‘云香’水仙ACC合成酶基因NtACS1的克隆及遗传转化

为探究多花水仙ACS基因的序列特征及功能,以‘云香’水仙盛花期花瓣为试验材料,根据‘云香’水仙花朵转录组数据信息,通过RT-PCR方法克隆出1个ACS基因,命名为NtACS1(GenBank KX082936);NtACS1开放阅读框(ORF)长度为552bp,编码183个氨基酸。编码蛋白质分子量约为20.6KDa,理论等电点为6.30,不稳定系数为65.49,属于不稳定的疏水性蛋白。通过qRT-PCR对‘云香’水仙不同时期花瓣和副冠中的NtACS1基因进行了表达分析,得到与‘云香’水仙花朵转录组数据中相同的结果:NtACS1基因在‘云香’水仙花瓣和副冠中的表达都是随着花衰老过程呈现逐渐下降的趋势,且NtACS1基因在花瓣和副冠中的表达峰值都在花苞期,表明NtACS1基因编码的蛋白是在乙烯生物合成途径的系统1发挥催化作用的ACC合成酶。成功构建了NtACS1基因的正义植物表达载体,并通过农杆菌介导法获得8株转基因烟草,PCR和RT-PCR检测显示其中有6株为阳性植株,初步证实NtACS1基因已导入烟草基因组中且在烟草中已表达。该研究结果为进一步分析NtACS1基因的功能和后续转化水仙延长其花期研究奠定了基础。     

甘蔗ACC氧化酶基因片段的克隆与序列分析

1- 氨基环丙烷-1-羧酸（ACC）氧化酶是植物乙烯合成的一个关键酶,乙烯作为一种内源激素,对植物生长、老熟过程有多方面的调节作用。根据报道的各种植物ACC氧化酶氨基酸序列上前后两个保守区设计两个简并引物,以甘蔗总DNA为模板,通过PCR扩增到一个940bp的基因片段。将片段序列在MCBI的BLAST软件上进行同源性搜寻,显示的63个序列全部是ACC氧化酶基因,因而认为克隆到的片段就是甘蔗ACC氧化酶基因的一个成员。经对不同植物来源的ACC氧化酶基因家族进行比较分析,去除一个103bp的“内含子“后,推导的氨基酸序列为279个残基,占推测全长氨基酸残基总数的86％左右。经同源性分析,序列与毛竹和水稻ACC氧化酶的同源率达到86％。系统进化分析表明,该序列最先与水稻、其次和香蕉的ACC氧化酶聚类,然后再与双子叶植物的ACC氧化酶聚类,符合按形态特征分类的血缘关系。基因的获得对下一步了解乙烯的合成表达与甘蔗生长、成熟过程之间的关系奠定了基础。     

康乃馨ACC氧化酶cDNA的克隆及其反义植物表达载体的构建

以康乃馨（Dianthus caryophyllus L.)花瓣为材料,用改进的异硫氰酸胍一步法提取总RNA,根据已报道的康乃馨ACC氧化酶（1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid oxidase,CO)基因的序列设计产合成一对引物,通过RT-PCR方法获得一约1.2kb特异片段,把该片段连接pGEM^(R)-Teasy vector上进行测序,其全长共1156bp,编码区915bp。共编码304个氨基酸残基,序列分析结果表明该序列与GenBankL35152中的康乃馨ACC氧化酶基因的cDNA序列完全相符,推断该基因在康乃馨种内可能是完全或高度保守的,随 后将此片段反向插入植物表达载体pBI121的35S启动子和NOS终止子之间,构建了一反义植物表达载体pBO;又把花特异表达启动子PchsA插入pBI121的HindⅢ Xbal位点构建中间载体pGHB,再把康乃馨ACC氧化酶基因反向插入中间载体pCHB的XbaI Satl位点构建成另一反义植物表达载体pCBO。     

百合ACC氧化酶基因全长cDNA的克隆及序列分析

以亚洲百合Polyanna(Liliumspp.)花瓣为材料,根据已报道的百合ACC氧化酶基因片段设计1对末端扩增特异引物,采用RACE方法,获得百合ACC氧化酶基因的全长cDNA(GenBank登录号为EU296623).该cDNA全长1 152 bp,具有一个954 bp的开放阅读框,编码318个氨基酸.Blast搜索结果显示,百合ACC氧化酶基因核苷酸序列与其它植物已报道的ACC氧化酶基因具有71%~82%的相似性,氨基酸序列有70%~87%的相似性,聚类分析表明,与单子叶植物百合科郁金香首先聚类,其次与双子叶植物聚类,最后与单子叶禾本科和兰科植物聚类.     

