骨桥蛋白RNA干扰对人U251胶质瘤细胞在裸鼠体内生长的影响

研究下调骨桥蛋白(osteopontin,OPN)对人U251胶质瘤细胞在裸鼠体内生长的影响并探讨其对胶质瘤生长、侵袭的可能机制.应用RNA干扰技术,将OPN基因的慢病毒干扰载体LV-OPNshRNA感染U251细胞.将对照和试验组U251细胞分别接种裸鼠,建立裸鼠荷瘤模型.3周后测量肿瘤的体积、瘤重并做肿瘤组织病理切片分析;利用RT-PCR和免疫印迹法检测OPN、尿激酶型纤维蛋白酶原激活物(uPA)、基质金属蛋白酶(MMP-2、MMP-9)的mRNA和蛋白表达;免疫组化法检测肿瘤组织微血管密度和血管内皮生长因子（VEGF）表达情况. 经OPN的RNA干扰后,能显著降低肿瘤组织OPN mRNA水平及蛋白表达,有效抑制肿瘤细胞生长及侵袭能力, 肿瘤体积及重量的减小有统计学意义(P<0.05).感染组uPA、MMP-2和MMP-9的mRNA和蛋白表达明显减少, 肿瘤组织的MVD值和VEGF的表达均显著降低.上述结果表明,抑制OPN的表达能明显抑制人U251胶质瘤细胞在裸鼠体内的生长和侵袭,OPN可能通过激活uPA、MMP-2和MMP-9等蛋白酶降解细胞外基质和促进肿瘤血管生成,参与胶质瘤的生长.     

bcl-2癌基因蛋白在鼻咽癌以及单克隆癌细胞裸鼠体内连续传代中的表达

用免疫组织化学Ｓ－Ｐ方法,检测了４０例低分化鼻咽癌、３０例鼻咽癌克隆细胞裸鼠移植瘤、１０例慢性鼻咽炎及８例人胚鼻咽上皮组织石蜡包埋切片中抗凋亡基因ｂｃｌ－２癌蛋白的表达;并进一步检测了鼻咽癌克隆株在裸鼠体内演进中ｂｃｌ－２癌蛋白的表达以及与淋巴结转移之间的关系。结果表明：鼻咽癌及其裸鼠移植瘤组织中ｂｃｌ－２癌蛋白的表达率分别为６２．５％和７０％,慢性鼻咽炎中ｂｃｌ－２癌蛋白的表达率为１０％,人胚鼻咽上皮组织中不表达ｂｃｌ－２癌蛋白,鼻咽癌及其裸鼠移植瘤组织中ｂｃｌ－２癌蛋白的表达率明显高于慢性鼻咽炎组织中（Ｐ＜０．０１）;鼻咽癌克隆株演进中癌细胞ｂｃｌ－２癌蛋白的表达不断升高,其淋巴结转移率亦不断升高。提示：抗凋亡基因ｂｃｌ－２癌蛋白的表达可能和鼻咽癌的发生、演进及转移能力密切相关     

新基因BCAPP2Ac在膀胱癌中的表达 及其对膀胱癌细胞增殖的影响

为探讨膀胱癌相关蛋白磷酸酶2A催化亚单位（BCAPP2Ac）新基因在膀胱癌组织中的表达及其对膀胱癌细胞增殖的影响,通过合成抗原多肽免疫家兔获得抗BCAPP2Ac多克隆抗体及通过慢病毒感染方式获得稳定表达BCAPP2Ac的膀胱癌细胞.采用实时PCR及免疫组化染色方法检测BCAPP2Ac mRNA和蛋白在膀胱癌组织、癌旁组织及其它多种肿瘤组织中的表达;用细胞增殖实验检测BCAPP2Ac对膀胱癌细胞增殖的影响.实时PCR及免疫组化结果显示,BCAPP2Ac mRNA及蛋白在膀胱癌组织较癌旁组织表达明显下调;过表达BCAPP2Ac能抑制膀胱癌EJ、T24细胞的增殖, 蛋白磷酸酶2A催化结构域缺失（△PP2Ac）能逆转BCAPP2Ac的增殖抑制作用.研究结果提示,新基因BCAPP2Ac能抑制膀胱癌细胞的增殖,PP2Ac结构域在其抑制细胞增殖作用中发挥重要作用.     

