嗜水气单胞菌感染的中华鳖主要器官差减cDNA文库的构建

以致病性嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）人工感染的中华鳖（Trionyx sinensis）肝、脾、肾组织为材料,应用抑制性差减杂交（SSH）技术,构建了嗜水气单胞菌感染组织的差减cDNA文库。以中华鳖管家基因-βactin作为差减指标检测该文库差减效率达210倍,表明感染细菌后某些差异表达基因得到了相应倍数的富集。将获得的cDNA片段连接到pMD18-T载体并转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。PCR阳性检测显示差减片段在150—800bp之间。该差减cDNA文库的构建为快速分离和鉴定中华鳖与细菌感染相关的免疫基因及从分子水平探讨中华鳖的病理和抗感染免疫机制奠定了基础。     

中华绒螯蟹卵巢差减cDNA文库的构建

应用抑制性差减杂交技术构建中华绒螯蟹卵巢两个发育时期的差减cDNA文库。正向差减杂交以Ⅲ期卵巢为试验方、Ⅱ期卵巢为驱动方,反向差减杂交以Ⅱ期卵巢为试验方、Ⅲ期卵巢为驱动方;将所获差减cDNA片段克隆入质粒表达载体,转化大肠杆菌JM109。最后获得的正、反向差减文库分别含863、360个重组子。PCR扩增鉴定正、反向差减cDNA文库的插入片段平均大小分别为360和160bp,表明所构建的差减言语库适合进一步研究中华绒螯蟹卵巢发育相关基因。     

文昌鱼性腺差减cDNA文库的构建

本研究以日本文昌鱼(Branchiostoma japonicum)性腺cDNA为材料,应用抑制性差减杂交技术构建文昌鱼雌雄性腺的差减cDNA文库.正向差减杂交以卵巢为试验方、精巢为驱动方,反向差减杂交以精巢为试验方、卵巢为驱动方,将所获差减cDNA片段克隆插入质粒表达载体,转化大肠杆菌DH5α,最后获得的正、反向差减文库分别含459、243个重组子.PCR 扩增鉴定正、反向差减cDNA文库的插入片段,其中90%左右的克隆皆能扩增出有效产物,插入片段范围为200-600 bp,符合差减文库PCR产物片段的大小.随机选取30个阳性克隆测序分析,得到26有效基因片段,进一步从中选取16个序列,用实时定量PCR对文库质量进行验证,结果表明所建文库能够达到富集雌雄性腺差异表达基因的目的.文昌鱼性腺差减文库的构建,为进一步分离、鉴定性腺分化和发育相关基因奠定了基础[动物学报 54(3):482-48 8,2008].     

草原龙胆MADS-box基因的克隆及表达分析

植物MADS-box 基因家族编码高度保守的转录因子, 参与了包括花发育在内的多种发育进程。为阐释双子叶植物草原龙胆(Eustoma grandiflorum)花器官发育的分子调控机制, 根据MADS-box基因保守序列设计简并引物, 用3'-RACE方法从 草原龙胆中克隆了4个花器官特异表达的MADS-box家族基因。序列和系统进化树分析表明, 这4个基因分别与金鱼草DEF基因、矮牵牛FBP3基因和FBP6基因以及拟南芥SEP3基因具有很高的同源性, 分别属DEF/GLO、AG-like和SEP-l ike亚家族。从而将这4个基因分别命名为EgDEF1、EgGLO1、EgPLE1和EgSEP3-1。推导的氨基酸序列显示, 这些基因编码的蛋白质都包含高度保守的MADS结构域、I结构域和K结构域, 每个基因均有其亚家族特异的C-末端功能域。基因特异性RT-PCR检测结果显示: EgDEF1 在萼片、花瓣、雄蕊及胚珠中高丰度表达, 在心皮中微量表达; 而EgGLO1在花瓣和雄蕊中高丰度表达, 在萼片中微量表达; 在根、茎、叶等营养器官中均未检测到上述2个基因的表达。EgPLE1在雌蕊、心皮和胚珠中特异表达, 但表达的丰度存在差异, 在雄蕊中的表达有所减弱。SEP-like亚家族基因EgSEP3-1在四轮花器官和胚珠中均特异表达,且表达丰度相对一致。     

中华绒螯蟹卵巢RACB cDNA文库的构建

应用抑制性差减杂交技术,已经获得了中华绒螯蟹卵巢发育过程中差异表达基因的部分cDNA序列。为了进一步获得基因的全长cDNA序列,运用SMART技术,成功构建了中华绒螯蟹卵巢(Ⅲ期)RACE cDNA文库。琼脂糖凝胶电泳结果表明,文库所含全长cDNA的长度主要集中在500—2000bP之间,RACE PCR结果表明,所用基因特异性引物与接头引物皆能扩增出产物,说明所构文库的质量较好,适于用RACE方法从中分离中华绒螯蟹卵巢发育相关基因的全长cDNA。     

