毕赤酵母表达的嗜热蓝状菌β-葡萄糖苷酶N-糖基化修饰的作用与功能

【目的】研究N-糖基化对来源于嗜热蓝状菌β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase,Bgl3A)的酶学性质影响。【方法】采用定点突变技术构建了3个去N-糖基化的突变体T44A、S228A、S299A,并分别在毕赤酵母GS115中表达纯化。【结果】与野生型Bgl3A相比,突变体S228A分泌蛋白产量极低,仅能微量检测到p NPG活性;突变体T44A和S299A的最适pH和最适温度没有改变,分别为4.0和75°C,但二者的T_m值和70°C下的热稳定性都明显优于野生型。以p NPG为底物时,突变体S299A和T44A的催化效率分别降低了14.5%和70.0%;以纤维二糖为底物时,T44A的催化效率基本不变,而S299A的催化效率提高了1.1倍。【结论】Bgl3A不同位点的N-糖基化修饰对酶的分泌和酶学性质的影响具有明显差异。其中,N226位的N-糖基化在维持酶的表达和功能方面至关重要,而去除N297位点的N-糖基化可以提高酶的热稳定性及对纤维二糖的催化效率。     

定点突变对酰胺水解酶DamH可溶性表达和酶活的影响

摘要:【目的】DamH是一种具有酯酶活性的酰胺水解酶,其非活性中心氨基酸残基的突变对重组酶可溶性表达和比酶活产生一定的影响。拟探索DamH的活性中心氨基酸残基构成,并对其非活性中心氨基酸残基突变对可溶性表达和比酶活的影响进行研究。【方法】通过重叠延伸的方法对DamH可能的活性中心氨基酸S149、E244和H274以及非活性中心氨基酸D165及N192进行定点突变,通过静息细胞测活验证了S149、E244和H274 在催化2-氯-N-(2’-甲基-6’-乙基苯基)乙酰胺(CMEPA)水解反应中的作用,通过Ni2+- NTA亲和层析对D165及N192突变子进行纯化,对突变株和野生型比酶活进行比较。【结果】研究表明S149A使DamH的CMEPA 水解酶活性下降为野生型的5%,E244A和H274A突变导致其失去活性;D165P和N192P突变影响到DamH的可溶性表达,表达量分别为野生型的28.2%和20.8%,突变子N192P、D165P比酶活分别为野生型比酶活的55.5%和49.7%。【结论】DamH催化酯类底物和芳基酰胺类底物可能共用同一活性中心S149、E244和H274,其两个α螺旋的转角处氨基酸侧链极性和刚性结构的改变对可溶性表达以及活性有很大的影响。     

定点突变技术提高β-葡萄糖苷酶活性

β-葡萄糖苷酶(Bgl)是纤维素水解过程中的限速关键酶。提高Bgl的酶活,对于增强纤维素酶水解力有着十分重要的作用。本研究根据3D同源模建及分子对接,预测分析活性中心,利用定点突变做出针对性的改造。对来源于米曲霉的β-葡萄糖苷酶基因进行六个位点的定点突变,并将其在大肠杆菌中进行了突变基因的高效表达。经IPTG诱导后,分离纯化并进行酶学性质分析,获得酶活力提高的两个突变位点(Asn~(347)Ser,Gly~(235)Met),结果表明N~(347)S和G~(235)M位点的突变使酶的比活力显著提高,比原始酶活分别提高了43.1%和14.7%。这一研究为进一步提高β-葡萄糖苷酶活性研究提供一定的理论依据。     