miRNA-194 在裸鼠体内对骨肉瘤增殖和转移的影响

目的:通过使用慢病毒技术,建立肺转移裸鼠模型,观察miRNA-194对于骨肉瘤增殖和转移的影响,为研究miRNA-194在骨肉瘤中的作用及进一步的治疗提供理论依据。方法:使用慢病毒技术对骨肉瘤细胞系U2-OS进行转染后分组,然后将转染后的各组细胞注入裸鼠体内建立肺转移模型。5周后将裸鼠处死,观察和比较原位及肺部肿瘤的大小。结果:1)mi RNA-194下调组裸鼠的原位肿瘤的体积(3920±860 mm~3)和重量(2.15±0.32 g)明显的大于其余各组(P0.05);2)miRNA-194上调组的肺部情况(36.7±12.4个)明显的优于其余各组(P0.05);3)病理学检测证实其确实为原位骨肉瘤及肺部转移病灶。结论:miR-194可以明显的在裸鼠体内抑制骨肉瘤的增殖及肺部的转移,从而显示mi R-194在动物水平在骨肉瘤中呈现明显的抑癌基因的作用,为接下来关于miRNA-194的各项实验奠定了良好的实验基础。     

hDaxx与细胞肿瘤抑制子p53在体内外的相互作用

与急性早幼粒细胞性白血病蛋白(promyelocytic leukemia protein,PML)在体内相互作用共定位于细胞核PML致癌结构城(PML oncogenic domains,PODs)的人Daxx(human Daxx,hDaxx),能结合Fas死亡结构域诱导细胞凋亡.细胞肿瘤抑制子p53抑制细胞及病毒转录,提高细胞内Fas的表达并调节细胞凋亡.为了探索hDaxx与p53在诱导细胞凋亡中有无相互作用及其作用效果,利用酵母双杂交体系测定发现p53通过C端与hDaxx结合,共免疫沉淀反应及Western blot结果显示hDaxx与p53能在体内外直接结合.hDaxx与p53结合并发生相互作用可能对细胞周期有一定的调节作用.     

G6PD缺陷抑制人黑色素瘤细胞裸鼠移植瘤的生长

敲减葡糖6-磷酸脱氢酶(G6PD)表达的人黑色素瘤A375细胞(A375-G6PDΔ) 呈现生长增殖抑制和凋亡率升高. 为明确G6PD缺陷对裸鼠体内成瘤的影响及其可能机制,用A375-WT与A375-G6PDΔ细胞制作裸鼠荷瘤模型,观察体内瘤体生长,real-time PCR、免疫组织化学染色与紫外分光光度法分别检测瘤体组织G6PD mRNA、G6PD蛋白及酶活性,Western 印迹分析凋亡相关蛋白,分光光度法测定NADPH和GSH/GSSG水平. 结果显示,A375-G6PDΔ细胞注射组的裸鼠成瘤时间延长,瘤体生长明显减慢,瘤体的体积与质量显著低于A375 WT细胞注射组（P <0.01）;与A375-WT细胞注射组相比,A375 G6PDΔ细胞注射组的裸鼠瘤体组织中G6PD mRNA表达、G6PD阳性细胞数与G6PD活性分别降低了87.10%、77.20%与75.77%（P<0.01）,G6PD、p53和Bcl-2的表达分别降低了67.92%、65.54%和62.32%（P<0.01）,Fas升高了86.38%（P<0.01）,NADPH和GSH/GSSG分别降低了74.37%和86.02%（P<0.01）. 结果提示,G6PD缺陷可能通过减少核酸等合成的原料、改变细胞内氧化还原状态及凋亡相关蛋白表达抑制裸鼠瘤体生长与增殖,这为黑色素瘤发生和治疗研究提供了新的线索.     