鸭梨ACC氧化酶基因cDNA片段的克隆及农杆菌介导的反义遗传转化

研究根据ACC氧化酶基因的保守序列设计一对特异性引物。以鸭梨果实为试材,借助RT,PCR方法扩增得到一条长度为831bp的鸭梨ACC氧化酶基因eDNA片段,该片段编码276个氨基酸残基,与其它梨品种ACC氧化酶基因序列同源性均在94％以上。将此片段反向插入真核表达载体pBI121的CaMV35S启动子和NOS终止子之间,构建了鸭梨ACC氧化酶基因的反义表达载体．并在农杆菌LBA4404的介导下实现对鸭梨组培苗的遗传转化。经PCR鉴定证实共有4株鸭梨组培苗中外源基因得到成功转化,Southern杂交显示在这4株转基因鸭梨中除有1株外源基因呈双拷贝外,其余3株中外源基因均以单拷贝形式存在。     

甘蔗ACC氧化酶全长cDNA的克隆及序列分析

ACC氧化酶是高等植物乙烯生物合成途径中的限速酶。根据报道的植物ACC氧化酶基因序列设计特异引物,从甘蔗cDNA文库中克隆到一ACC氧化酶基因片段,命名为GZ-ACO,该基因长792bp,与甘蔗基因组文库中克隆的ACO基因片段仅18个碱基之差。根据该cDNA片段序列,设计两对末端扩增的特异引物,利用RACE-PCR技术,获得GZ-ACO片段的5′端和3′端序列。用VectorNTI7.0软件对三个序列进行拼接和分析,结果得到全长的甘蔗GZ-ACO氧化酶基因。GZ-ACOcDNA核苷酸序列长1307bp,具有一个972bp完整的读码框,启动子ATG位于126bp,终止子TAA位于1097bp,推导编码323个氨基酸。系统进化分析表明,GZ-ACO基因氨基酸序列与其它植物已报道的ACC氧化酶基因具有65%~86%的同源率,且与单子叶禾本科植物首先聚类,其次与单子叶芭蕉科、兰科植物聚类,最后与双子叶植物聚类,与植物形态的系统进化结果一致。该基因已在DDBJ/EMBL/GenBank基因数据库注册,注册号为AY521566。     

胆固醇氧化酶基因的克隆与表达

胆固醇是人体中主要的固醇类化合物,人体内胆固醇主要来源于自身的合成,也有一部分来自食物。胆固醇代谢和输送的异常往往与动脉粥样硬化相关联,能够引起心肌梗死、中风、动脉瘤和胆石症等疾病。胆固醇的一些代谢产物如类甾醇和类甾烷酮有致癌作用。所以检测血浆中和食物中胆固醇的含量在临床上具有重要的意义［１,２］。 胆固醇氧化酶可以和胆固醇脂酶和过氧化氢酶复合在一起,作为血浆总胆固醇含量的诊断试剂。也可将这３种酶固定在膜上,做成酶电极,这样使用起来更方便。胆固醇氧化酶能够降低食品中的胆固醇含量,也可以将胆固醇氧…     

丹参ACC氧化酶基因(SmACO1)的克隆与序列分析

依据丹参转录组数据库序列信息,采用RT-PCR和染色体步移技术从丹参中首次克隆得到ACC氧化酶基因,命名为SmACO1(GenBank注册号为JQ026111)。该基因gDNA序列长1 347 bp,由3个外显子和2个内含子组成;cDNA全长1 117 bp,包含945 bp的开放阅读框,编码314个氨基酸残基。生物信息学分析显示SmACO1为无信号肽与跨膜结构域,且定位于细胞质的稳定亲水蛋白,含有Fe²⁺依赖的加氧酶结构域。实时荧光定量PCR结果表明,SmACO1基因在丹参不同组织器官中差异表达,花中表达量最高;其表达受到病原菌和茉莉酸甲酯的诱导,表明SmACO1基因可能在植物防御反应中发挥作用。     

