615系小鼠可移植性肝癌组织中不依赖于cAMP的蛋白激酶研究

作者对H₆₁₅(原发性)和H₂₂(OAAT诱发)肝癌组织中不依赖于cAMP的蛋白激酶进行了研究,发现当以内源性蛋白为底物时,H₆₁₅和H₂₂组织中的酶活力分别是正常肝脏的3.10和2.44倍。以脱磷卵黄高磷蛋白和鱼精蛋白为底物时,肿瘤组织的酶活力是正常肝脏的1.5—4.45倍。研究结果表明,不依赖于cAMP的蛋白激酶活力升高与癌变和癌恶性状态的维持有密切联系。     

DNA末端定量及其应用的研究

为定量DNA断裂末端评价DNA的降解程度,以饱和标记(TdT)法定量DNA末端最大标记量(L_max);并用流式细胞分析(FCA)、原位DNA末端标记(TUNEL)和琼脂糖电泳检测或标记DNA降解片段.结果发现: a.TdT法最低检测限5 ng DNA,线性范围为5～5 000 ng,较检测DNA降解片段的琼脂糖电泳敏感200倍以上;b.地塞米松(DEX)诱导淋巴瘤(Raji)细胞凋亡产生的L_max呈DEX剂量与诱导时间依赖性增加;c.自发性高血压大鼠(SHR)心肌的L_max呈年龄依赖性增加并与正常对照鼠(WKY)相比差异非常显著(P＜0.01);d.TdT法定量L_max与FCA、TUNEL或电泳分析的相关性良好(r＞0.98).TdT法定量L_max敏感、特异、准确,可应用于分子生物学、细胞生物学,尤其是细胞凋亡动力学DNA降解评价的定量研究.     

pH-比色法测定CaATPase活力

基于ATP被酶水解后H⁺生成的速度作为酶活力的指标,在560um波长和pH7.4,以酚红作指示剂,建立了pH-比色测定肌浆网CaATPase(Ca²⁺,Mg²⁺-ATPase)活力的分光光度法。方法简易,可观察反应进行的过程。SR CaATPase对底物ATP的K_m=97.4μmol/L;在22—42℃间求得活化能(E_Ca)=20.40千卡。用本法初步观察了汉防己甲素(简称汉甲)对酶的抑制作用。     

全染料染色法测定末端脱氧核苷酰转移酶活力

介绍一种末端脱氧核苷酰转移酶活力测定的新方法.利用全染料(stains－all)对单链寡聚核苷酸片段灵敏度较高的特点,建立了电泳─全染料染色法测定TdT酶活力,TdT酶促加长的寡聚核苷酸片段样本,经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离、全染料染色后即可根据寡聚核苷酸片段的泳动距离推算TdT酶活力.此法所用试剂便宜,操作简便,无需大型仪器及灵敏度较高,适用于临床上白血病患者白细胞中TdT酶活力的半定量检测及基因工程中TdT工具酶活力的测定.     

