人乳头瘤病毒特异性T细胞系细胞冻存后细胞的存活率及功能

研究人乳头瘤病毒特异性T细胞系细胞冻存后细胞的存活率及功能。应用包含10%二甲基亚砜、90%小牛血清的冻存液冻存6个T细胞系(5个CD4 T细胞系,1个CD8 T细胞系)细胞,液氮中冻存32~54个月后复苏,台盼蓝染色法检测复苏后T细胞系细胞的存活率,用酶联免疫斑点法(enzyme-linked immunospot assay,ELISPOT)检测复苏后T细胞系细胞的功能。结果显示,6个T细胞系细胞液氮冻存解冻后细胞的存活率为24.7%~93.5%,过夜培养后细胞的存活率为2.5%~72.2%。CD8 T细胞系细胞的存活率高于CD4 T细胞系细胞。6个复苏后的T细胞系细胞在PHA诱导后均能分泌IFN-γ。人乳头瘤病毒特异性T细胞系细胞冻存复苏后能够保持较好的存活率和功能。     

绿色荧光蛋白标记的葡萄糖转运蛋白4稳定表达细胞系的建立

目的:建立稳定表达EGFP标记的葡萄糖转运蛋白4的CHO细胞系,为研究GLUT4在CHO细胞中的转运调节机制奠定基础。方法:采用分子克隆方法构建GLUT4-EGFP的融合蛋白,在FLP-in的CHO细胞系中表达,潮霉素筛选后得到稳定的细胞系。结果:通过共聚焦显微镜的检测,证明了此稳定细胞系的阳性率达到了99%。定位研究表明大部分GLUT4以囊泡形式分布在CHO细胞胞浆内,但是质膜上也有少量的GLUT4。结论:建立了一个稳定表达GLUT4-EGFP的CHO细胞系,为进一步研究GLUT4的转运提供了一个很好的细胞模型。     

CD90和EpCAM在人肝癌细胞系中的表达及EpCAM~+细胞的特性分析

该研究检测了人肝癌细胞系中CD90和Ep CAM的表达情况,从中筛选Ep CAM+细胞并初步探讨其生物学特性。用流式细胞仪检测五种肝癌细胞系(Bel-7403、Bel-7404、SMMC-7721、Hep G2和Sk-Hep-1)中CD90及Ep CAM的表达。从肝癌细胞系中分选Ep CAM+细胞和Ep CAM–细胞,CCK-8法检测分选细胞的增殖能力和顺铂对细胞生长的抑制率;平板克隆实验检测分选细胞的克隆形成能力。结果显示,肝癌细胞系Bel-7404中Ep CAM的表达率为54.94%,Ep CAM和CD90分别表达于不同的细胞系。与Ep CAM–和未分选细胞相比,Ep CAM+细胞具有更强的克隆形成能力和增殖能力(P0.05)。顺铂对Ep CAM+细胞的抑制率为21.73%,明显低于Ep CAM–细胞(49.32%,P0.05)和未分选细胞(39.51%,P0.05)。该实验结果表明,CD90和Ep CAM不在同一种肝癌细胞系中表达。从肝癌细胞系中分选的Ep CAM+细胞具有肝癌干细胞的特性:自我更新能力、耐药性以及更强的克隆形成能力。     

青鳉干细胞及其应用

干细胞广泛存在于多细胞生物的早期胚胎和成体组织中.干细胞的多能性和易操作性使其在发育生物学和再生医学上具有巨大的研究和应用价值,如细胞发育潜能的调控、细胞命运的决定、细胞治疗等.干细胞培养是研究干细胞研究工作的基础,主要集中在小鼠、人和青鳉这3种脊椎动物上.青鳉是一种小型淡水鱼,常被用作发育生物学和生物医学研究的模式物种.本文将主要介绍青鳉干细胞系及其应用.青鳉的MES1是除小鼠以外的第一个胚干细胞系;SG3是第一个成体精原干细胞系,可以在体外形成具有运动能力的精子;HX1是首个单倍体胚干细胞系,通过核移植技术,将该单倍体细胞的细胞核移植到未受精卵细胞中,得到第一个可育的半克隆动物霍利.这些突破使青鳉毫无疑问地成为干细胞研究的理想模式.     