萼脊兰ACC氧化酶基因片段的克隆及其反义基因表达载体的构建

根据已报道的几种不同属的兰科植物ACO基因序列,设计并合成了一对特异引物,以萼脊兰的基因组DNA为模板,用PCR扩增方法克隆出萼脊兰ACO基因的部分片段,将其连接到pMD19-T质粒载体上进行测序.结果显示,该片段的长度为333 bp,序列和蝴蝶兰(Phalaenopsis hybrid)、卡特兰(Cattleya intermedia)、两棱蕾丽兰(Laelia anceps)的相应ACO片段的同源性分别达到达到99.7%、92.49%和92.19%;和大花蕙兰(Cymbidium hybrid)、石斛兰(Dendrobium crumenatum)的同源性分别是89.49%和89.19%.将此片段反向插入植物表达载体pBI221的CaMV35S启动子和NOS终止子之间,成功构建了萼脊兰ACO的反义基因植物表达载体pBI-antiACO.     

‘云香’水仙NtWRKYY2基因的克隆及功能分析

以‘云香’水仙为材料,采用PCR技术分离中国水仙WRKY转录因子家族成员NtWRKYY2(GenBank登录号为KX056496),其开放阅读框(ORF)长度为867bp,编码289个氨基酸。氨基酸序列比对及系统进化树分析显示,NtWRKYY2编码蛋白含1个WRKY结构域和C2H2锌指结构(Csx4Cx23HxH),属于第Ⅱd类WRKY转录因子。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析显示,NtWRKYY2在‘云香’水仙应对盐胁迫中显著上调表达。利用InFusion克隆技术成功构建过表达载体pMDC140-NtWRKYY2,并采用农杆菌介导叶盘法转化烟草,获得11株卡那霉素抗性植株,转化子进一步PCR检测结果显示,其中有8株目的基因已成功导入烟草基因组中,转化率为72%。盐胁迫处理和叶绿素荧光参数分析显示,盐胁迫处理后NtWRKYY2过表达的转基因烟草萎蔫和黄化程度小于野生型植株,Fv/Fm值下降幅度小于野生型植株。研究表明,NtWRKYY2过表达的转基因烟草具有抵抗盐胁迫的能力。该研究为水仙抗盐转基因育种提供备选目的基因。     

牡丹ACC合成酶ACS1基因的克隆与原核表达

从牡丹‘洛阳红’(Paeonia suffruticosa‘ Luo Yang Hong’)花瓣中提取总RNA,根据GenBank上牡丹ACC合成酶基因PsACS的序列设计引物,通过RT-PCR获得牡丹PsACS1基因序列,包含一个1 479 bp的开放阅读框,编码492个氨基酸.将PsACS1基因cDNA片段与pET28a(+)构建原核表达载体pET-ACS1,转化大肠杆菌E.coli BL21 (DE3).0.4 mmol/LIPTG诱导3h后,在预期的蛋白分子量55 kD处出现1条表达加强的蛋白条带.为进一步目的蛋白的纯化和鉴定提供试验基础.     

甜瓜ACC氧化酶反义基因植物表达载体的构建及转化烟草的研究

用限制性内切酶从目的基因供体质粒pBI-aACO1上切下大小约2．3kb的目的基因,将其定向连接在受体质粒pCAMBIA2301载体上,构建成含有GUS基因的甜瓜ACC钣化酶反义基因植物表达载体pCB-aACO1。采用直接转化法将pCB-aACO1导入根癌农杆菌菌株EHA105,并用新构建的工程菌对普通烟草进行了遗传转化研究。在Kanamycin选择压力下获得的烟草转化不定芽和完整植株,经过GUS基因组织化学法检测以及PCR方法鉴定,证实了该反义基因已导入烟草基因组中,此项研究为下一阶段用该反义基因转化甜瓜品种以改良甜瓜果实耐贮运性打下基础。     

花椰菜ACC氧化酶基因的克隆及其RNAi对内源基因表达的抑制作用

根据亲缘关系较近的几种作物ACC氧化酶氨基酸序列,设计一对简并引物,从花椰菜(Brassica oleracea var．botrytis)基因组中获得长1202bp的候选片段。序列分析表明该基因含有3个外显子(Exon)、2个内含子(Intron),编码区序列长756bp,编码252个氨基酸。同源性分析发现其与青花菜(Brassica oleracea var．Italica)上已发表mRNA序列同源率为99％(GenBank序列号：X81629),推断该基因为花椰菜ACC氧化酶基因,命名为BoACO(GenBank登录号：AY676466)。在此基础上,用BP克隆的方法构建BoACO的RNA干涉(RNAi)载体pHBACO,对花椰菜进行遗传转化,获得卡那霉素抗性转化植株5棵,分子检测证实外源片段成功导入其中3棵花椰菜基因组中。Northern杂交分析显示：转基因植株内源ACO基因转录的mRNA被降解。ACC氧化酶活性分析进一步表明,外源基因的导人大大地降低了ACC氧化酶活性。     

