大肠杆菌rpoH基因的克隆,表达及其产物的纯化

本文用ＰＣＲ方法获得大肠杆菌热休克蛋白转录因子σ３２的编码基因ｒｐｏＨ,并克隆在含有ｔａｃ启动子的表达载体ｐＵＨＥ中,经ＩＰＴＧ诱导,在大肠杆菌中表达了Ｃ端融合有６个寡聚组氨酸的σ３２。表达产物经金属螯合层析一步纯化,达到ＳＤＳ－ＰＡＧＥ银染一条带纯度,氨基酸组成分析及Ｎ端序列分析结果与文献报道一致。３５Ｓ细胞内参入实验表明：即使在较低的温度下,表达产物σ３２（Ｈｉｓ）６也能导致热休克蛋白如ＧｒｏＥｌ、ＤｎａＫ、Ｈｔｐ的大量合成．     

热休克蛋白调控机制

热休克蛋白是生物体体应对温度、pH、渗透压等不利环境刺激时合成的一种保护蛋白。在环境应激时,调控因子可以在转录水平上调控热休克基因的表达,恢复或加速清除细胞内已经变性的蛋白质,使细胞处于稳态并产生耐受性。大量研究发现,热休克调控因子对微生物应激耐受性发挥重要作用,具有广阔的应用前景。综述了6类热休克调控因子的调控机制以及相互作用,对调控因子HrcA、σ^B和CtsR进行了重点阐述,旨在为进一步构建热休克调控网络提供有价值的参考。     

热休克因子1活性的调控机制

热休克因子1(HSF1)是调控热休克蛋白(HSPs)表达的核心转录因子,可被热应激、氧化应激、缺氧/血、pH下降等刺激因素激活,与靶基因的热休克元件特异性结合,增强HSPs表达,发挥内源性保护作用.HSF1活性的调控发生在HSF1三聚化、转位入核、结合DNA和调节转录等多个环节,受到分子伴侣蛋白、磷酸化作用、氧化-还原等机制共同调控,其复杂而精确的调控对于应激应答、生长发育等过程有重要意义.     

人源CPP32基因的表达及其对大肠杆菌生长抑制作用的研究

将人源ＣＰＰ３２基因分别克隆到载体ｐＢＶ３２１和ｐＥＸ３１Ｂ中,得到ｐＢＶ３２１／ＣＰＰ和ｐＥＸ３１Ｂ／ＣＰＰ两种重组质粒。将它们分别转化到大肠杆菌中的结果显示,诱导真核细胞程序性死亡的ＣＰＰ３２基因对大肠杆菌的生长也有明显的抑制作用。ＮｏｒｔｈｅｒｎＢｌｏｔ显示ＣＰＰ３２基因在转录水平上得到了表达。这表明人源ＣＰＰ３２功能上的保守性     

表达载体pHsh对大肠杆菌热休克系统中负调控机制的影响

pHsh是一种由σ32识别和启动外源基因表达的新型高效的大肠杆菌表达载体。正常E.coli细胞在热激诱导条件下,σ32的浓度在5 min内到达高峰,随后被3个负调控蛋白Dnak、DnaJ、GrpE结合导致失活或降解,整个热休克反应持续约12min。在携带有外源基因的高拷贝pHsh 的E.coli细胞中,外源基因却能持续高效表达4～10 h,这一现象表明了此时细胞中的σ32比没有携带质粒的细胞内σ32的浓度要高。σ32浓度的增高有可能是由于3个负调控蛋白Dnak、DnaJ、GrpE在细胞内的含量比正常情况下降低的结果。为了验证这一推测,从E.coli中克隆了Dnak、DnaJ、GrpE的编码基因,表达并初步纯化了其重组蛋白以作分子标记,采用双向电泳技术,分析携带质粒（pHsh+）和不携带质粒的E.coli(pHsh-)细胞在热休克后胞内蛋白质组的差异。该项实验通过与检索到的标准的E.coli蛋白质组图谱进行比较鉴别出的两个蛋白Dnak、GrpE,并通过对比目标点的大小和深浅发现pHsh+中的Dnak均少于pHsh─中的目标蛋白,所得结果与上述假设一致。     