草原龙胆MADS-box基因的克隆及表达分析

植物MADS-box基因家族编码高度保守的转录因子,参与了包括花发育在内的多种发育进程。为阐释双子叶植物草原龙胆（Eustoma grandiflorum）花器官发育的分子调控机制,根据MADS-box基因保守序列设计简并引物,用3＇-RACE方法从草原龙胆中克隆了4个花器官特异表达的MADS-box家族基因。序列和系统进化树分析表明,这4个基因分别与金鱼草DEF基因、矮牵牛FBP3基因和FBP6基因以及拟南芥SEP3基因具有很高的同源性,分别属DEF/GLO、AG-like和SEP-like亚家族。从而将这4个基因分别命名为EgDEF1、EgGLO1、EgPLE1和EgSEP3-1。推导的氨基酸序列显示,这些基因编码的蛋白质都包含高度保守的MADS结构域、I结构域和K结构域,每个基因均有其亚家族特异的C-末端功能域。基因特异性RT-PCR检测结果显示：EgDEF1在萼片、花瓣、雄蕊及胚珠中高丰度表达,在心皮中微量表达;而EgGLO1在花瓣和雄蕊中高丰度表达,在萼片中微量表达;在根、茎、叶等营养器官中均未检测到上述2个基因的表达。EgPLE1在雌蕊、心皮和胚珠中特异表达,但表达的丰度存在差异,在雄蕊中的表达有所减弱。SEP-like亚家族基因EgSEP3-1在四轮花器官和胚珠中均特异表达,且表达丰度相对一致。     

中华绒螯蟹卵巢RACE Cdna文库的构建

应用抑制性差减杂交技术 ,已经获得了中华绒螯蟹卵巢发育过程中差异表达基因的部分cDNA序列。为了进一步获得基因的全长cDNA序列 ,运用SMART技术 ,成功构建了中华绒螯蟹卵巢 (Ⅲ期 )RACEcDNA文库。琼脂糖凝胶电泳结果表明 ,文库所含全长cDNA的长度主要集中在 5 0 0～ 2 0 0 0bp之间 ,RACEPCR结果表明 ,所用基因特异性引物与接头引物皆能扩增出产物 ,说明所构文库的质量较好 ,适于用RACE方法从中分离中华绒螯蟹卵巢发育相关基因的全长cDNA。     

鱼类培养细胞抗病毒基因差减cDNA文库的构建

紫外线灭活的草鱼出血病病毒（GCHV）能诱导鲫囊胚培养细胞（CAB）产生高滴度的干扰素,从而诱导宿主细胞基因表达的改变并处于抗病毒状态。提取灭活病毒诱导未经病毒诱导的CAB细胞mRNA,利用抑制性差减杂交技术,成功构建了鱼类培养细胞抗病毒基因差减cDNA文库。以鲫管家基因α－tubulin和β－actin作为差减指标,检测差减cDNA文库的差减效率分别高达2^15和2^7倍,表明经过病毒诱导后的细胞中,某些差异表达基因的富集效率也接近2^15倍。鱼类抗病毒基因差减cDNA文库的建立对快速分离、克隆鱼类抗病毒相关基因和认识鱼类细胞抗病毒免疫的分子机理有重要意义。     

拟南芥AtPI基因植物表达载体的构建及其在烟草中的遗传转化

花是被子植物主要的繁殖器官,在繁育后代的过程中,发挥着极其重要的作用,PISTILLATA(PI)基因作为控制花器官发育的B类功能基因中的一员,在花器官发育中起到重要的作用。为探究PI基因在花瓣和雄蕊发育中的功能,本文以拟南芥(Arabidopsis thaliana)中的PI基因作为研究对象,利用PCR技术从拟南芥花序c DNA扩增出At PI基因,构建植物表达载体(p ROKⅡ-At PI)并进行烟草(Nicotiana tobacum)转化。转基因植株的PCR检测结果表明,At PI基因已经整合到了烟草基因组中。在T2代植株中,通过实时定量荧光PCR检测显示,At PI在m RNA水平也均有表达。过量表达PI的转基因烟草在花器官中存在明显表型,与野生型相比主要表现为转基因植株花冠变小,雄蕊缩短,果实畸形且子房基部比野生型长5~10 mm,上述结果表明At PI基因是特异性参与雄蕊和花瓣的发育并起着至关重要的作用。     