向日葵ACC氧化酶基因(HaACO1)的克隆及表达分析

目的:克隆向日葵中的ACC氧化酶基因(HaACO1),并对其进行生物信息学分析及盐胁迫表达分析,为理解向日葵ACC氧化酶生理功能并加强对ACO基因的利用奠定基础。方法:以前期从盐胁迫的内葵杂4号根中获得的ACC氧化酶基因片段4-4-7TDF(KM823963)为基础,通过RT-PCR和5'/3'RACE技术克隆ACO基因的全长cDNA序列,利用生物信息学软件对获得的cDNA序列及编码的蛋白质序列进行分析。同时采用PCR方法克隆基因组DNA(genemic DNA,gDNA)序列,并对其进行结构分析。利用实时荧光定量PCR分析Na Cl胁迫下向日葵根、下胚轴、叶中HaACO1的表达量和不同NaCl浓度及不同胁迫时间下根中Ha ACO1的表达量。结果:Ha ACO1的cDNA序列全长为1 135bp,其开放阅读框为942bp,编码313个氨基酸。预测其分子质量和等电点分别为35.84k Da和5.13,基因登录号为KP966508。HaACO1与已报道的多种植物的ACO基因核苷酸序列及其推导的氨基酸序列有较高的相似性,分别为76%~83%和77%~88%。gDNA起始密码子至终止密码子序列长1 018bp,包含2个外显子和1个内含子,基因登录号为KP988289。实时荧光定量PCR分析表明向日葵HaACO1在不同器官及不同NaCl浓度、不同时间诱导下存在特异性表达差异。结论:获得的向日葵HaACO1是植物ACO家族成员之一,该基因应答盐胁迫具有独特的表达模式。     

‘云香’水仙NtNAC2基因的克隆及功能分析

该研究选用多花水仙新品种‘云香’为材料,采用RT PCR技术克隆得到NtNAC2,其开放阅读框为936 bp,编码311个氨基酸。生物信息学分析显示,NtNAC2在N端含有NAM保守结构域,与单子叶植物芦笋、番红花和石斛等具有较近的进化关系。实时荧光定量检测显示,花瓣和副冠中NtNAC2基因的表达量随花器官发育逐渐上升,衰败期达到峰值;在ABA、MeJA、SA、H₂O₂、50 ℃、NaCl和PEG胁迫处理下,水仙根和叶中NtNAC2基因的表达量上调,且表现出时空表达特异性。为进一步鉴定其功能,构建植物表达载体转化烟草,获得10株转基因烟草,经半定量RT PCR检测NtNAC2在转基因植株中过表达。高盐和干旱胁迫处理后转基因植株根长为野生型的2~3倍,叶片失水率低于30%,存活率高于60%。研究表明,‘云香’水仙NtNAC2的过量表达提高了转基因烟草的抗旱性和耐盐性,可作为水仙抗逆分子育种的重要候选基因。     

菠菜乙醇酸氧化酶基因的克隆及表达

采用RT-PCR技术从菠菜总RNA中分离扩增了乙醇酸氧化酶（GO）基因的cDNA序列,首先克隆到质粒pMD18T,进行了测序。然后将乙醇酸氧化酶的cDNA分别亚克隆至质粒pThioHisC、 pTIGTrx、pBV220和pET-2b(+),分别转化大肠杆菌DH5α和BL21（DE3）,并对重组乙醇酸氧化酶在大肠杆菌中的表达进行了研究。SDSPAGE和酶活分析表明,菠菜乙醇酸氧化酶在E.coli BL21 (DE3) （pTIGTrxGO）和E.coli BL21(DE3) （pET-22b(+)GO）里得到了高水平的表达,其中E.coli BL21(DE3) （pET-22b(+)GO）的乙醇酸氧化酶活性较高。     

