狂犬病毒在慢性感染细胞培养中对宿主细胞的影响

<正> 本文报告二个细胞系(BHK-21/13S和HeP-2)对狂犬病毒慢性感染过程长期观察的结果。 狂犬病毒在二种细胞中慢性感染过程的观察,结果表明BHK-21/135狂犬病毒的特征是细胞含有病毒抗原水平呈周期性地幅度很大的波动(从100％到<1％)并且表明当抗原阳性细胞较多时细胞单层稀薄,在抗原阳性细胞较少的情况下,可见到在稠密的细胞单层上有局灶性或单个的含有病毒抗原的细胞。狂犬病毒慢性感染滴度较低,不超过3-4lgLD_(50)/0.03ml。 早期文献曾已阐明狂犬病毒的感染滴度与含萤光抗原或特异性包涵体的细胞数量有平行关系。作者是从30代以后的细胞开始进行有系统的观察,而上述文献所提供的是25     

自动化神经组织单细胞悬液制备探索性实验教学实践

组织单细胞悬液制备是细胞生物学中的基础技能,常用的组织解离方法有机械法和酶法,不同解离方法在细胞得率和细胞活性上差异较大。在神经科学的各个研究领域,包括发育研究、疾病病理生理学、药物和毒素筛选,以及神经疾病动物模型的移植等均需要使用分离的单细胞。然而神经组织细胞间紧密的黏附性及轴突和树突的易碎性阻碍单细胞的获得。自动化组织处理器结合机械法与酶法双重作用可获得高质量的细胞悬液。利用这一技术开展自主设计型神经组织单细胞悬液制备实验,以提升学生综合分析应用能力,拓展对前沿科学技术的认识。通过科研与教学相融合的方式,更好地激发医学生的学习热情,提高医学生的科研素质,实现研究型与创新型人才培养的目标。     

一种快速从猪细小病毒或假狂犬病毒悬液中除去污染微生物的新方法

一种快速从猪细小病毒或假狂犬病毒悬液中除去污染微生物的新方法由于多数商业化销售的胎牛血清常被无细胞病变的牛腹泻病毒（ＢＶＤ－Ｖ）所污染，为了除去污染的微生物，曾试用了包括亲和层析、梯度离心和封闭细胞膜上与病毒互补的受体等多种方法。这些方法既费时又费用...     

在日本鹌鹑胚细胞培养适应的狂犬病毒MNIIVP-74株的特性

<正>引言 狂犬病毒对细胞培养的适应是困难的。因试验室毒株在哺乳动物脑腔接种传代已经持续了许多年,只有少数病毒株能适应至鸡胚和鸭胚上。为了基础研究和生产出安全疫苗,均需获得尽可能没有杂质的病毒制品。 1936年～1937年曾有报导,用小鼠和鸡胚脑组织块繁殖狂犬病毒。以后发现小鼠室管膜细胞,幼犬和小猫的小脑和海马角部位,及叙利亚地鼠肾细胞对狂犬病毒有易感     

初生小鼠脾脏细胞培养制备SCE

近年来,一些实验室多采用外周血、骨髓和睾丸等为材料来制备SCE,尚未见到利用淋巴器官内的淋巴细胞来制备SCE的报道。小鼠是生物学、医学等学科研究中最常用的实验动物之一,作者利用初生小鼠的脾脏细胞体外培养制备SCE,取得了成功。生后3—5天的杂种小白鼠幼鼠,经体表消毒后剖腹取脾脏。除去结缔组织,用Hank's     

阿奇霉素干混悬剂的制备

目的:研究阿奇霉素干混悬剂制备工艺。方法:筛选阿奇霉素干混悬剂中各辅料的最佳配比,采用流化床制粒技术对本品处方及工艺进行研究。结果:确定了阿奇霉素干混悬剂的最佳工艺处方。结论:采用流化床制粒技术制备阿奇霉素干混悬剂配方可行、工艺简单。     

重组CHO乙肝疫苗细胞培养收换液工艺改进

利用CHO细胞生产重组乙肝疫苗,在细胞培养收换液工艺中建立管道化生产线。采用大罐配成新鲜工作液,过滤除菌,经管道直接输入细胞培养瓶内;细胞培养上清的收集也经管道或直接倒入不锈钢罐内。工艺改进后,细胞原液收获率提高15％,配液污染率降低12％,同时降低了成本。     

胰蛋白酶的制备及其在细胞培养中的应用研究

无菌采集健康牛胰脏,用0.125 mol/L的硫酸对牛胰脏进行预处理和保存,并对原材料的细菌、真菌、内毒素、支原体、噬菌体和一些病毒外源因子进行检测,筛选合格原料.通过盐析、CM-Sepharose-FF层析、超滤等方法对胰蛋白酶进行提取和纯化.结果表明:经筛选原料提纯的胰蛋白酶通过细胞传代实验240 h后,细胞生长良好,形态正常,而未经筛选直接提取的胰蛋白酶通过细胞传代实验144 h后,细胞出现拉丝、病变等异常情况.     