家兔(Oryctolagus curiculus)角膜内皮细胞系的建立

为了建立兔角膜内皮(RCE)细胞系, 以家兔角膜为实验材料对RCE细胞的体外培养及其细胞系的建立进行了研究. 取活家兔角膜, 采用内皮面朝下进行贴板培养, 并利用时间梯度连续揭膜法筛选出仅含有纯净RCE细胞的培养孔, 收集纯一的RCE细胞悬浮于含有硫酸软骨素氧化降解物、牛眼生素、表皮细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、家兔角膜基质细胞培养液、羧甲基壳多糖、N-乙酰葡萄糖盐酸盐和氨基葡萄糖盐酸盐的DMEM/F12培养液(20%胎牛血清)中, 置CO2培养箱中启动原代培养. 启动培养的RCE细胞呈四角形或多角形, 3周后即可长成单层. 在随后的继代培养中, RCE细胞的形状逐渐由多角形变为成纤维样. RCE细胞生长状态稳定, 现已被传至67代, 已经建成了一个新的连续性RCE细胞系. 经鉴定, 该细胞系细胞的群体倍增时间约为53.8 h; 第67代培养细胞的特征性染色体数目为44条, 但出现了染色体的非整倍性. 综合特征性染色体数目、抗神经元特异性烯醇化酶(NSE)抗体的免疫细胞化学染色、血管内皮生长因子(VEGF165)实验和形态回复实验的研究结果, 证明该细胞系确为家兔角膜内皮细胞系, 为哺乳动物角膜内皮细胞的理论研究及人造角膜内皮的研制奠定了基础.     

两种昆虫细胞的微载体培养

斜纹夜蛾细胞系(SL-1)和家蚕细胞系(BmN)均能在国产微载体上正常生长增殖。以3mg/ml微载体培养细胞,两种昆虫细胞生长最高密度分别为8.2×10~5细胞/ml和7.6×10~5细胞/ml。扫描电镜观察显示一个微载体可贴附几十个,有的多达上百个细胞。两性昆虫细胞的微载体培养特征与常规静止培养无甚差异。     

酸性磷酸酶法检测体外培养细胞数

利用小鼠成纤维细胞系(NIH3T3)、小鼠骨髓瘤细胞系(SP2/0)、人大肠癌细胞系(LO-VO)和人白血病细胞系(K562),评价酸性磷酸酶(APA)法用于检测体外各类型细胞的增殖和杀伤作用。用直线回归分析光吸收度与每孔活细胞数的关系。结果表明,APA法能准确地反映检测的活细胞数(相关系数均>0.99)。本方法不仅能很好地检测表皮生长因子对细胞的增殖作用,也能够检测顺铂对体外细胞的杀伤作用。结果表明APA法简单、灵敏,可以用于上皮和间质等贴壁和悬浮生长的细胞计数。     

Vero细胞无血清培养技术的研究与应用

Vero细胞是世界卫生组织和我国生物制品规程认可的疫苗生产细胞系。随着对疫苗质量和安全性要求的不断提高,用无血清培养基取代含血清培养基培养Vero细胞已成为病毒疫苗生产的一个重要发展趋势。Vero细胞无血清培养的技术关键是研发或选择能支持细胞以贴附培养方式生长的无血清培养基。微载体培养是贴附依赖性细胞系规模化培养和病毒疫苗生产的有效技术途径。我们对Vero细胞无血清培养基的研发、Vero细胞无血清培养及病毒疫苗生产工艺做了讨论,对该领域存在的问题和发展策略进行了展望。     