人肺癌细胞CPP32基因的克隆及表达

蛋白酶尤其是ＩＣＥ家族的蛋白酶是细胞死亡机制的核心成分．ＩＣＥ蛋白酶家族中,ＣＰＰ３２（又称Ｙａｍａ,ａｐｏｐａｉｎ）在不同形式的凋亡途径中起核心作用．为深入研究ＣＰＰ３２的结构与功能,克隆了ＣＰＰ３２基因,并在大肠杆菌中进行了表达．采用ＲＴ－ＰＣＲ技术从人肺癌细胞株中获得了ＣＰＰ３２蛋白酶基因．ＤＮＡ序列分析表明,该基因由已报道的编码ＣＰＰ３２αｐ２０亚单位和ＣＰＰ３２βｐ１０亚单位的核苷酸组成,提示ＩＣＥ家族蛋白酶寡聚化可能受ＤＮＡ水平调控．将获得的ＣＰＰ３２基因分别重组到ｐＢＶ３２１和ｐＥＸ３１Ｂ载体上,并分别转化到大肠杆菌中,均获得了ＣＰＰ３２基因的较高表达,表达产物主要以包涵体形式存在．     

有机盐对基因启动子的σ因子选择性的影响

用σ＾７０或σ＾３８和核心酶（Ｅ）组成的大肠杆菌ＲＮＡ聚合酶全酶（Ｅσ）对四种启动子进行了体外转录,结果表明,ｌａｃＵＶ５,ｒｐＩＪ主要被Ｅσ＾７０识别,ｋａｔＥ主要被Ｅσ＾３８识别,ｆｉｃ在低盐浓度时被Ｅσ＾７０识别,在高浓度盐时被Ｅσ＾３８识别,Ｅσ＾３８转录特异性启动子所需酶量大于Ｅσ＾７０转录特异性启动子的酶量,在含有分别对σ＾７０或σ＾３８亲和性大的混和启动子的体外转录中,启动子之间不存     

抗σ因子

Ｔ4噬菌体的ＡｓｉＡ可以抑制大肠杆菌的σ70 因子 ,因而称为抗σ70 因子 ,调节Ｔ4噬菌体早期基因的转录。细菌中的ＦｌｇＭ ,是抗σ2 8因子在细菌鞭毛形成过程中起调控作用。ＦｌｇＭ比较特殊 ,天然形式是未折叠的。枯草杆菌(Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ)的ＳｐｏＩＩＡＢ可抑制芽孢形成过程的专一性σ因子σＦ 和σＧ。该菌中的另一个抗σ因子是ＲｓｂＷ可以抑制应急反应中基因转录所需的σＢ 因子。此外 ,在真细菌类中 ,发现一类新的具内膜接合特性的抗σ因子 ,调控着具有胞外功能蛋白的基因表达 ,因而被分作抗σ因子的细胞外因子 …     

大肠杆菌应激诱导基因表达谱芯片分析

应激是影响微生物发酵生产的重要因素。为挖掘细菌耐热和化合物胁迫等调控相关基因,揭示微生物应激反应调控的分子机制,采用Affymetrix全基因组表达谱芯片,对42℃热激和0.1 mol/L CaCl2处理的大肠杆菌E. coli基因谱进行分析。结果表明,应激处理菌体中共有583个差异表达基因,包括374个表达量上调和209个表达量下调差异基因;GO功能分类将差异表达基因分为34类,大部分差异基因的分子功能覆盖结合、催化和转运等生物学活性;差异基因KEGG分析显示富集在28个通路,以ABC转运蛋白、鞭毛组装、双组分系统、尿素循环和氨基酸新陈代谢以及Ⅲ型分泌系统等通路为主要代表;应激胁迫的E. coli主要通过噬菌体休克蛋白操纵子(psp)基因进行逆境适应性转录调节,同时伴随着酶和氨基酸的合成基因以及细胞氧化还原态平衡基因的调控变化。     

与结瘤基因nodF的启动子相互重叠的启动子起始一个 …

在根瘤菌中,结瘤基因的表达以转录水平上复杂的调控。通过体外转录、引物延伸等一系列实验在豌豆根瘤菌中发现一个与结瘤基因ｎｏｄＦ的启动子相互重叠,但转录方向相反的启动子,该启动子特异起始一个新的ＲＮＡ分子－ｐｘ２的转录。Ｎｏｒｔｈｅｒｎ印迹确定ｐｘ２的长度为０．７２ｋｂ,并且证明ｐｘ２的转录是依赖于根瘤菌的与Ｅ．ｃｏｌｉσ＾７０同源的ｓｉｇｍａ因子。ｐｘ２的转录启始位点在体内、体外均相同,它坐落在结瘤     