链霉菌GXT6 β-葡萄糖苷酶的酶学性质及葡萄糖耐受性分子改造

【目的】从经过全基因组测序的链霉菌GXT6中克隆、表达一个编码糖基水解酶家族3的新β-葡萄糖苷酶基因,研究重组酶的酶学性质并进行相关葡萄糖耐受性的氨基酸残基的分子改造,提高其对葡萄糖的耐受性。【方法】根据链霉菌GXT6的全基因测序结果,对其中一个注释为糖基水解酶的基因设计引物,PCR扩增目的基因,以p SE380为表达载体构建重组质粒,转化至大肠杆菌中诱导表达;采用镍亲和层析技术纯化重组蛋白质,对目的蛋白质进行酶学性质研究;采用定点饱和突变的方法对重组酶进行相关氨基酸残基的分子改造。【结果】从链霉菌GXT6中克隆到一个编码糖基水解酶家族3的新β-葡萄糖苷酶基因,并在大肠杆菌中表达。酶学性质研究结果表明该β-葡萄糖苷酶的最适温度为40°C,最适p H为6.0,Km值为(0.4712±0.0180) mmol/L,Vmax值为(128.000±1.741)μmol/(min·mg),葡萄糖抑制常数Ki值为(1.8880±0.1307)mmol/L。该BGL3-GXT6能够水解黄豆苷、染料木苷、甜茶苷、虎杖苷、淫羊藿苷。还对BGL3-GXT6中与葡萄糖耐受性可能相关的氨基酸残基位点81-Trp和233-Trp进行了定点饱和突变,获得了25个具有酶活的突变酶并对其进行酶学性质研究。其中W233位点饱和突变后获得的突变酶的Km和葡萄糖抑制常数Ki值与重组酶BGL3-GXT6相比均发生明显变化,葡萄糖耐受性有不同程度的提高,最高的提高了209倍。【结论】本研究获得的BGL3-GXT6对天然底物甜茶苷、黄豆苷、染料木苷、虎杖苷和淫羊藿苷具有水解功能,这些特性表明该β-葡萄糖苷酶在理论研究及在工业中有一定的应用价值。     

基于结构B因子分析指导的头孢菌素C酰化酶动力学稳定性改造

【目的】筛选Pseudomonas sp.SE83 acy Ⅱ定点饱和突变库,获得动力学稳定性提高的头孢菌素C(CPC)酰化酶突变体,并对突变酶进行初步的结构-功能关系分析。【方法】靶标酶Pseudomonas sp.SE83 acy Ⅱ与Pseudomonas diminuta N176具有较高的同源性,通过分析N176的结构B因子,构建CPC酰化酶SE83定点饱和突变库;基于pH指示剂显色法,采用Biomek FX~P自动工作站建立CPC酰化酶高通量筛选方法,获得优良突变酶,对其活性、稳定性等酶学性质进行表征;利用SWISS-MODEL对突变体进行同源建模,探讨突变体结构与功能的关系。【结果】通过B因子分析和同源结构比对,共找出9个靶标位点;经过3轮筛选,发现R218及K226位点突变显著提高酶的热稳定性,其中最显著的R218Q和K226V在40°C的半衰期分别为野生型的3.77和2.77倍,催化效率k_(cat)/K_m分别为野生型的1.8和3.1倍。同源建模分析表明氢键作用和疏水相互作用的增加可能是突变体稳定性提高的原因。【结论】B因子指导的酶分子改造是一种高效可靠的动力学稳定性改造策略,突变体R218Q和K226V均可提高CPC酰化酶的稳定性和催化效率,对进一步的CPC酰化酶分子改造具有一定的参考价值和指导意义。     

定向进化和半理性设计改造顺式环氧琥珀酸水解酶

【背景】D(-)-酒石酸是非天然有机酸,在保健品、食品和肿瘤药物合成等行业具有重大应用潜力,目前主要通过生物转化法生产,即顺式环氧琥珀酸水解酶[cis-epoxysuccinic acid hydrolase,CESH(D)]水解顺式环氧琥珀酸(cis-epoxysuccinic acid, ESH)生成D(-)-酒石酸。该法简单温和,但存在CESH(D)酶活转化效率低下的瓶颈问题。【目的】通过基因工程改造,提高CESH(D)的酶活力、温度和pH稳定性。【方法】利用定向进化和半理性设计体外改造CESH(D),高通量筛选出正向突变体;然后对其进行酶学性质研究,包括比酶活、温度和pH对酶催化效率的影响、酶的温度稳定性、pH稳定性及酶促动力学分析;最后通过分子对接等手段分析突变位点影响催化活性的初步机制。【结果】筛选获得4个正向突变体L231P/N226S、V77I、D183E和T223S。与野生型相比,4个突变体的比酶活分别提高2.2、1.6、1.5和1.4倍。其中,L231P/N226S的温度稳定性和pH稳定性较野生型均有显著提高,55℃时催化活性为野生型的1.6倍,pH 6.0时催化活...     