虫草素对786-O和ACHN肾癌细胞系增殖、迁移和凋亡机制探究

探究肾癌细胞系经虫草素给药刺激后,细胞凋亡及迁移的机制。体外培养肾癌786-O细胞系和肾癌ACHN细胞系,采用MTT法、细胞迁移实验、HE染色、免疫荧光染色及蛋白免疫印记法;检验不同浓度虫草素处理肾癌细胞系增殖抑制率、细胞迁移情况、细胞形态变化和细胞核形态差异,检验凋亡相关基因蛋白表达情况,探究虫草素诱导肾癌细胞的凋亡机制。随着浓度剂量提高,虫草素能够显著促进肾癌细胞系凋亡,抑制迁移。形态学研究表明,HE染色观察发现癌细胞数量明显降低,并且细胞核明显变大。免疫荧光染色发现MMP-2、MMP-9和BCL-2蛋白表达显著降低,Bax、Casepase-3和Casepase-7蛋白表达显著增加,肾癌细胞可通过AKT/mTOR信号通路诱导肾癌细胞凋亡。     

红豆杉抗苯丙氨酸细胞系的筛选及悬浮培养特性

通过胁迫筛选法筛选红豆杉抗－苯丙氨酸细胞变异系,并比较了该细胞系与同步培养的原型细胞系悬浮培养的几项生理指标,结果表明,抗苯丙氨酸细胞系的紫杉醇含量显著高于原型细胞系的3－5倍,并且抗性细胞系的生长速率,细胞活性,pH值,胞内可溶性糖含量及褐变强度均与原型细胞系存在显著差别。     

病毒疫苗制备用不同核型VERO细胞系在裸鼠体内致癌/致瘤性的系统实验研究

生产疫苗用细胞系可能具有致瘤性,一些常用的细胞系需要检查不同代次有无致癌性。在建立传代细胞种子库与工作库基础上,对研制生产病毒活疫苗所用8株VERO细胞系在219只裸鼠进行了致癌(瘤)实验。本研究结果表明,VERO细胞染色体核型可发生变异,亚四倍体JA株与超二倍体KA株具有强的致癌性,不能用于致弱活病毒疫苗制备,但可替代HeLa细胞系用作恶性肿瘤阳性对照细胞。筛出无致瘤性的YB、dC、M和JB株亚二倍体VERO细胞系,可替代BHK-21细胞用于狂犬病减毒活疫苗制备。VERO细胞系染色体遗传相对稳定。不同代次变化不大。研究发现细胞染色体遗传特征决定致瘤性质并具有种属特异性,不同核型细胞致瘤性不同,细胞染色体数目变异大小和致癌性成正相关,通过体内外交替选育可在裸鼠体内快速选育成功高变异率肿瘤细胞系。高变异率HeLa或VERO细胞系移植于裸鼠可能产生恶性横纹肌样瘤。因此,应当强调疫苗生产用细胞系致瘤性评价的重要性。     

四个达摩凤蝶新孵幼虫细胞系的建立及其生物学特性

【目的】建立达摩凤蝶 Papilio demoleus Linnaeus新孵幼虫细胞系,并对其生物学特性进行研究。【方法】使用改良配方的Grace培养基并辅以20%胎牛血清,通过原代和传代培养建立达摩凤蝶新孵幼虫细胞系。通过显微观察、细胞活力分析、核型分析和分子鉴定,获得4个新建细胞系的生物学特性数据。使用Bac-To-Bac杆状病毒表达系统构建重组分泌型碱性磷酸酶杆状病毒(AcMNPV-SEAP)。使用有限稀释法测定达摩凤蝶细胞系对AcMNPV-SEAP的半数组织培养感染剂量(TCID₅₀), 比较达摩凤蝶细胞系对AcMNPV-SEAP的敏感性。【结果】建立了4个贴壁生长的达摩凤蝶新孵幼虫细胞系(RIRI-PaDe-1, RIRI-PaDe-2, RIRI-PaDe-3及RIRI-PaDe-4),且均传至60代以上。形态学方面,细胞系RIRI-PaDe-1和RIRI-PaDe-4较为相近,均由圆形、梭形以及多边形细胞组成,细胞系RIRI-PaDe-2主要为圆形细胞,而RIRI-PaDe-3主要为类似表皮细胞和纤维状细胞。细胞增殖动力学方面,4个细胞系的群体倍增时间分别为69.77, 67.42, 81.48及65.43 h。核型分析显示4个细胞系染色体数量均呈正态分布,其中RIRI-PaDe-2, RIRI-PaDe-3以及RIRI-PaDe-4的染色体数目分布区间比较接近,在45~97条之间,RIRI-PaDe-1的染色体条数相比偏少,在36~90条之间。通过比对4个达摩凤蝶细胞系和虫卵的细胞色素c氧化酶亚基I(COI)基因序列,证明4个新建细胞系来源于达摩凤蝶组织。比较4个细胞系对AcMNPV-SEAP敏感性发现RIRI-PaDe-3对此病毒较为敏感,可作为重组杆状病毒表达的宿主。【结论】虽然4个新建达摩凤蝶细胞系的来源相同,具有相同的遗传背景,但其生物学特征仍有明显差异,具有进一步研究的价值。     