过氧化氢酶-无机杂化纳米花的制备及催化特性

过氧化氢酶(catalase,CAT)是一种在食品、医疗、纺织等领域广泛应用的工业酶,具有催化效率高、专一性强、绿色环保等突出特点。工业中游离过氧化氢酶无法回收再利用,导致以其为核心的工业生物转化过程成本较高。开发一种简单、温和、低成本并且体现绿色化学理念的方法对过氧化氢酶进行固定化有望提高其利用率并且强化酶学性能,具有迫切的现实需求。本研究将源自枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)168的过氧化氢酶KatA在大肠杆菌中进行重组表达,之后将分离纯化得到的纯酶以酶-无机杂化纳米花形式制备成固定化酶并进行酶学性质研究。结果显示,利用乙醇沉淀、DEAE阴离子交换层析、疏水层析3步纯化,最终获得电泳纯的重组KatA,之后通过优化制备条件获得了一种新型KatA/Ca₃(PO₄)₂杂化纳米花固定化酶。酶学性质研究结果显示,游离酶KatA的最适反应温度为35℃,KatA/Ca₃(PO₄)₂杂化纳米花的最适反应温度为30−35℃,二者最适反应pH值均为11.0。游离酶KatA和KatA/Ca₃(PO₄)₂杂化纳米花在pH4.0−11.0和25−50℃条件下均表现出较好的稳定性。KatA/Ca₃(PO₄)₂杂化纳米花显示出比游离酶KatA更好的储存稳定性,在4℃储存14d后仍保留82%的酶活力,而游离酶仅具有50%的酶活力。此外,纳米花在进行5次催化反应后仍具有55%的酶活力,表明其具有较好的操作稳定性。动力学研究结果显示,游离酶KatA对底物过氧化氢的K_m为(8.80±0.42)mmol/L,k_cat/K_m为(13151.53±299.19)L/(mmol·s);而KatA/Ca₃(PO₄)₂杂化纳米花的K_m为(32.75±2.96)mmol/L,k_cat/K_m为(4550.67±107.51)L/(mmol·s)。与游离酶KatA相比,KatA/Ca₃(PO₄)₂杂化纳米花对底物过氧化氢的亲和力下降,同时其催化效率也有所降低。综上所述,本研究以Ca²⁺作为自组装诱导剂,成功将KatA以酶-无机杂化纳米花形式制备成固定化酶,不仅对部分酶学性能实现了强化,而且为固定化过氧化氢酶的绿色制备和规模化应用奠定了基础。     

栓菌漆酶在毕赤酵母中高效表达及重组酶的性质

栓菌420（Trametes sp. 420）漆酶基因lacD以两种方式在巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）进行异源表达,产生两种重组漆酶：rLacDx（具有天然N-末端）和rLacDe（N-末端带有8个额外的氨基酸残基）。摇瓶发酵18d,rLacDx和rLacDe的产量分别为1.21×10⁵u/L、7.38×10⁴u/L ［以2,2′-连氮-3-乙苯-二噻唑-6磺酸（ABTS）为底物］。在高密度发酵条件下,rLacDx的产量增加到2.39×10⁵u/L,同时其生产周期降至7.5 d。两种重组酶对愈创木酚底物的氧化特性相似,且在50℃和pH3～10的范围内均稳定。然而,rLacDx对底物ABTS的比活力（1761u/mg）高于rLacDe （1122u/mg）,其表观K_m值(427μmol/L)低于rLacDe (604μmol/L)。     

应用T/A策略克隆乙肝病毒pC/C及C基因

以克隆乙型肝炎病毒pC/C及C基因为例,报道了在DNA重组中,当目的基因与载体末端不匹配时可采取的一新方法.用内切酶切取的基因片段为平端时,可在含dATP的反应体系中,用Taq酶的末端转移酶活性在其3′末端加上单个碱基(dA)的突出尾;基因片段为3′凹端时,可在含4种dNTP的体系中,利用Taq酶的聚合酶活性先将其末端补平,再经末端转移酶活性在其3′末端加dA尾;末端经此修饰的基因片段可亚克隆至T载体中,再克隆于其他表达载体中.     

尿微量白蛋白ELISA测定法最适条件的探讨

用自制兔抗人白蛋白抗体;酶标抗原和进口NUNC板, 进行了两种显色剂邻苯二胺(OPD)及四甲基联苯胺(TMB)测定尿微量白蛋白的比较,底物(H₂O₂)浓度对测定的影响,碳酸钠和戊二醛两种包被方法的比较,以及抗体和抗原浓度的选择等影响因素进行了实验探讨,并确定了本实验的最佳分析条件.     