p53、p63和Ki67与肌层浸润性膀胱癌预后的关系

目的 研究突变型p53、p63和Ki67的表达和肌层浸润性膀胱癌(muscle invasive bladder cancer,MIBC)预后的相关性.方法 回顾性收集2007年1月至2016年12月在我院因肌层浸润膀胱癌行根治性膀胱切除术患者共99例.根据突变型p53、p63和Ki67的表达情况将病人进行分组,采用K...     

封闭Skp2基因表达对大肠癌LS-174T细胞裸鼠皮下移植瘤生长与转移抑制的研究

目的:建立人大肠癌LS-174T细胞的裸鼠皮下移植瘤模型,应用Skp2基因特异性siRNA重组腺病毒治疗,观察其在体内对肿瘤生长和转移的影响,并探讨其相应的作用机制.方法:将大肠癌LS-174T细胞以5×106个/只接种于雌性裸鼠右侧腋窝皮下,待平均瘤体积长至50～150mm3时筛选成模动物分组给药,分别给予重组腺病毒pAD-Skp2/siRNA 5×108和5× 109pfu/只瘤内注射,阳性组给予今又生5×109pfu/只瘤内注射,另设空病毒对照组.每周给药2次,连续4周,以安乐死时肿瘤体积大小和重量来评价治疗效果.然后用Western Blot检测肿瘤组织中Skp2、p27kipl、c-myc、Bcl-2的表达,用免疫组化法检测肿瘤组织中MMP-2的表达.结果:安乐死时阴性对照组平均肿瘤体积与空病毒对照组生长情况基本一致(P≥0.05);今又生组平均肿瘤体积明显小于模型组(P≤0.05);pAD-Skp2/siRNA低、高剂量组平均瘤体积均显著低于模型组(P≤0.01),且有剂量依赖性.今又生组瘤重抑制率为58.16％,pAD-Skp2/siRNA低、高剂量组瘤重抑制率分别为75.59％、86.45％.Skp2蛋白表达在模型组、空病毒对照组和今又生组均有较强表达,而在pAD-Skp2/siRNA低剂量和高剂量组均未见表达;而p27kipl仅在pAD-Skp2/siRNA低剂量和高剂量组有表达,其余三组均未见其表达;c-myc和bcl-2表达趋势一致,均在模型和空病毒对照组有表达,而在今又生组和pAD-Skp2/siRNA两个剂量组均表达明显减弱.模型组和空病毒对照组有棕黄色阳性表达,而今又生组和pAD-Skp2/siRNA两个组均未检测到MMP-2阳性表达.结论:在高转移性大肠癌LS-174T裸鼠移植瘤模型中,封闭Skp2基因可以抑制肿瘤的增殖和转移,其作用机制与细胞周期调控、细胞凋亡中的c-myc和bcl-2以及基质金属蛋白酶MMP-2相关.     

Clusterin和p21在膀胱癌中的表达及临床意义

目的:研究Clusterin和p21基因在膀胱癌中的表达和临床意义及二者的相关性.方法:采用免疫组织化学检测20例正常膀胱组织(NB)、60例膀胱癌组织(BTCC)中Clusterin和p21蛋白的表达情况,根据染色强度和阳性细胞数作半定量分析.结果:Clus-terin、p21蛋白在膀胱癌中的阳性表达率明显高于正常膀胱组织,阳性表达率分别为70.0%、63.3%;20.0%、15.0%(P<0.05);二者在低分化、浸润性肿瘤的阳性表达率明显高于高分化、浅表性肿瘤(P<0.05),Clusterin和p21在膀胱癌中的表达存在正性相关(P<0.05).结论:Clusterin、p21蛋白的表达与膀胱癌病理组织学分级、临床分期相关,二者联合检测可为膀胱癌的诊断及预后提供一定参考价值.     