一株棕尾别麻蝇胚胎细胞系的建立及其特性分析

双翅目昆虫细胞系广泛应用于遗传学、发育生物学、分子生物学、人和动物体病原学以及昆虫抗微生物肽的研究。本研究建立了一株新的棕尾别麻蝇Sarcophaga peregrina胚胎细胞系。该细胞系的原代培养始于2008年11月17日, 取材于棕尾别麻蝇晚期胚胎组织, 在Shields & Sang M3昆虫培养基中于28℃恒温培养, 在第26天进行第1次传代, 至今已历时21个月, 传代72次, 生长状态稳定, 被命名为Sp-E-HNU11。该细胞系的细胞形态主要呈梭形和近圆形, 杂以少量巨型细胞, 紧密贴壁生长。细胞群体倍增时间为42 h。染色体数目一般为10条或12条, 为二倍体或亚二倍体细胞系; 除一对颗粒状微型染色体外, 其他染色体呈短杆状。细胞系的β-萘酯酶和谷草转氨酶同工酶谱上分别显示出1条和3条酶带。随机引物扩增多态性 (random amplified polymorphic DNA, RAPD) 分析结果显示, 该细胞系与小菜蛾细胞系Px-E-HNU12、草地贪夜蛾细胞系IPLB-Sf-9和家蚕细胞系Bm-21E-HNU5呈现明显不同的带型特征。 Sp-E-HNU11细胞系的建立为昆虫抗微生物肽及其他相关的研究工作增添了新的研究工具和生产载体。     

利用相互染色体涂色技术分析两株人肺腺癌细胞系(A549和GLC-82)的核型特征

肺癌是全世界癌症死亡中的一个主要的原因。除吸烟外,一些肺癌患者的发病与氡气污染相关。该研究采用包括染色体分选、正向和反向染色体涂色技术,分析了两株肺腺癌细胞系A549和GLC-82的核型特征。A549和GLC-82细胞系都属于非小细胞肺癌细胞系,但诱因不同,后者来源于一个长期生活在氡气污染环境肺癌病人的癌组织。染色体涂色结果表明,这两株肺癌细胞系发生了复杂的染色体重排。在A549和 GLC-82细胞系中,除正常染色体拷贝数变化外,还分别存在13条和24条畸变染色体。约一半的畸变染色体是通过非相互易位形成的,其余的畸变染色体则是通过一些正常染色体的片段缺失或重复而产生的。尽管这两株肺癌细胞系都没有共同的畸变染色体, 但它们似共享两个染色体易位断裂点：HSA8q24和12q14。     

家蚕胚胎细胞系BmE-SWU2的建立及其生物学特性研究

家蚕反转期胚胎组织经过一年多的原代培养,建立了BmE-SWU2细胞系。该细胞系细胞呈短梭形或圆形,细胞较小,属上皮型贴壁生长细胞系;细胞生长速度快,铺平率高于80%,繁殖力强,细胞群体倍增时间为51.8 h。BmE-SWU2细胞系的二倍体细胞（2n=56）比例达到89.76％,属二倍体细胞系,其染色体具有鳞翅目昆虫染色体的典型特征,中期染色体呈短杆状或颗粒状。BmE-SWU2细胞系对BmNPV高度敏感,TCID₅₀为1.581×10^-7。     