嗜热古菌Infirmifilum uzonense来源的双功能高温β-葡萄糖苷酶IuBgl3的原核表达及酶学性质分析

β-葡萄糖苷酶在食品、医药、生物质转化等领域具有重要的应用价值,因此发掘适应性强、性质优良的β-葡萄糖苷酶是国内外研究热点。本研究从嗜热古菌Infirmifilum uzonense中成功克隆出一个GH3家族的β-葡萄糖苷酶基因,命名为Iubgl3。基因序列分析显示Iubgl3全长为2109bp,编码702个氨基酸,理论分子量为77.0kDa。将该基因在大肠杆菌中进行克隆表达并对纯化后的IuBgl3进行酶学性质研究。结果显示,重组酶IuBgl3最适pH5.0,最适温度85℃。该酶具有良好的热稳定性,80℃处理2h后仍能保持85%以上的酶活力。其具有优良的pH稳定性,在pH4.0−11.0范围内处理1h,仍维持85%以上的酶活力。通过底物特异性测定发现,该酶对对硝基苯-β-d-吡喃葡萄糖苷(p-nitrophenylβ-d-glucoside,pNPG)和对硝基苯-β-d-吡喃木糖苷(p-nitrophenyl β-d-xylopyranoside,pNPX)均有很高的水解能力,是典型的双功能酶。以pNPG为底物时的动力学参数K_m和V_max分别为0.38mmol和248.55μmol/(mg·min),催化效率k_cat/K_m=6149.20s⁻¹mmol⁻¹。大多数金属离子对IuBgl3的酶活力没有显著影响,SDS可导致酶完全失活,而EDTA却能提高30%的酶活力。本研究丰富了高温古菌GH3家族的β-葡萄糖苷酶基因,获得了一个稳定性优良的高温酸性双功能酶,具有良好的工业应用前景。     

新冠病毒主蛋白酶特异性荧光底物ddRFP-M的制备与鉴定

传统的新冠病毒主蛋白酶(main protease, Mpro)多肽底物具有制备成本高、稳定性差和合成工艺复杂等缺点,积极开发廉价稳定的新型底物具有重要意义。本研究基于二聚化红色荧光蛋白(dimerization-dependent red fluorescent protein, ddRFP)原理,以AVLQS为连接肽,利用基因工程技术制备Mpro特异性荧光底物ddRFP-M,用于Mpro抑制剂的药理活性评价。将连接肽基因插入到密码子优化的RFP-A₁与RFP-B₁基因之间,构建ddRFP-M基因,再将其克隆到pET-28a载体中构建重组质粒。将重组质粒转化至大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞中,以卡那霉素抗性法筛选重组子。重组子经低温诱导后,在大肠杆菌中进行荧光底物ddRFP-M的可溶表达,并以HisTrap^TM层析柱进行分离纯化。以荧光动力学检测法和电泳法测定ddRFP-M的底物特异性,并利用荧光底物ddRFP-M评价恩赛特韦和黄芩素的药理活性。结果显示,荧光底物ddRFP-M在大肠杆菌中呈可溶表达并成功进行了分离纯化,其具有良好的底物特异性、灵敏性和可靠性。新冠病毒Mpro特异性荧光底物ddRFP-M的制备,为新冠病毒Mpro抑制剂的药理活性评价奠定了基础。     

高温放线菌V4菌株热稳定β-淀粉酶的产生及其性质的研究

高温放线菌V₄菌株(Thermoactinomyces sp.V₄)产生的β－淀粉酶最适反应温度为70℃,最适pH为6,酶的热稳定性良好,50℃(4h)不失去酶活力,55℃(2h)保持最初活力的92％,酶对可溶性淀粉的水解率达77％,纸层析结果显示水解产物主要为麦芽糖,经旋光测定,水解产物具有β－构型。巯基抑制剂对此β－淀粉酶无抑制作用。V₄菌株同时产生异淀粉酶及少量的－菌一淀粉酶。     