人卵巢癌裸鼠移植实体瘤模型的建立

目的建立人卵巢癌裸鼠移植实体瘤模型。方法将1例人卵巢癌组织移植裸鼠,建立人卵巢癌裸鼠原代移植实体瘤模型的基础上,再将实体瘤皮下移植、实体瘤原位移植、实体瘤细胞移植裸鼠。观察裸鼠实体瘤生长和转移情况,称量其体重、子宫卵巢重、瘤重及瘤的大小,并作病理、电镜、染色体检查。结果成功地建立人卵巢癌裸鼠移植实体瘤模型,并已传至第18代,传代移植成功率100％,组织学和超微结构形态均证明该实体瘤保留了原人卵巢癌特征,有人卵巢癌染色体特征,并出现肝、脾转移。结论本研究建立人卵巢癌裸鼠移植实体瘤模型与人相似,通过18代传代和实验观察方法稳定可靠。为人卵巢癌的研究提供了理想的动物模型。     

人喉癌裸鼠移植瘤模型的建立及部分生物学特性研究

用人喉癌手术切除标本建立了裸鼠移植瘤模型,已传至13代。原代移植成功率为66.7％,潜伏期30～70d;鼠间传代移植成功率为100％,潜伏期14～19d,生长稳定。经光学显微镜检查,各代移植瘤组织结构与原人喉癌组织基本一致。电镜检查证明,具有人喉癌特征,癌细胞间有大量桥粒,细胞浆中可见张力原纤维,有的张力原纤维与桥粒相连。细胞表面有较大的指状突,核膜较规则,胞浆中线粒体较多。     

Mutations in p53 cDNA sequence introduced by retroviral vector

The high mutation rates of retroviruses are a potential problem with retroviral vectors. We studied the mutation rates and spectra of p53 sequences transduced with a retroviral vector in a cancer gene therapy model. When p53-deficient H358 non-small cell lung cancer cells were treated with a retroviral vector carrying normal p53 cDNA, most of transduced cells were killed by apoptosis. However, a small number of clones escaped p53-mediated apoptosis. We examined the p53 cDNA structure in these resistant clones. PCR-based analysis showed that 88/102 clones had detectable mutations in p53, including gross rearrangements, deletions/insertions, and base substitutions. To study the mutation rate of the p53 sequence in all transduced clones, the retroviral vector containing the non-functional p53 gene and the Neo-resistant marker gene was introduced into H358 cells. Only one of 95 isolated clones showed a base substitution. These results indicate that the mutation rate of p53 is not particularly high, but there is a significant risk that cancer cells will resist p53 gene therapy as a result of retroviral replication errors.     