抗胃癌细胞系单克隆抗体PD4的初步研究

以胃癌细胞系MGC803免疫Balb/c小鼠,取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞NS-1融合。经选择培养、筛选及克隆化,获得恒定地分泌抗胃癌细胞系单克隆抗体(MoAb)的杂交瘤细胞系PD4。MoAb PD4与3/4胃癌细胞系有强结合反应,与4/4肺癌细胞系有弱结合反应,但与淋巴细胞、ABO红细胞、骨髓细胞、二倍体成纤维细胞及经检测的其他肿瘤细胞均无反应。PD4抗原主要表达于靶细胞的膜上,不耐热,为分子量40kD的蛋白性抗原。该抗原与HLA抗原系统,血型抗原系统无关,亦不同于其他作者所报告的其他胃癌相关抗原。     

鲤鱼(Cyprinus carpio)体细胞系的建立及其生物学特性分析(简报)

动物细胞的培养技术是1907年哈里逊在淋巴块中对蛙的神经板培养成功开始的,其后近一个世纪以来,陆续成功地培养了哺乳动物、昆虫等各种动物细胞,并广泛用于生物科学的各个分支。鱼类的细胞培养的系统研究和建系实践大约起始于60年代,被公认的真骨鱼类的第一个永久性的细胞系——虹鳟性腺细胞系(RTG-2)是由Wolf建立的。随后各种鱼类细胞系相继建立,涉及的组织来源有吻端、肾脏、卵巢、尾鳍、性腺、肝脏、胚胎、囊胚、原肠胚、鳍条等,同时也进行了细胞体外培养条件、保存条件以及生物学特性的研究,为渔业生产和科学研究做出了重要贡献。研究者可利用来自不同种的培养细胞进行细胞杂交(融合)、核移植、DNA介导的基因转移以及一些物理图谱的建立等。细胞系在细胞生物学、遗传学的研究及培育动植物新品种等方面起着重要作用。本文首先对鲤鱼的尾鳍和吻端上皮细胞进行培养,建成鲤鱼体细胞系并对其生物学特性进行了分析。在此试验中我们侧重寻找适合做克隆供体的细胞达到最佳状态的条件, 以优化供体细胞的质量(另文报道)。此研究正在进行中。     

转染GFP对结肠直肠癌细胞遗传物质稳定性的影响

为探究绿色荧光蛋白(GFP)对结肠直肠癌细胞遗传物质稳定性是否存在影响,选取3种常用的结肠直肠癌细胞系HCT116,SW480,DLD-1;采用脂质体转染法把GFP转入细胞,统计几种细胞系微核、核芽的比例;分别比较各种细胞系自发微核、核芽和GFP组的差异.结果发现,HCT116细胞中对照组与GFP组的微核细胞率分别为3...     

两个可进入种系的ES细胞系的建立

从１２９／ｔｅｒ小鼠中建立了９个ＥＳ细胞系,它们在核型、生长速度、体内外分化能力等方面显示了各自不同的特点。通过囊胚显微注射法,将ＥＳ细胞注入Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ胚胎中,制作了嵌合体,并通过对嵌合体后代毛色的观察,判断了嵌合体生殖细胞的组成。结果表明,ＥＳ细胞系ＭＥＳＰＵ２１、ＭＥＳＰＵ２２都具有很强的种系嵌合能力。比较这两个细胞系与其他细胞系,证明一个好的ＥＳ细胞系必须具备核型正常、生长速度快、体外     

LTF基因在鼻咽癌细胞系中生物学功能的初步研究

目的:初步探讨野生型LTF基因在鼻咽癌细胞系中的生物学功能。方法:野生型LTF导入鼻咽癌细胞系,G418筛选,RT-PCR和Western-blotting分别在mRNA和蛋白质水平进行验证,得到稳定表达LTF基因的鼻咽癌细胞系。流式细胞术、平板克隆形成实验和MTT法分别检测细胞周期、细胞的克隆形成能力和细胞生长曲线。结果:成功导入LTF并稳定表达的鼻咽癌细胞系,G0-G1期细胞百分比例明显增加(72.01%vs 62.31%),G2-M期细胞百分比例减少(6.26%vs 10.81%);克隆形成能力降低(39.5%vs 59.7%),体外瘤细胞增殖能力降低(P0.05)。结论:LTF基因可阻滞细胞周期、抑制鼻咽癌细胞系的增殖能力和克隆形成率,同时为进一步的体内试验研究奠定基础。