与结瘤基因nodF的启动子相互重叠的启动子起始一个RNA分子的转录(英文)

在根瘤菌中 ,结瘤基因的表达受到转录水平上复杂的调控。通过体外转录、引物延伸等一系列实验在豌豆根瘤菌中发现一个与结瘤基因nodF的启动子相互重叠 ,但转录方向相反的启动子 ,该启动子特异起始一个新的RNA分子———px2 的转录。Northern印迹确定 px2 的长度为 0 .72kb ,并且证明 px2 的转录是依赖于根瘤菌的与E .coliσ70 同源的sigma因子。px2的转录启始位点在体内、体外均相同 ,它坐落在结瘤基因顺式元件的“nodbox”内。进一步发现 px2 的体外转录受到一个参与结瘤基因调控的蛋白———Px的抑制。有结果显示 ,px2 影响结瘤基因的表达     

ECF-σ^5因子参与阿维链霉菌中阿维菌素合成和环境胁迫的研究北大核心CSCD

【目的】研究阿维链霉菌中ECF-σ^5子对阿维菌素合成、形态分化和环境胁迫的调控,为揭示阿维菌素生物合成的调控机制和ECF-σ因子的调控网络提供依据。【方法】构建sig5基因缺失、回补和过表达菌株,通过形态观察和摇瓶发酵实验初步确定σ^5形态分化、菌体生长和阿维菌素合成的影响。进一步通过RT-q PCR、EMSA和Ch IP实验寻找确定σ^5靶基因,再通过胁迫实验揭示σ^5能参与的胁迫反应。【结果】对sig5相关突变株的摇瓶发酵和形态观察结果表明,σ^5阿维菌素合成具有抑制作用,但不影响菌体生长和形态分化。sig5基因缺失导致阿维菌素生物合成途径特异性正调控基因ave R和结构基因ave A1的转录水平提高,但σ^5不与ave R和ave A1的启动子区结合。σ^5结合在自身基因及附近基因SAV612、SAV615、SAV618的启动子区,正调控这些基因及所在操纵子的表达。胁迫实验暗示σ^5能参与渗透压引起的胁迫反应。【结论】ECF-σ^5子在转录水平间接负调控阿维菌素的合成。     

蛋白激酶MSK在表观遗传学调控中的作用及其生物学意义

丝裂原和应激激活的蛋白激酶(MSK)是一类核内丝/苏氨酸蛋白激酶,参与丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)信号通路介导的下游基因转录调控和表观遗传学调控.首先,MSK是MAPK通路的下游媒介分子.在丝裂原或应激刺激下,p38或ERK激酶通过级联磷酸化激活MSK蛋白.然后,活化的MSK介导转录因子磷酸化活化和组蛋白H3的10位丝氨酸磷酸化.MSK介导的组蛋白H3磷酸化,可引发组蛋白乙酰化和甲基化修饰的动态变化,相互协同或拮抗,开放染色质结构,利于诱导型基因的表达.除组蛋白H3外,MSK直接磷酸化的下游底物还包括CREB、NF-κB等转录因子以及多个非转录相关蛋白.因此,MSK能在多层次调控基因表达和细胞功能,广泛参与肿瘤转化、炎症反应、神经突触可塑性以及心肌肥大等生物学事件.本文将简要介绍MSK蛋白的研究进展,探讨其在转录调控、表观遗传学修饰等生物学事件中的作用.     

热激转录因子在植物抗非生物胁迫中的功能研究进展

植物在遭受环境胁迫时会产生一系列应激反应,而热激转录因子可通过介导热激蛋白或其他热诱导基因的转录和表达,来参与调控植物抵抗逆境胁迫过程和其他生命活动。主要介绍了植物热激转录因子的基本蛋白结构域,阐述了3类热激转录因子在抗极端温度（高温、低温）胁迫、干旱胁迫、高盐胁迫、活性氧胁迫中的功能与作用机制,并探讨和展望了植物热激转录因子在植物育种和提高植物抗逆性的研究中的发展与应用前景,以期为深入研究热激转录因子在调控植物抵抗逆境胁迫中的生物学功能与机制提供理论参考。     

肿瘤抑制蛋白p53的活性调控

p53 又称为分子警察或基因的保护神.在面对不同类型和强度的应激时,细胞究竟选择细胞周期停滞、凋亡还是衰老时 p53发挥中心调节作用.作为一种转录调控因子它主要通过对下游的目的基因进行转录调控来发挥功能.p53 结合 DNA 启动子能力也可通过多种方式被调节.这些调节机制主要包括 p53 的亚细胞定位调控、p53 的蛋白稳定性调控和 p53 的翻译后修饰.     