DMBA、垂体移植诱发性乳腺瘤内172~（Arg－Leu）突变型p53的特性及其与基因重排和扩增关系的研究

ｐ５３最早发现于ＳＶ４０转化的细胞系,后来几乎在所有不同类型的细胞内均检测到这种蛋白质,野生型Ｐ５８是一种有效的肿瘤抑制因子,但突变体ｐ５２可与ｒａｓ－肿瘤基因协同转化体外的腺代细胞,而且在肿瘤发生时常伴随有ｐ５３基因的突变。乳腺癌内,ｐ５３基因的突变率为４０％,并可见到某些肿瘤基因参与癌症的形成过程,暗示ｐ５３基因结构和功能的改变可能与这些基因的重排和扩增有关。本实验选择４种不同年龄的１７２~（Ａｒｇ－Ｌｅｕ）突变型ｐ５３转基因小鼠为受试动物,将同系动物的垂体腺植入小鼠的肾脏后,再以致癌剂ＤＭＢＡ处理,以使动物乳腺内的ｐ５３基因表达和诱导小鼠乳腺癌形成。从乳腺癌小鼠分别摘取乳腺组织,提取ＤＮＡ和ＲＮＡ,以Ｈ－ｒａｓ、ＰＣＮＡ、ＣｙｌｉｎＤ１、ｐ５３基因的ＤＮＡ片段作为特异性核酸探针,进行ＳｏｕｔｈｅｒｍＢｌｏｔｔｉｎｇ和ＮｏｒｔｈｅｒｎＢｌｏｔｔｉｎｇ分析,以检测在突变体Ｐ５３表达的情况下,ＰＣＮＡ、Ｈ－ｒａｓ、ＣｙｉｎＤ１等基因在体内的变化规律。实验发现,在４组不同的受试动物中,其乳腺癌细胞的ＰＣＮＡ和Ｈ－ｒａｓ两种基因发生了基因重排,特征是其ＤＮＡ标本中分别出现了一条很强的额外杂交带,但对照动物乳腺该类     

Diindolylmethane-mediated Gli1 Protein Suppression Induces Anoikis in Ovarian Cancer Cells in Vitro and Blocks Tumor Formation Ability in Vivo

Anoikis is a cell death that occurs due to detachment of a cell from the extracellular matrix (ECM). Resistance to anoikis is a primary feature of a cell that undergoes metastasis. In this study for the first time, we demonstrated the potential role of Gli1 in anoikis resistance. Treatment of various ovarian cancer cells by different concentrations of diindolylmethane (DIM), an active ingredient of cruciferous vegetables, reduced the anoikis resistance in a concentration-dependent manner. Reduction in anoikis resistance was associated with a decrease in the expression of Gli1 and an increase in the cleavage of poly(ADP-ribose) polymerase (PARP). Sonic hedgehog (Shh) treatment not only increased the expression of Gli1, but also blocked anoikis induced by DIM and abrogated the change in the expression of Gli1 and cleaved PARP by DIM. To confirm the role of Gli1, hedgehog inhibitor cyclopamine, Gli1 siRNA and Gli1(-/-) mouse embryonic fibroblasts (MEFs) were used. Cyclopamine treatment alone significantly reduced anoikis resistance in A2780 and OVCAR-429 cells. Cyclopamine-mediated reduction in anoikis resistance was associated with reduced expression of Gli1 and induction of cleaved PARP. Shh treatment blocked cyclopamine-induced anoikis. Silencing Gli1 expression induced anoikis and cleavage of PARP in A2780 and OVCAR-429 cells. Furthermore, Gli1(-/-) MEFs were more sensitive to anoikis compared with Gli1(+/+) MEFs. Our in vivo studies established that DIM- or cyclopamine-treated ovarian cancer cells under suspension culture conditions drastically lost their ability of tumor formation in vivo in mice. Taken together, our results establish that Gli1 is a critical player in anoikis resistance in ovarian cancer.     

荷人肺癌裸鼠上肿瘤细胞Bcl-2 表达及其活性生物时间节律差异

目的:探索荷人肺癌裸鼠上肿瘤细胞Bcl-2表达及其活性生物时间节律差异。方法:体外培养A549人肺癌细胞系,移植到裸小鼠身上,10天成瘤后,随机分为6大组,每大组再分2小组,每组4只,一组不给任何处理,设为对照,各组小鼠分别于光照后不同时间点取肿瘤细胞制成细胞悬液,固定染色后,用流式细胞仪以每个样品检测10000个细胞的数量检测单个细胞的荧光强度,用流式细胞仪检测细胞周期情况,单因素方差分析法检验各期细胞在6个时间点差异的显著性,用Cosinor法考察G1,S,G2,M期细胞在24h的分布是否符合余弦函数,即是否有时辰节律。按6个时间点取的肿瘤细胞,匀浆后裂解细胞,Western Blot法测定Bcl-2的表达。结果:1.结果发现肿瘤的生长曲线高峰出现在睡眠期中点,其次在活动期中点;G1、S、G2期细胞变化符合余弦节律;2.Bcl-2的表达在光照后7h和19h达到峰值,变化趋势与肿瘤细胞的周期性改变一致。结论:荷人肺癌裸鼠上肿瘤细胞的细胞周期可能随昼夜交替呈节律性变化,Bcl-2的表达变化与肿瘤细胞的节律性改变一致。     