‘云香’水仙NtWRKYY1基因的分离与功能分析

为明确WRKY转录因子在‘云香’水仙中的功能,该研究以‘云香’水仙为材料,克隆了WRKY基因,命名为NtWRKYY1(GenBank登录号为KX056495)。序列分析显示,NtWRKYY1基因开放阅读框(ORF)长度为510bp,编码169个氨基酸。多序列比对和系统进化树分析显示,NtWRKYY1编码蛋白含1个WRKY结构域和C2H2锌指结构(Cx4Cx23HxH),与AtWRKY57聚在一起,属于第Ⅱc类WRKY转录因子。组织表达和时空表达分析显示,NtWRKYY1基因在花中表达量高于根和叶,且在花瓣及副冠中的表达量随开花过程(花蕾期、始花期、盛花期、衰败期)呈上升趋势。植物激素和非生物胁迫分析显示,NtWRKYY1基因受脱落酸(ABA)、高温、干旱和盐诱导,受茉莉酸甲酯(JA)抑制,表明NtWRKYY1基因可能在‘云香’水仙花朵的衰老过程中起正调节作用,同时参与‘云香’水仙ABA、JA等激素信号转导及高温、干旱、盐碱等非生物胁迫过程的调控。利用In-Fusion克隆技术成功构建过表达载体pMDC140-NtWRKYY1,并采用农杆菌介导叶盘法转化烟草。RT-PCR和GUS染色结果显示,目的基因已成功导入烟草基因组中。     

全雌系苦瓜ACC氧化酶基因cDNA克隆及序列分析

为研究1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶(ACC氧化酶,ACO)基因在苦瓜性别分化中的作用,以全雌系苦瓜‘X-Hei-d-d’花蕾为试材,采用RT-PCR和RACE技术获得了ACC氧化酶基因(Mc-ACO1)的全长cDNA序列。该序列为1 137 bp(GenBank登录号:FJ459813),其完整开放阅读框长1 005 bp,编码334个氨基酸,预测分子量为37.30 kD,肽链N端缺失ACOs家族典型的1个保守区和2个保守二价铁离子/抗坏血酸依赖型双加氧酶氨基酸残基。序列分析表明,植物ACO基因的演化与其来源植物亲缘关系的一致性较高;与其他物种相比,苦瓜Mc-ACO1不同的氨基酸序列主要表现在肽链N端;苦瓜Mc-ACO1应属于黄瓜Cs-ACO2类成员,功能可能与性别分化相关。     

玉米亚硫酸氧化酶基因的克隆及其结构与表达分析

为明确亚硫酸氧化酶(sulfite oxidase,SO)基因的结构特征和进化关系及其在玉米不同组织器官发育过程中的表达和分布特性,采用RACE技术克隆了玉米SO基因(ZmSO)的全长cDNA。序列分析表明,获得的ZmSO全长1 492bp,其中5′-UTR 160bp,3′-UTR 138bp,开放阅读框为1 194bp,编码397个氨基酸组成的蛋白质。对该基因编码氨基酸保守结构域的分析发现,ZmSO包含1个钼辅因子结合域、1个自身二聚化域和1个过氧化物体靶信号序列。系统进化分析显示,SO在进化上较为保守,玉米与其它植物的SO相似性较高。荧光定量RT-PCR分析表明,在玉米成株期,根、茎、叶、雄花和幼穗中,ZmSO在根部表达丰度最低,在叶片和幼穗中表达量较高。酶活性测定结果显示,不同器官中SO活性与其mRNA转录水平上的表达趋势相似。     

鸭梨ＡＣＣ 氧化酶基因ｃＤＮＡ 片段的克隆及农杆菌介导的反义遗传转化

研究根据ACC氧化酶基因的保守序列设计一对特异性引物,以鸭梨果实为试材,借助RT PCR方法扩增得到一条长度为831bp的鸭梨ACC氧化酶基因cDNA片段,该片段编码276个氨基酸残基,与其它梨品种ACC氧化酶基因序列同源性均在94%以上。将此片段反向插入真核表达载体pBI121的CaMV 35S启动子和NOS终止子之间,构建了鸭梨ACC氧化酶基因的反义表达载体,并在农杆菌LBA4404的介导下实现对鸭梨组培苗的遗传转化。经PCR鉴定证实共有4株鸭梨组培苗中外源基因得到成功转化,Southern杂交显示在这4株转基因鸭梨中除有1株外源基因呈双拷贝外,其余3株中外源基因均以单拷贝形式存在。