竹红菌乙素作猝灭剂研究Fo构象方法的建立

线粒体F₁F_o复合体F_o部分a亚基的色氨酸荧光可被竹红菌乙素(hypocrellin B, HB)猝灭.不同温度下测定Stern-Volmer图的结果显示,猝灭常数(K_sv)随温度的增加而加大,时间衰变荧光的结果显示,荧光寿命随HB浓度的增加而减小,加入不同浓度的HB, F₁F_o复合体的吸收峰没有位移.这些实验结果支持动态猝灭机理.HB还具有有效猝灭浓度低,不影响酶的活力;在脂相和水相的分布比率可高达16 560∶1;实验操作简便等优点.因此HB可作为理想的疏水相荧光猝灭剂,研究与膜结合的F₁F_o复合体中镶嵌于膜脂内F_o的构象变化.     

反胶团中脂肪酶催化性能的研究

研究了皱褶假丝酵母脂肪酶在AOT／异辛烷反胶团中催化橄榄油水解的性能。发现在25℃,pH7．G,R=[H₂O]／[AOT]：lO的条件下,脂肪酶的活力最高。腊肪酶在含水量较低的反胶团中较稳定,当R=5．4,于33℃保存12 h,活力可保持89％,底物浓度高达50％(v／V)时仍无抑制;当“水池”内存在40mmol／L的Gu²⁺、Co²⁺、Mn²⁺等金属离子时对酶仅有少许抑制。     

Mg2＋对阿霉素引起心肌线粒体F1F0变化的保护

抗肿瘤药物阿霉素(ADM)对心肌线粒体F₁F₀-复合体呈现抑制而对F₁-ATPase无抑制,这表明ADM可能是通过膜脂起作用的,适当浓度Mg²⁺能降低ADM对复合体的抑制.经 ³¹P-NMR和标记荧光探针NBD-PE,DPH,MC-540以及内源荧光等的测定,结果表明ADM可能首先通过诱导F₁F₀膜脂形成非双层脂结构,继而影响了膜脂的堆积程度和流动性,进而引起F₁F₀-复合体酶蛋白构象的改变,最终导致酶活力的降低.Mg^2＋则可能由于与ADM竞争与心磷脂的结合,而对ADM引起F₁F₀的变化产生保护作用.     

融合双亲短肽提高腈水合酶的热稳定性研究

腈水合酶(Nitirle hydratase, NHase)催化腈类物质转化为酰胺类物质,目前用于工业生产丙烯酰胺。但在催化过程中释放的热量易导致酶分子失活。研究通过蛋白质融合技术对腈水合酶进行分子改造,提高热稳定性。将2种双亲自组装肽（self-assembling peptides, SAPs）EAK16和ELK16分别融合至恶臭假单胞菌Pseudomonas putida NRRL-18668来源NHase非催化亚基β的N末端,构建出2种融合型NHase：EAK16-NHase和ELK16-NHase。经过表达、纯化后测定酶活力,发现EAK16-NHase和ELK16 NHase的酶活力分别为(426±14) U/mg和(372±12) U/mg,保留野生型酶活力的97%和85%。在50 ℃条件下孵育0~60 min,每5 min取样后测定残存酶活力,EAK16-NHase和ELK16-NHase酶活力半衰期（T₅₀）分别为35 min和40 min,野生型NHase为20 min。说明融合EAK16和ELK16均能提高NHase的热稳定性。研究表明融合SAPs能在不显著影响酶活力的条件下提高酶的热稳定性。     

细菌3-脱氧葡糖醛酮代谢酶的纯化及性质研究

细菌Bacillus sp.2粗酶液通过(NH₄)₂SO₄分级分离、Q Sepharose FF、Sephadex G-100(Ⅰ)、Hydroxyapatite和Sephadex G-100(Ⅱ)柱层析分离,纯化了一种以NADPH为辅酶的3-脱氧葡糖醛酮(3-DG)代谢酶,定性为2-羰基醛还原酶.纯化酶的比活力为63.75 U/mg,在SDS-聚丙烯酰胺凝胶上显示一条蛋白质带.该酶分子质量约为32 ku,酶反应最适pH约为6.2, 在pH 5～8, 温度25～30℃之间酶保持稳定;该酶对3-DG的K_m为2.3 mmol/L.添加适量的EDTA、巯基乙醇或二硫苏糖醇能明显提高酶的活性;而碘乙酸、N-乙基顺丁烯二酰亚胺抑制酶的活性.     

