大肠杆菌发酵生产重组人源抗-HBs Fab

在KLF2000发酵罐中利用补料分批培养技术培养表达含重组质粒pBAD/HBs Fab的TOP10大肠杆菌,生产人源抗-HBs Fab,为批量生产作准备,在发酵过程中,控制溶氧30%以上,温度37℃,在基础培养基内生长4h后,补加以甘油为碳源的补料,继续生长到9h,加入阿拉伯糖,至终浓度为0.02%,30℃诱导表达5h,收集菌体,纯化制备目的蛋白。利用Western blot方法检测Fab抗原性,Dot blot方法检测生物学活性。14h发酵结束后,菌体密度最终达96g/L,纯化所得蛋白大约占菌体总蛋白的6%,含量为80mg/L,以重组质粒pBAD/HBs Fab,大肠杆菌TOP10表达表达比率与摇瓶相比没有降低,表达量达80mg/L左右,为大批量生产作了准备。     

大肠杆菌发酵生产重组人颗粒溶素

目的:在FUS-50L生物反应器中利用补料分批培养技术培养表达含重组质粒pET28a( )-GNLY的大肠杆菌BL21(DE3)pLysS株,生产重组颗粒溶素(GNLY)。方法:选取含pET28a( )-GNLY的BL21(DE3)pLysS菌株单个克隆分级培养,将制备的二级种子液接种于发酵罐中。在发酵过程中,控制溶氧为30%～50%,温度为37℃;在基础培养基内生长4h后,补加以甘油为碳源的补料,继续生长到11h;加入葡萄糖至终浓度为1%,30℃诱导表达6h;收集菌体,纯化制备目的蛋白。利用Western印迹检测重组蛋白的抗原性,用CFU方法检测其生物学活性。结果:发酵液中最终菌体密度达80g/L;纯化所得重组蛋白约占菌体总蛋白的5%,含量为60mg/L;经鉴定所获重组颗粒溶素有较好的免疫学活性和生物学活性。结论:用含重组质粒pET28a( )-GNLY的大肠杆菌BL21(DE3)pLysS表达系统,可得到具有生物活性的重组颗粒溶素,为大批量生产提供了条件。     

高密度培养重组大肠杆菌发酵生产胆固醇氧化酶的策略

以重组大肠杆菌发酵生产胆固醇氧化酶,依据溶解氧的变化控制底物的流加速率,实现了重组大肠杆菌的高密度培养,最高密度达85（OD600）。在此基础上确定了最佳的诱导时机为发酵中期,菌体产酶水平达5830．6tJ／L,产酶速率为971．77U·L^-1·h^-1,生产强度为388．71U·L^-1·h^-1,实现了胆固醇氧化酶的高效生产。     

用重组大肠杆菌发酵生产人生长激素研究

通过不同培养基、不同糖浓度对重组菌Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ１０Ｂ／ｐＩＮⅢＡ３ＨＧＨ的菌体生长与外源蛋白表达量的影响的比较，确定较为合适的培养条件，并对发酵过程中调节ｐＨ的氨水用量与外源蛋白的表达量之间的相关性作探索，得到相关性曲线，从而根据氨水用量了解细菌的生长状况。     

重组大肠杆菌高密度培养研究进展

重组大肠杆菌细胞高密度培养(High cell-density cultivation,HCDC)是获得高外源蛋白产率的一种重要策略,影响重组大肠杆菌高密度培养的因素主要有以下几个方面:重组体的构建及其稳定性,培养基成分,培养方式,培养条件及培养过程中抑制性代谢产物的积累等。从以上几个方面对近期的研究进展进行了综述。     

重组大肠杆菌的分批补料培养方法

在重组大肠杆菌的培养过程中,存在着菌体的高浓度与外源蛋白的高表达这一矛盾,使得重组菌的比生长速率通常远远低于宿主菌,限制了基因工程菌由实验室规模向工业化规模的转变。要实现重组大肠杆菌的高密度培养,最常用和最有效的方法就是分批补料流加培养。     

高密度培养大肠杆菌YK537／pSBHL—11生产重组人细胞白介素—3

在Ｂ．Ｂｒａｕ ＥＳ－１０型１５Ｌ和ＮＢＳ ＤｉｏＦｌｏ３０００型５Ｌ发酵罐中,利用补料分批培养技术高工表达培养含重组质粒ｐＳＢＨＬ－１１的大肠杆菌ＹＫ５３７,生产重组人白细胞介素－３（ＩＬ－３）,发现在发酵过程中,限制性流加甘油,控制溶解氧在３０％－４０％左右,３０℃生长,１１ｈ,４２℃诱导培养４ｈ,能将发酵液中最终菌体密度从ＯＤ１６６００提高到ＯＤ５３６００,并且保持了白细胞介素－３的表达量。     