腾冲嗜热厌氧菌丙氨酸消旋酶底物通道氨基酸位点的功能

【目的】通过定点突变探究腾冲嗜热厌氧菌MB4中生物合成型丙氨酸消旋酶Tt Alr底物通道内氨基酸位点A172和S173的功能。【方法】利用定点突变PCR技术构建突变体,通过亲和层析法纯化酶蛋白,采用D-氨基酸氧化酶偶联法检测各突变蛋白的活性及其稳定性。【结果】通过定点突变PCR成功得到8个突变体,酶学特性分析发现,A172位点突变为丝氨酸(S)后酶蛋白的相对活性有所提升,但含有该位点突变的酶蛋白稳定性均大幅下降;S173位点突变为天门冬氨酸(D)后导致突变体蛋白的最适反应温度提升了15°C,半衰期大幅延长,但相对活性明显下降。【结论】丙氨酸消旋酶Tt Alr底物通道内A172和S173位点均是影响酶蛋白催化活性和稳定性的关键位点。     

嗜热革节孢GH1 BGL1进口端位点对酶活性及葡萄糖耐受性的影响

糖苷水解酶第一家族(GH1)β-葡萄糖苷酶(BGL1)有葡萄糖耐受性,进口端位点对酶活性及葡萄糖耐受性有很大影响,但具体作用机制尚不清楚。对嗜热革节孢GH1 BGL1进口端的W168、L173、F348、W349、C169、F180、D237、Y179、A260、H307、N335和E437这12个氨基酸残基进行定点突变,将突变酶与野生酶(WT)在毕赤酵母中表达,表达产物纯化后进行酶活性和葡萄糖耐受性测定。与WT相比,所有突变酶活性均有所降低,其中W168H、N335F和W349G几乎丧失活性。突变F180H、D237S、A260N和H307Y的Km低于WT,所有突变的kcat都降低。除L173Q外,其余突变都保持葡萄糖耐受性,在高浓度(400 mmol/L)葡萄糖时,Y179F和D237S酶活受到显著抑制。本研究表明,进口端位点对酶活性及葡萄糖耐受性均具有一定影响,催化活性通道的结构特异性可能是葡萄糖耐受机制。     

β-葡萄糖苷酶Bgl747的定向筛选、重组表达与酶学性质

【背景】β-葡萄糖苷酶(β-Glucosidase,EC3.2.1.21)是3种纤维素酶中的重要成分之一。目前工业用纤维素酶大都来源于木霉等真菌,较少来源于细菌,而且在应用中还存在反应条件(温度、pH等)适用范围窄、酶活力较低、获取成本偏高等问题,这大大限制了β-葡萄糖苷酶的应用。从秸秆还田土壤细菌中筛选β-葡萄糖苷酶有极大地可能性筛选出酶学性质较好的酶,从而解决现存的工业问题。【目的】从土壤中筛选β-葡萄糖苷酶,通过基因重组、表达优化和蛋白纯化获得一株新型β-葡萄糖苷酶,探究其酶学性质,为其在工业上的应用奠定基础。【方法】利用功能筛选法从土壤中筛选出β-葡萄糖苷酶,全长为747 bp,命名为Bgl747,构建重组表达质粒pET-28a-Bgl747,以Escherichia coli BL21(DE3)为宿主菌株,经IPTG诱导实现可溶性表达并优化表达条件,通过His标签蛋白纯化试剂盒纯化获得纯化酶,探究其酶学性质。【结果】β-葡萄糖苷酶Bgl747属于BglB超家族,分子量为27.23 kD,最适反应温度为45°C,最适p H 4.0;最佳诱导条件:当OD600为1.0,加入终浓度为0.6 mmol/L的IPTG,于37°C、220 r/min诱导10 h后β-葡萄糖苷酶Bgl747蛋白获得最高表达量1.82 mg/m L;底物为对硝基苯-β-D-半乳糖苷(p-Nitrophenyl-β-D-Galactopyranoside,p NPG)时的比酶活225.07 U/mg,米氏常数Km值和最大反应速率Vmax分别为0.268mmol/L、547.23μmol/(L·min);1mmol/LK+、1 mmol/L和10 mmol/L Fe2+、30%甲醇、30%乙醇、1 mmol/L和10 mmol/L盐酸胍对酶活都有促进作用,30%TritonX-100及10 mmol/L SDS抑制其酶活效果较为明显;该酶受到产物葡萄糖的反馈抑制,葡萄糖浓度越高,抑制效果越明显,但当葡萄糖浓度为1 mol/L时,酶活仍保持50%以上。【结论】Bgl747反应温度范围较广且稳定,酶学性质优异,为其在纤维素降解等工业应用奠定基础。     