双链RNA病毒诱导的牙鲆胚胎细胞差减cDNA文库的构建

以紫外线灭活的dsRNA病毒草鱼出血病病毒(GCHV)诱导和模拟诱导的牙鲆胚胎细胞为材料,利用抑制性差减杂交(SSH)技术,成功构建了双链RNA病毒诱导的牙鲆胚胎细胞(FEC)差减cDNA文库.以管家基因α-tublin作为差减指标,经检测,该文库差减效率达2 10倍,表明经病毒诱导后某些差异表达基因也得到了相应倍数的富集.将获得的cDNA片段连接到pGEM-T载体,PCR检测显示差减片段在250bp～2 000bp之间.该差减cDNA文库的构建为从分子水平研究牙鲆培养细胞对dsRNA病毒的免疫反应、以及进一步鉴定和克隆差异表达基因打下了坚实基础.     

荷花花蕾cDNA文库构建及质量评价

为理解荷花Nelumbo nucifera花器官转录组表达情况,分别选取不同花型的代表品种‘洪湖红莲’Nelumbo nucifera ‘Honghu Honglian’(单瓣)、‘唐招提寺莲’N. nucifera ‘Tangzhaotisi Lian’(重瓣)和‘千瓣莲’N. nucifera ‘Qianban Lian’(千瓣及全重瓣)的花蕾为材料分离mRNA,利用SMART技术合成双链cDNA,经限制性内切酶SfiI酶切后回收去掉接头和500 bp以下片段的cDNA。将cDNA与pUC19载体连接,构建荷花花蕾cDNA文库。经检测,该文库容量为1.12 × 106 pfu·mL-1,插入片段大小集中在500～2000 bp,重组率为95%。该文库的成功构建为荷花花蕾期转录组数据的开发及其花器官发育相关基因的功能研究奠定了分子基础。     

柔嫩艾美耳球虫孢子发育阶段虫体抑制性消减文库的构建

为了分离鉴定柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)孢子发育阶段虫体的差异表达基因,分别以柔嫩艾美耳球虫未孢子化卵囊和孢子化卵囊为驱动组、子孢子为实验组,或未孢子化卵囊为驱动组、孢子化卵囊为实验组,利用抑制性消减杂交(SSH)技术,构建了2个子孢子cDNA消减文库和1个孢子化卵囊cDNA消减文库。随机从3个cDNA消减文库中分别挑取50个克隆,经PCR鉴定2个子孢子cDNA消减文库的重组率都为96%,孢子化卵囊cDNA消减文库的重组率为98%。从每个文库中随机挑取50个克隆测序,并进行同源性比较分析,结果显示:从孢子化卵囊cDNA消减文库中获得了13个单一有效序列,其中8个EST与已知蛋白同源性很高;从2个子孢子cDNA消减文库中共获得了40个单一有效序列,其中9个EST与已知蛋白同源,其余可能为柔嫩艾美耳球虫的新基因。这些结果为分离柔嫩艾美耳球虫新功能基因和进一步探索防治球虫病的方法提供了理论基础。     

植物花发育的分子机理研究进展

花的发育分为开花决定、花的发端和花器官的发育三个阶段。植物开花由多条途径诱导,包括光周期和光质诱导、春化作用、自主途径、赤霉素诱导、碳水化合物诱导等;植物体本身也存在着开花抑制途径。各种开花诱导途径能激活花分生组织特性基因,使茎端分生组织转变为花分生组织。花器官的发育由器官特性基因决定,这些基因的精确表达需要花分生组织特性基因的激活和多个正、负调节因子的调控;另有一类基因控制着花发育的对称性。花发育机理的研究具有重要的理论意义和广泛的应用前景。     

From floral induction to floral shape

The initial emphasis in molecular-genetic studies of flower development was on homeotic genes that control organ identity, which is rather invariant between different species. Studies in flower development during the past three years have dealt with more diverse aspects of flower development, including floral induction and floral shape. Genes identified in the respective pathways might hold clues to the diversity of modern angiosperms.     

植物花发育的分子机理研究进展

花的发育分为开花决定、花的发端和花器官的发育三个阶段。植物开花由多条途径诱导,包括光周期和光质诱导、春化作用、自主途径、赤霉素诱导、碳水化合物诱导等;植物体本身也存在着开花抑制途径。各种开花诱导途径能激活花分生组织特性基因,使茎端分生组织转变为花分生组织。花器官的发育由器官特性基因决定,这些基因的精确表达需要花分生组织特性基因的激活和多个正、负调节因子的调控;另有一类基因控制着花发育的对称性。花发育机理的研究具有重要的理论意义和广泛的应用前景。