重组大肠杆菌产疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶分批补料发酵工艺

为了获得低成本的疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶(TLL),在5L发酵罐发酵中对工程菌E.coliBL21(DE3)/pET28b-TLL的分批补料发酵工艺进行研究。结果表明:以葡萄糖为碳源的补料培养基,采用溶氧(DO)反馈补料策略进行补料,当OD600=60时降温至28℃,分2次加入终质量浓度为30g/L乳糖进行诱导表达。优化后TLL的表达量提高到798.5U/L,是优化前的2.4倍。本研究为规模化发酵重组菌生产TLL奠定了基础。     

利用重组大肠杆菌生产人生长激素发酵工艺的研究

在摇瓶培养和发酵罐培养条件下,研究了E.coli/BL21(DE3)/pET30a(+)-hGH工程菌的不同发酵工艺条件。确立了该工程菌的最优化工艺参数:M9-2培养基,37℃、pH值为6.8-7.4、诱导起始菌体密度为OD600达3.0-4.0,IPTG浓度为1mmol/L,诱导时溶氧控制为50%以上,补料为10%甘油、5%Yeast extract和5%Tryptone。该工艺条件经过连续三批发酵,证实稳定可行,目的蛋白在胞间质呈可溶性表达,表达量占菌体总蛋白的20%以上。     

利用恒溶氧—补料分批技术高密度培养大肠杆菌生产重组人骨形成蛋？…

对表达人骨形成蛋白－２Ａ的重组大肠杆菌ＹＫ５３７／ｐＤＨ－Ｂ２ｍ在５００ｍｌ摇瓶中进行了培养条件的摸索实验,继后用５Ｌ自控发酵罐进行分批培养和分批补料培养,以获取ｒｈＢＭＰ－２Ａ。两种培养方式结果结果比较表明,在培养过程中保持３０％－４０％左右的溶２解氧和限制性流加葡萄糖可以使ＢＭＰ－２Ａ的含量达到２．７８ｇ／Ｌ,最终菌体密度为ＯＤ６００５３,重组蛋白的表达量占菌体总蛋白的２５％。     

重组大肠杆菌高密度发酵研究进展

重组大肠杆菌的高密度发酵是提高基因工程产品产量的一个非常有效的手段,是现代发酵工程研究的一个热点。本文就高密度发酵中影响重组大肠杆菌发酵产率的几个因素,包括宿主菌、培养基、培养条件、补料方法以及高密度发酵过程中存在的问题和对策加以讨论,着重探讨了高密度下大肠杆菌产生的有害代谢副产物———乙酸的产生机制、抑制作用机理,以及控制乙酸积累的技术方法 。     

溶氧反馈分批补料高密度培养人骨形成蛋白-2工程菌

对表达人骨形成蛋白2成熟肽的基因工程大肠杆菌E.coli DH5α/pDH-B²m在500mL摇瓶中进行了培养条件的摸索实验,并在此基础上扩大至NBS Bioflo IV 20L发酵罐,利用溶氧反馈-分批补料培养技术：在培养过程中保持适当的溶解氧（40%）,以溶氧值在线反馈控制搅拌速度及流加补料培养基,使细菌保持适当的比生长率,成功地进行了工程菌的高密度培养,最终菌体密度达OD₆₀₀=57,每升干菌量22.8 g,目的蛋白的表达量占细菌总蛋白的30%,人骨形成蛋白2成熟肽的理论产率达到3.59 g/L。      

分批补料培养对L-异亮氨酸发酵的影响

以钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum Met-,Bio-,AECr,AHVr)的分批补料技术进行L-异亮氨酸(L-ILE)发酵调控的研究.采用间歇恒速补料方式,当初糖浓度由7%下降至1%～2%,补糖为23g/L·h,整个发酵过程糖浓度一直维持在2%,μ、x值都提高,qp为最大;L-亮氨酸产率达17.4g/L,产酸率提高21%,结果明显优于分批培养.     

高密度培养大肠杆菌YK537/pSBHL-11生产重组人细胞白介素

在 Ｂ． Ｂｒａｕｎ Ｅ Ｓ１０ 型１５ Ｌ 和 Ｎ Ｂ Ｓ Ｂｉｏ Ｆｌｏ ３０００ 型５ Ｌ 发酵罐中,利用补料分批培养技术高密度表达培养含重组质粒ｐ Ｓ Ｂ Ｈ Ｌ１１ 的大肠杆菌 Ｙ Ｋ５３７ ,生产重组人白细胞介素３（ Ｉ Ｌ３） ,发现在发酵过程中,限制性流加甘油,控制溶解氧在３０ ％ ～４０ ％ 左右、３０ ℃生长１１ｈ ,４２ ℃诱导培养４ｈ ,能将发酵液中最终菌体密度从 Ｏ Ｄ１６６００ 提高到 Ｏ Ｄ５３６００（ 相当于每升发酵液含１０６ 克湿菌体） ,并且保持了白细胞介素３ 的表达量,占菌体总蛋白的３０ ％ 左右,含量超过３３ ％ ｇ／ Ｌ,使 Ｉ Ｌ３ 包涵体产量从湿重２２ｇ／ Ｌ 提高到８５ ｇ／ Ｌ,纯化步骤比较简单,超声破菌后经两次洗涤纯度就达到７０ ％ 以上。     