Met196突变提高Brucella melitensis 7α-羟基类固醇脱氢酶的催化效率和稳定性

【目的】通过计算机辅助设计,理性提高羊布鲁氏菌7α-羟基类固醇脱氢酶的催化效率和稳定性,实现酶的高效稳定催化合成。【方法】通过同源建模、分子对接和蛋白-配体相互作用分析,理性设计关键位点的定向突变。结合酶学性质测定、酶促反应动力学分析和圆二色谱测定等实验,测定突变酶的催化功能和稳定性。【结果】与野生型7α-羟基类固醇脱氢酶相比,Met196Ile和Met196Val突变酶的酶活提高了8.33倍和7.41倍,k_cat/K_m值分别提高了4.93和4.37倍,T_m值分别提高了1.75℃和1.10℃。Met196Ile和Met196Val突变酶催化底物鹅去氧胆酸,合成产物7-氧代-石胆酸所需时间从野生型的8h缩短为2h,最高产率约为91%。通过全原子动力学模拟分析了均方根偏差、均方根波动以及蛋白-配体相互作用,阐明了催化性能提高的分子机制。Met196突变诱导的B环（残基Ala145-Pro157）和α7螺旋（残基Val249-Gly265）的刚性增强有利于提高蛋白的稳定性,底物与结合位点或活性位点（Tyr208、Lys212）...     

新一代糖化酶高产菌株的选育及其工业应用

【目的】建立对糖化酶生产菌种黑曲霉随机突变文库进行筛选的方法,以获得糖化酶酶活提高的突变菌株。【方法】以一株可产糖化酶的黑曲霉菌株Aspergillus niger X1为出发菌株,经硫酸二乙酯诱变获得突变文库,采用葡萄糖的结构类似物——2-脱氧葡萄糖进行筛选,并在筛选过程中逐渐提高2-脱氧葡萄糖浓度,定向选育具有2-脱氧葡萄糖抗性、高产糖化酶的突变株。【结果】获得的高产突变菌株DG36摇瓶发酵糖化酶产量比出发菌株A.niger X1提高22.2%–33.8%,经工业水平50 m~3罐发酵测试,突变株DG36发酵128 h糖化酶活可达49094 U/m L,在相同发酵时间内,其酶活较出发菌株A.niger X1提高32.8%,发酵时间缩短16.9%。【结论】本研究开发了一种以2-脱氧葡萄糖为抗性标记选育高产糖化酶突变株的方法,所得突变株DG36遗传性状稳定,与出发菌相比具有菌丝粗壮、产酶期提前、糖化酶活高、发酵时间短、有利于发酵后处理的优点。     

