膜的变异系数小,且同时携带tdh和trh两种毒力因子的菌株生物被膜变异性最小。凝聚层次聚类分析结果显示,副溶血性弧菌生物被膜可以分为致密且表面光滑(39%)、斑驳且表面粗糙(27%)、疏松且表面坑洼(34%),临床菌株易形成致密且表面光滑和斑驳且表面粗糙的生物被膜,而环境菌株易形成致密且表面光滑和疏松且表面坑洼的生物被膜。【结论】该研究深入了解了副溶血性弧菌生物...     

副溶血性弧菌分泌系统在致病力中作用的研究进展

致病菌借助分泌系统将特异蛋白直接注入宿主细胞内,破坏宿主细胞内的多种信号通路,是导致细菌定殖和感染的有效途径。作为一种重要的食源性致病菌,副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)的Ⅲ型分泌系统(Type Ⅲ secretion system,T3SS)和Ⅵ型分泌系统(Type Ⅵ secretion system,T6SS)是其对宿主细胞产生致病性的重要因素。本文综述了副溶血性弧菌T3SS和T6SS效应物在致病力中的具体作用,以及相关调控机理,为进一步了解由副溶血性弧菌导致的病症,研究其致病机理以及寻找致病性靶标提供参考。