地中海拟无枝菌酸菌U32染色体特性的脉冲场电泳分析

地中海拟无枝菌酸菌(Amycolatopsis mediterranei)U32是产力复霉素SV的工业生产菌株。采用脉冲场电泳分析发现,地中海拟无枝菌酸菌U32仅有一条约10 Mb的线性染色体, 没有内源性质粒。利用Southern杂交法,对11个编码力复霉素生物合成、相关初级、次级代谢关键酶以及调控蛋白的基因,在U32染色体DNA的PshBI酶切片段上进行了定位。分析发现在一条长度约700kb的PshBI酶切片段上,分别存在着力复霉素合成基因簇(rif)、氮代谢的亚硝酸还原酶小亚基基因(nasD)、衔接初级与次级代谢的甲基丙二酰变位酶基因(mcm)、脂肪酸代谢的乙酰辅酶A羧化酶生物素载体蛋白基因(accA)以及一套核糖体RNA转录单元。同时还发现U32至少有5套核糖体RNA转录单元。其余定位的基因均只出现单一杂交信号。     

人Boule基因启动子区结合蛋白的生物信息学分析

目的：对精子发生RNA结合蛋白Boule基因启动子区结合蛋白进行生物信息学分析。方法：从基因参考序列数据库获取Boule基因启动子区序列,使用TFSEARCH程序对启动子序列中的转录因子结合位点进行预测。结果：成功获得长度为2kb的人Boule基因启动子区序列。该启动子区Thresholdscore〉90的共有60个转录因子结合位点,涉及sox家族、GATA结合蛋白家族、热休克因子家族、锌指蛋白Kruppel家族、POU家族、runt家族、同源异型框基因家族、TALE类同源结构蛋白家族、转录因子螺旋环螺旋家族、IKAROS家族、FOX家族11个家族的转录因子和3个TATAbox。结论：Boule基因表达的调控是在一定时间或空间上、一种或多种调节蛋白作用的复杂过程。调控Boule基因表达的转录因子绝大部分与胚胎发育、性别决定、个体生长密切相关。     

热休克转录因子1与机体耐热性的相关研究

热休克转录因子1(HSF1)能够启动各种热休克蛋白基因的诱导表达,这对防止机体免受热应激损伤具有重要的意义。从HSF1的结构、功能及活化过程等几个方面阐述了HSF1的生理特征及其与机体耐热性能之间的关系。     

转录因子在植物干旱应激中的功能研究进展

转录因子是一种多功能蛋白,在感知应激信号、应答相应应激基因表达及传导应激信号中起着关键作用。干旱是影响植物生长发育的主要非生物胁迫之一。为了适应干旱环境,植物发展了复杂的分子机制,其中转录因子可同时控制多种途径调控干旱应激,是操纵调控和应激响应途径的有力工具。近年来,越来越多的植物转录因子的功能被阐明,了解转录因子在干旱应激的功能,对植物的工程抗旱有重要的实践意义。综述转录因子在植物干旱应激中的功能研究进展,以期为今后转录因子的研究和利用提供理论依据,培育具有较强抗旱能力的植物。     

小热应激蛋白与动物繁殖机能的关系研究进展

热应激是指机体受到超过本身体温调节能力的高温刺激而产生的非特异性防御反应,热应激蛋白是机体热应激反应发生后细胞新合成或合成数量增加的一类蛋白质,小分子热应激蛋白是热应激蛋白家族中重要的一类成员,作为分子伴侣在细胞的正常代谢和生理条件下表达和发挥作用。目前已证实小热应激蛋白还参与调控细胞增殖和凋亡、生物膜膜脂的流动性、核质穿梭作用、免疫应答和疾病治疗等。本综述分别就小热应激蛋白在雄性动物生精细胞发育过程中参与的增殖、分化及凋亡调控作用以及在雌性动物卵母细胞发育、成熟、妊娠维持和生育调节功能的研究进展做一概述,旨在为小热应激蛋白生物学功能深入研究提供参考。