一种狂犬病毒疫苗佐剂的制备及其免疫效果研究

目的:以角鲨烯、山梨醇、吐温为组分,在琥珀酸缓冲液中混和甲型副伤寒沙门菌鞭毛蛋白制备复合佐剂Nano-fla,评价该佐剂对人二倍体狂犬疫苗的免疫效果和安全性。方法:以人二倍体细胞制备的狂犬灭活疫苗为抗原,BALB/c小鼠设置PBS对照组、全剂量疫苗组、半剂量疫苗组、低剂量佐剂组(含半剂量抗原+5μg鞭毛蛋白)、中等剂量佐剂组(含半剂量抗原+10μg鞭毛蛋白),免疫程序为在0、3、7 d肌肉注射,并在首针免疫后的第7、14 d尾静脉采血分离血清,通过快速免疫荧光灶抑制实验检测中和抗体,通过酶联免疫斑点实验检测细胞因子水平。结果:首针免疫后第7 d,中等剂量佐剂组的中和抗体达保护效力水平,显著高于全剂量疫苗组和低剂量佐剂组;第14 d时中等剂量佐剂组的IgG抗体浓度显著高于全剂量疫苗对照组;第14 d中等剂量佐剂组与全剂量疫苗组相比,分泌IFN-γ和IL-4的淋巴细胞数量显著增加。结论:复合佐剂Nano-fla应用到狂犬疫苗中,能有效刺激小鼠体液免疫和细胞免疫应答,更早地产生中和抗体,且能有效降低抗原用量,具有潜在应用价值。     

人母乳中分离的链球菌菌悬液的制备及其对新生小鼠成活率的影响

为研究出生至4周龄每天口服107CFU母乳链球菌对新生小鼠的影响,需要制备在-80℃冻存4周、解冻后仍有至少1á×109 CFU/mL活菌的菌悬液.前期分离到人母乳链球菌Streptococus salivarius F286和S.parasanguinis F278.S.salivarius F286和 S.parasanguinis F278在 M17液体培养基厌氧生长至平台期时,活菌浓度高于1×109CFU/mL,分别用M17、M17+10％脱脂牛乳、磷酸盐缓冲溶液(PBS)、PBS+10％脱脂牛乳将平台期的 S.salivarius F286和 S.parasanguinis F278制成不浓缩或5倍浓缩的菌悬液,-80℃冻存4周后,只有PBS+10％脱脂牛乳制备的5倍浓缩的S.salivarius F286菌悬液和M17制备的S.parasanguinis F278菌悬液解冻后活菌数量始终高于1×109 CFU/mL.因为化学成分复杂的M17培养基可能影响动物的代谢和免疫,因此用含有PBS、10％脱脂牛乳和链球菌的菌悬液口饲动物.仔鼠出生后1～14 d,每天口饲解冻的、含有107CFUS.salivariusF286的PBS+10％脱脂牛乳菌悬液,或者新鲜制备的、含有107 CFU S.parasanguinis F278的PBS菌悬液以及等体积20％脱脂牛乳,仔鼠成活率约为83％(其余仔鼠死于母鼠拒绝喂养),说明107 CFU的S.salivarius F286或S.parasanguinis F278不会引起仔鼠感染死亡.本研究中,我们比较不同方法制备的菌悬液在-80℃冻存后细菌的存活量,确定最优的菌悬液制备方法,并评估细菌对仔鼠成活率的影响,确定了两株母乳链球菌的生物安全性,本实验流程对制备和保存用于灌胃/口饲动物的其他种类细菌的菌悬液具有借鉴意义.     