腈水解酶psn基因工程菌的发酵及产酶条件优化

来自恶臭假单胞菌的腈水解酶具有高效催化3-氰基吡啶产烟酸的能力,对表达该酶的基因psn进行发酵和产酶条件优化,通过对C源、N源、磷酸盐、金属离子、温度、诱导剂浓度和诱导时间进行单因素考察,获得最适培养基条件(g/L):葡萄糖5、蛋白胨15、酵母粉5、(NH4)2SO45、K2HPO424.5、KH2PO45.76、MgSO40.48;最佳诱导条件:培养2.5 h后添加IPTG诱导,浓度0.2 mmol/L,诱导温度30℃。在该条件下培养,重组大肠杆菌的腈水解酶比酶活可达到45.67 U/mL,比优化前提高了2.26倍。在此基础上,于5 L发酵罐上进行C、N源的补料研究,获得最适分批补料策略,发现其腈水解酶活力可达到75.40 U/mL,是优化前的3.74倍。     

高密度培养大肠杆菌YK537/pSBHL11生产重组人细胞白介素-3

在B.Braun ES-10型15L和NBS BioFlo 3000型5L发酵罐中,利用补料分批培养技术高密度表达培养含重组质粒pSBHL-11的大肠杆菌YK537,生产重组人白细胞介素-3(IL-3),发现在发酵过程中,限制性流加甘油,控制溶解氧在30%～40％左右、30℃生长11h,42℃诱导培养4h,能将发酵液中最终菌体密度从OD₁₆600提高到OD₅₃600(相当于每升发酵液含106克湿菌体),并且保持了白细胞介素-3的表达量,占菌体总蛋白的30%左右,含量超过3.3%g/L,使IL-3包涵体产量从湿重2.2g/L提高到8.5 g/L,纯化步骤比较简单,超声破菌后经两次洗涤纯度就达到70%以上。     

高密度发酵生产突变型重组人肿瘤坏死因子rhTNFα-DK2的研究

通过对发酵基质和发酵关键参数的优化,确定了发酵培养基的磷酸盐浓度为０．１５Ｍ,甘油浓度为１．２ｍｌ／Ｌ,补料中甘油浓度为２０ｍｌ／Ｌ,发酵过程中溶解氧控制在３０％～６０％,ｐＨ控制在６．８５左右。在５Ｌ在ＮＢＳ－Ｂｉｏｆｌｏ３０００型自动控制发酵罐中采取加速补料的补料分批培养,重组大肠杆菌ＹＫ５３７／ｐＳＢ－ＴＫ经１０ｈ３０°Ｃ培养和５ｈ４２°Ｃ诱导培养,最终密度达到６０ＯＤ６００,ｒｈＴＮＦα－ＤＫ２的表达量占菌体总蛋白的５０％以上,每升发酵液纯化可得到近２ｇ的ｒｈＴＮＦα－ＤＫ２。     

利用恒溶氧．补料分批技术高密度培养大肠杆菌生产重组人骨形成蛋白-2A

对表达人骨形成蛋白－2A(BMP－2A)的重组大肠杆菌YK537／pDH－B2m在500ml摇瓶中进行了培养条件的摸索实验,继后用5L自控发酵罐进行分批培养和分批补料培养,以获取rhBMP－2A两种培养方式结果比较表明,在培养过程中保持30％～40％左右的溶解氧和限制性流加葡萄糖可以使BMP-2A的含量达到2．78g／L,最终菌体密度为OD₆₀₀53(相当于干菌21．2g／L),重组蛋白的表达量占菌体总蛋白的25％。该培养技术的关键是：(1)在培养过程中保持适当的溶解氧;(2)限制性流加葡萄糖;(3)42℃起始诱导的时间控制在对数生长中期,持续表达时间为4h;(4)细菌持续生长的比生长速率控制在0．3h -1左右。     

利用恒溶氧．补料分批技术高密度培养大肠杆菌生产重组人骨形成蛋白-2A

对表达人骨形成蛋白２Ａ（ＢＭＰ２Ａ）的重组大肠杆菌ＹＫ５３７／ｐＤＨＢ２ｍ在５００ｍｌ摇瓶中进行了培养条件的摸索实验,继后用５Ｌ自控发酵罐进行分批培养和分批补料培养,以获取ｒｈＢＭＰ２Ａ。两种培养方式结果比较表明,在培养过程中保持３０％～４０％左右的溶解氧和限制性流加葡萄糖可以使ＢＭＰ２Ａ的含量达到２７８ｇ／Ｌ,最终菌体密度为ＯＤ６００５３（相当于干菌２１２ｇ／Ｌ）,重组蛋白的表达量占菌体总蛋白的２５％。该培养技术的关键是：（１）在培养过程中保持适当的溶解氧;（２）限制性流加葡萄糖;（３）４２℃起始诱导的时间控制在对数生长中期,持续表达时间为４ｈ;（４）细菌持续生长的比生长速率控制在０３ｈ１左右。