抗组织型纤溶酶原激活剂(tPA)单克隆抗体的制备和鉴定

用从人黑色素瘤细胞培液中提纯的tPA为抗原,通过杂交瘤技术获得TA₁,TA₂、TA₃和TA₄ 4株阳性杂交瘤细胞。经葡萄球菌A蛋白(SPA)亲和层析纯化抗tPA单克隆抗体(tPA．McAb)。固相酶联免疫吸附测定(ELISA)诱生含McAb的小鼠腹水,其效价达I：1O⁵。这些tPA McAb均属IgG₁亚型,特异地作用于tPA(包括基因工程生产的rtPA),与尿激酶(uK)无反应。用底物显色法测定表明所有tPA McAb均可抑制tPA的活性。     

Ca2＋对蝮蛇蛇毒溶血毒素构象的影响

利用荧光光谱学对BPLA₂和Ca^2＋相互作用的研究表明,Ca^2＋在BPLA₂中十分重要.在Ca^2＋存在时,底物与BPLA₂的结合使酶中色氨酸残基周围的环境变得较为疏水,荧光发射谱蓝移达9nm,而无Ca^2＋存在时却无此现象发生;实验证明BPLA₂分子中有一较强的疏水区,Ca^2＋可明显增强这一区域的疏水性;另外,我们还发现Ca^2＋与酶的结合与酶中唯一的His残基有关.     

植物细胞离析酶的制备和应用

用 Aspergillus sp．A-19菌经固体发酵研制成一种新的植物细胞离析酶(SeparatasezA—P)。其离析单细胞的酶活力平均为70 767u／g,有效作用的pH在3．0—7．0,温度为20—45℃。发酵培养基配方是麸皮：桔皮粉：(NH₄)₂SO₄(w／w)为100:100:O．63,料水比为1 :2．0,培养适宜条件为25℃、60小时。     

蜜环菌胞外漆酶的合成、纯化及性质研究

研究了蜜环菌胞外漆酶合成条件和酶学性质。实验表明,培养基初始pH5.5、培养温度25℃有利于菌株产酶;与麦芽糖、山梨糖和半乳糖相比,纤维二糖和棉子糖作为碳源时漆酶产量更高;有机氮源比无机氮源有利于漆酶合成。泥炭提取液可显著诱导漆酶生成,当其含量为50%时,菌株漆酶最高产量是对照组的7倍。在蜜环菌发酵上清液中检测到3个漆酶同功酶组分,其主要活性（约占75%）组份漆酶A经 (NH₄)₂SO₄沉淀、制备级PAGE电泳和阴离子交换柱层析被分离纯化至电泳均一,SDSPAGE法测得酶亚基分子量59kD,凝胶过滤色谱法测定活性酶分子量58kD。纯化的漆酶A等电点pI为4.0,氧化愈创木酚的最适反应pH为5.6,最适温度为60℃,在60℃和65℃时半衰期分别为45min和36.8min,在pH5.2～7.2范围内稳定性较好。100mmol/L Cl^-对该酶有显著抑制作用,1mmol/L SO^2-₄ 对漆酶有激活作用,1mmol/L NaN₃可完全抑制酶活性,10 mmol/L EDTA对漆酶活没有明显影响,1mmol/L Cu²⁺对漆酶有激活作用。以愈创木酚为底物时,测得酶的K_m=1.026mmol/L,V_max=5μmol/(min·mg);以ABTS为底物时,测得其K_m=0.22mmol/L,V_max=69μmol/(min·mg)。