水解乳蛋白的制备及在细胞培养中的初步应用

采用正交法优化复合酶(胰酶和中性蛋白酶)水解凝乳酶干酪素制备水解乳蛋白(lacto-protein hydrolysate,LPH)的制备工艺,通过BHK和Vero细胞的培养效果检测水解乳蛋白的促细胞生长作用。结果显示水解乳蛋白的最佳制备工艺为:胰酶∶中性蛋白酶=2∶1(质量比),40℃,pH 7.0,酶/底物(E/S)=1∶5(质量比)水解6 h。所得产物氨基氮含量3.21 g/L,多肽含量35.63 g/L,游离氨基酸含量14.17 mg/mL,收率达40.20%。BHK和Vero细胞培养24 h,细胞密度均为各自空白的2.0倍,分别为Hyclone产品的1.0倍和0.86倍;培养48h,分别为各自空白的5.0倍和4.0倍,均为Hyclone产品的0.88倍。因此,该工艺简单,耗时短,制备得水解乳蛋白对BHK和Vero细胞生长有明显的促进作用。     

狂犬病毒糖蛋白综述

狂犬病是一种由狂犬病毒引起的高度致命的人兽共患传染病,在五种狂犬病毒蛋白中,糖蛋白是唯一暴露在包膜外的,是一种保护性抗原,可以有效地诱导机体产生中和性抗体。本文主要重点介绍了糖蛋白的结构与功能。     

狂犬病毒与狂犬病

从病毒的分类地位、病毒的生物学特性、病毒粒子的形态结构、病毒基因组结构与功能、病毒感染与复制、病毒致病机制及病毒引起的疾病诸方面对狂犬病毒的研究进展作了综合评述,并对该领域的研究热点和方向作了探讨.     

基于核糖体展示技术进行抗狂犬病毒人源抗体的制备

构建了核糖体展示人源抗狂犬病毒单链抗体(scFv)库,筛选制备特异抗狂犬病毒糖蛋白(RVGp)的稳定性人源抗体.应用核糖体抗体库技术,从经狂犬病毒Vero疫苗免疫的志愿者外周血淋巴细胞中分离、构建核糖体展示scFv基因库.体外转录翻译后,以RVGp重组蛋白作筛选抗原,采用亲和富集法淘选RVGp特异性scFv抗体基因.在原核系统pET22b(+)/BL21(DE3)中实现scFv抗体片段的可溶性表达,ELISA鉴定阳性克隆.然后对筛选的scFv进行稳定性改构,构建VH-Lc-VK稳定性抗体,并对其生物学活性进行初步研究.成功构建了库容量约为6.2×1012的核糖体展示scFv抗体基因库.在180个筛选克隆中,克隆RB24、RB71、RB109和RB156显示出较高的ELISA值,其基因序列分析结果显示,它们是全新的人源抗RVGp抗体.改构后的抗RVGp VH-Lc-VK抗体的稳定性明显改进,可特异识别RVGp并有效中和狂犬病毒,抑制狂犬病毒对靶细胞的感染.以上结果表明,人源抗RVGp特异性抗体的获得,为狂犬病的有效预防、诊断和治疗提供了新的途径,而且将为其他人源抗体的制备提供理论依据和技术基础.     

伪狂犬病毒的gE蛋白胞外区真核表达以及单克隆抗体制备

旨在构建gE基因胞外区真核表达载体,在HEK293F细胞中表达并纯化得到稳定的可溶性蛋白,并通过杂交瘤筛选获得表达gE蛋白的特异性单克隆抗体。生物信息学方法分析gE基因序列,构建gE胞外区真核表达载体pcDNA3.4-gE-6×His和pcDNA3.4-gE-m Fc,通过瞬时转染的方法在HEK293F细胞中进行表达并进一步纯化。通过Western blot和SDS-PAGE鉴定和比较gE-6×His和gE-mFc融合蛋白表达情况。利用伪狂犬灭活全病毒免疫小鼠,电融合获得杂交瘤融合细胞,通过gE-mFc蛋白和IFA筛选出稳定且特异性结合gE蛋白的阳性杂交瘤细胞株。结果表明,成功构建pcDNA3.4-gE-6×His和pcDNA3.4-gE-mFc表达载体,表达纯化得到gE-6×His和gE-mFc可溶性蛋白。比较发现gE-6×His蛋白表达量低,稳定性差。而gE-mFc蛋白表达量高,稳定性好,一次性纯化后纯度可达85%。进一步利用gE-mFc筛选获得9株稳定性和特异性高的阳性杂交瘤细胞株。首次利用哺乳动物细胞表达系统表达并获得稳定的可溶性gE蛋白,并利用其筛选获得g E特异性单克隆杂交瘤细胞株。     

担子菌及其木质纤维素降解液在红豆杉细胞培养中的作用

研究了担子菌及其木质纤维素降解液在红豆杉细胞培养中的作用,结果表明,担子菌Ｂｄｓ及其木质纤维素降解液制备的诱导子对紫杉醇生物合成具有明显的促进作用,且以木质纤维素发酵致第７天的降解液对紫杉醇生物合成的诱导作用最明显。因此,可以用担子菌Ｂｄｓ发酵木质纤维素所得的降解液制备紫杉醇生物合成的诱导子。