嗜热淀粉芽孢杆菌来源β-葡萄糖苷酶的重组表达与酶学性质

【背景】β-葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.21,β-glucosidase),是纤维素分解酶系中的重要组成部分,目前工业上应用的β-葡萄糖苷酶多数来源于植物和真菌,来源于细菌的较少,且应用中还存在酶活力偏低、热稳定性差、反应条件适用范围窄、酶活力易受产物反馈抑制等问题,增加了经济成本。嗜热微生物具有特殊的遗传信息资源,极有可能从中挖掘到酶学性质优良的新型β-葡萄糖苷酶,从而解决工业难题。【目的】从嗜热淀粉芽孢杆菌(Bacillus thermoamylovorans)基因组中挖掘新型β-葡萄糖苷酶基因,通过基因重组、异源表达和蛋白纯化技术制备新型β-葡萄糖苷酶,并探究其酶学性质,为新型β-葡萄糖苷酶在纤维素水解等领域的应用奠定基础。【方法】人工合成新型β-葡萄糖苷酶基因bgl52,构建重组表达质粒pET22b-bgl52,并用电脉冲法转化到大肠杆菌BL21(DE3)中实现可溶性表达,利用Ni-NTA亲和层析纯化得到高纯度的β-葡萄糖苷酶Bgl52。【结果】实现重组表达质粒pET22b-bgl52在大肠杆菌BL21(DE3)中的可溶性表达,并获得β-葡萄糖苷酶Bgl52纯蛋白,蛋白分子量为52 kD,在70°C和pH 6.5条件下表现出最佳活性;以p-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside (p NPG)为底物时的比酶活为223.7±5.3 U/mg;K_m为9.3±1.2 mmol/L,V_(max)为270.3±4.3μmol/(min·mg);Bgl52偏好性水解β-1,4糖苷键的底物;Fe~(2+)和Mg~(2+)对酶的激活作用明显,Co~(2+)、Cu~(2+)和SDS可抑制其活性;Bgl52是少有的几种葡萄糖和木糖激活型β-葡萄糖苷酶之一,当反应体系中外源添加0.2 mol/L葡萄糖时可提升活力至2.84倍,外源添加0.4 mol/L木糖时可提升活力至3.24倍,同时Bgl52在生理条件下基本不受产物的反馈抑制。【结论】利用嗜热微生物基因组中蕴藏的遗传信息资源,通过现代生物技术方法,可以从中挖掘到酶学性质优良的β-葡萄糖苷酶,为其在纤维素降解等工业领域的应用奠定基础。     

长双歧杆菌N-乙酰氨基己糖1-位激酶的活性位点

【目的】研究长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)JCM1217的N-乙酰氨基己糖1-位激酶(Nacetylhexosamine 1-kinase,Nah K)中对催化活性有影响的位点。【方法】利用点突变试剂盒,获得Nah K的4个位点的共10种单点突变体表达菌株。诱导表达并纯化野生型和突变体酶,用DNS法和NADH偶联的微孔板分光光度法检测野生型及突变体酶的最适p H和最适Mg~(2+)浓度,并测定酶促反应动力学参数。【结果】D208A、D208N、D208E和I24A四种突变体的催化活性几乎丧失。突变体H31A、H31V、F247A和I24V的最适p H由野生型的7.5变为7.0,突变体H31A和F247A的最适Mg~(2+)浓度由野生型的5 mmol/L变为10 mmol/L。反应动力学参数测定结果表明,突变体F247Y对底物Glc NAc/Gal NAc及ATP的催化活性均高于野生型。【结论】通过定点突变,确定了对Nah K催化活性有影响的4个位点,并且获得了一个催化效率提高的突变体(F247Y),为进一步对Nah K进行分子改造奠定了一定基础。     

Tyr78-loop对鱼腥藻来源苯丙氨酸脱氨酶活性的影响

【背景】MIO(Methylidene-imidazol-5-one)依赖型酶中,催化因子Tyr所在Loop(Tyr78-loop)的灵活性显著影响酶学性质。【目的】探讨Tyr78-loop对鱼腥藻来源苯丙氨酸脱氨酶酶活的影响,以提高其反应活性。【方法】将该酶的Tyr78-loop进行分子改造,筛选出酶活提高的突变体,并对突变体的酶学性质进行研究。【结果】突变体S73N、E95V、E95K和S73N/E95K在37°C、pH 8.5下比活分别比原酶提高了34%、30%、18%和35%。蛋白三维结构模拟推测在突变体S73N、E95V和E95K中,位于α螺旋与Tyr78-loop交界处的Asn73、Val95和Lys95与附近氨基酸的氢键作用力数目减少,一定程度上增加了Tyr78-loop的柔性。【结论】Ser73位和Glu95位氨基酸的突变增加了Tyr78-loop的灵活性,提高了苯丙氨酸脱氨酶的酶活。     