优化胶粘贴法建立裸鼠胃癌原位种植模型

目的通过对两种胶粘贴法建立的胃癌原位种植动物模型的比较研究,为探讨胃癌的发病机制和实验治疗提供理想的动物模型。方法用OB胶和FS生物蛋白胶法分别建立胃癌原位种植动物模型,观察和比较两种方法所建立的模型肿瘤生长状况、转移情况和形态学变化。结果FS生物蛋白胶组未出现肿瘤大片坏死,腹水形成率为85.7%,幽门梗阻发生率为57.1%;而OB胶组肿瘤大片坏死发生率为100%,腹水形成率为14.3%,未出现幽门梗阻。FS生物蛋白胶组有三例出现了肺和脑转移。结论FS生物蛋白胶法建立的裸鼠胃癌原位种植动物模型能更好的模拟人胃癌患者的临床过程,为研究人胃癌转移机制和实验治疗提供理想的动物模型。     

BALB/c-nu裸小鼠繁殖中杂合仔鼠剔除时间对纯合裸仔鼠生长发育的影响

目的研究屏障设施下裸小鼠繁殖生产时,在不同时间段剔除杂合仔鼠对纯合裸仔鼠的成活率及生长发育情况的影响。方法选取25窝头胎生BALB/c-nu新生裸小鼠按剔除杂合仔鼠的时间不同分成五组,以24h剔除组为对照比较纯合裸仔鼠生长发育及死亡率、离乳率的差异性,统计分析其生长发育过程中的体重增长等。结果剔除组生长发育及死亡率与对照组之间均存在差异性,其中14d剔除组和21d剔除组差异极显著。结论剔除杂合仔鼠的时间对纯合裸仔鼠的成活率及生长发育情况的有很大影响。为了保证SPF级裸鼠生长发育要求,生产繁殖出合格的实验用裸小鼠,剔除全部杂合仔鼠的最佳时间应该在新生仔鼠出生24h内,超过3d则会极大地影响纯合裸小鼠的正常生长发育。     

Limited Role of Murine ATM in Oncogene-Induced Senescence and p53-Dependent Tumor Suppression

Recent studies in human fibroblasts have provided a new general paradigm of tumor suppression according to which oncogenic signaling produces DNA damage and this, in turn, results in ATM/p53-dependent cellular senescence. Here, we have tested this model in a variety of murine experimental systems. Overexpression of oncogenic Ras in murine fibroblasts efficiently induced senescence but this occurred in the absence of detectable DNA damage signaling, thus suggesting a fundamental difference between human and murine cells. Moreover, lung adenomas initiated by endogenous levels of oncogenic K-Ras presented abundant senescent cells, but undetectable DNA damage signaling. Accordingly, K-Ras-driven adenomas were also senescent in Atm-null mice, and the tumorigenic progression of these lesions was only modestly accelerated by Atm-deficiency. Finally, we have examined chemically-induced fibrosarcomas, which possess a persistently activated DNA damage response and are highly sensitive to the activity of p53. We found that the absence of Atm favored genomic instability in the resulting tumors, but did not affect the persistent DNA damage response and did not impair p53-dependent tumor suppression. All together, we conclude that oncogene-induced senescence in mice may occur in the absence of a detectable DNA damage response. Regarding murine Atm, our data suggest that it plays a minor role in oncogene-induced senescence or in p53-dependent tumor suppression, being its tumor suppressive activity probably limited to the maintenance of genomic stability.