粪便微生物宏基因组来源GH1 β-葡萄糖苷酶的重组表达及酶学性质

【背景】β-葡萄糖苷酶是一类重要的纤维素分解酶类。目前较多可培养微生物来源的β-葡萄糖苷酶(Bgl)存在热稳定性和酸碱稳定性差及作用范围窄的问题。【目的】从滇金丝猴粪便微生物宏基因组中挖掘新型β-葡萄糖苷基因,异源表达并研究其酶学性质,为食品等领域提供新型酶资源。【方法】从粪便微生物宏基因组出发,扩增和异源表达β-葡萄糖苷酶基因BglRBS₂6和BglRBS₉,并进行酶学性质研究。【结果】获得GH1家族重组β-葡萄糖苷酶BglRBS₂6和BglRBS₉,分子量分别为60 kD和50 kD。BglRBS₂6的最适作用条件为pH 6.0、45℃;BglRBS₉的最适作用条件为p H 5.0、40°C。Bgl RBS₂6和Bgl RBS₉的Km分别为(0.681 6±0.164 2)μmol/L和(3.317 0±0.871 4)μmol/L。BglRBS₂6具有较好的酸碱耐受性,在pH 5.0–...     

短链壬基酚聚氧乙烯醚脱氢酶脱氢催化机理

【目的】为研究短链壬基酚聚氧乙烯醚脱氢酶(sNPEO-DH)的脱氢氧化机制(基因克隆于Ensifer sp.AS08),我们进行了以下实验。【方法】采用同源序列比对及同源建模的方法筛选出与其辅酶黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)异咯嗪基邻近的4个氨基酸残基。以定点突变方法分别构建了突变体,并进行了重组蛋白的表达纯化和酶活力测定。【结果】野生型和突变体的酶学动力学实验表明,突变体N90A和N509A对亲水性底物聚乙二醇(PEG1000)的相对活性分别降低为51%和89%,对疏水性底物sNPEO的活性分别降低为26%和40%,说明氨基酸残基N90和N509可能与底物的结合相关。突变体H465A的相对活性丧失了90%以上,突变体N507A完全丧失活性;瞬时"停-流"检测实验进一步证明N507A突变体阻断了底物向FAD传递质子的过程,突变体H465A阻断了对FAD还原形成的FADH2脱氢再生的过程。【结论】以上结果说明N507和H465为sNPEO脱氢酶活性中心中参与对底物氧化脱氢及FADH2脱氢再生进行下一次反应的催化位点。     

鱼腥藻苯丙氨酸脱氨酶的基因克隆、表达及最适反应pH改造

【目的】表达鱼腥藻苯丙氨酸脱氨酶(AvPAL),并经分子改造降低其最适反应pH。【方法】PCR克隆AvPAL编码基因,并在大肠杆菌中表达,用Ni2+亲和层析柱和凝胶柱纯化重组蛋白。利用GETAREA软件筛选与催化残基距离较近的暴露于酶分子表面的氨基酸位点,将其突变为带电性质不同的氨基酸,并对突变体进行酶学性质研究。【结果】在大肠杆菌中成功表达了AvPAL,纯化后得到电泳纯的重组酶。突变体E75Q和E75R的最适反应pH从8.5分别偏移到7.5和7.0。E75Q在pH 7.5时的比酶活较原酶提高了25%,在pH 6.5–9.5之间酶的稳定性良好,其最适反应温度为50 °C,在此温度下保温1 h酶活无显著变化。在最适反应条件下,E75Q的kcat/Km值较原酶提高了26.6%。【结论】改变AvPAL酶分子中起路易斯碱作用的关键氨基酸残基(质子受体)附近与之有相互作用的氨基酸的带电性质,降低了AvPAL的最适反应pH,提升了其在医疗领域的应用前景。     

生物炭-牛粪堆肥中产β-葡聚糖苷酶微生物群落应答碳代谢抑制效应

【背景】在高浓度葡萄糖引起的碳代谢抑制效应下,产β-葡聚糖苷酶(β-glucosidase)功能微生物群落为适应碳代谢压力的变化,会差异化表达糖耐受和非糖耐受的功能基因。在堆肥中添加生物炭可以改变微生物生存的环境,进而影响微生物群落的组成与功能。【目的】分析在不同碳代谢压力下添加生物炭对产β-葡聚糖苷酶功能微生物群落的结构组成与功能的影响。【方法】在生物炭牛粪-稻草堆肥中添加葡萄糖、纤维二糖及β-葡聚糖苷酶抑制剂,构建不同的碳代谢压力。以细菌来源GH1家族的β-葡聚糖苷酶基因为分子标记基因构建基因克隆文库。同时测定羧甲基纤维素酶酶活和β-葡聚糖苷酶酶活。【结果】放线菌、变形菌和拟杆菌是功能微生物群落中的优势菌群。其中,CL处理组变形菌数量有所下降,在添加了抑制剂的处理组中,拟杆菌的数量明显上升。高浓度葡萄糖显著抑制了羧甲基纤维素酶酶活,但对β-葡聚糖苷酶酶活影响不大,其中低浓度纤维二糖的处理可以显著诱导β-葡聚糖苷酶活性。GHCH处理组中β-葡聚糖苷酶表现出高浓度葡萄糖激活特性。【结论】添加生物炭未明显影响参与纤维素降解的功能微生物群落对碳代谢抑制效应的应答。与自然堆肥相比,在添加了生...     

D190V点突变提高华根霉Rhizopus chinensis CCTCC M201021脂肪酶的最适温度和热稳定性

【目的】对来源于Rhizopus chinensis CCTCC M201021的脂肪酶进行了D190V定点突变, 提高该酶的最适温度和热稳定性。【方法】对毕赤酵母表达的突变酶D190V与野生型酶r27RCL进行酶学性质比较。【结果】D190V的最适温度比r27RCL高5 °C, 65 °C下的半衰期提高了一倍, 在其他性质方面, 突变酶D190V与r27RCL基本相似。【结论】通过结构分析表明, 定点突变D190V提高该酶稳定性的主要原因可能在于提高了突变位点所在的α螺旋的稳定性以及增强了稳定蛋白质结构的氢键作用力。     

黄翅大白蚁来源β-葡萄糖苷酶的分子改造

纤维素水解成为葡萄糖需要一系列纤维素酶的作用,其中β-葡萄糖苷酶(β-glucosidases)起着至关重要的作用。来自于培菌白蚁中肠的β-葡萄糖苷酶(MbmgBG1)具有较高的葡萄糖耐受性(1.5 mol/L的葡萄糖,保持60%以上的酶活力),但是,酶活力低和热稳定性差限制了β-葡萄糖苷酶(MbmgBG1)在食品以及工业领域中的应用。因此通过对保守氨基酸附近的非保守氨基酸定点突变,获得点突变体(F167L、T176C、E347I、R354K、N393G和V425M),其中突变体F167L、R354K的比活力(底物pNPG)比MbmgBG1分别高出约2倍和4倍。突变体的K_(cat)/K_m值比野生型大,反映了突变体对底物的亲和力以及催化能力比MbmgBG1强。当酶活力保留60%以上时,MbmgBG1所耐受的葡萄糖浓度为1.5 mol/L,而F167L为2.0 mol/L,R354K为3.0 mol/L。这些特性的增强表明,对活性中心附近保守区域内的非保守氨基酸突变,可以较大程度地影响活性,因此需要更深入地研究β-葡萄糖苷酶的活性中心位点,进行改造以提高催化效率。