培养构体的无蛋白和低蛋白的培养基(续完)

<正> 对无蛋白培养基培养勾体广泛变异的血清型的适应性作了研究。共计17个血清型(27株)在无蛋白培养基中至少转种过9次见表3。当移植期间勾体最高产量和所需时间任何被试菌株没有明显的变异。在无蛋白培养基上培养致死地鼠的流感伤寒11808株的传代必须加入0.1％白蛋白,但对亲肾脑的或无毒株则否。     

应用DNA芯片技术对禽致病性大肠杆菌可能致病基因体外表达水平的研究

应用DNA芯片研究禽致病性大肠杆菌可能致病基因的表达.构建禽致病性大肠杆菌毒力基因、潜在毒力基因的DNA芯片,应用基因芯片技术对同属O2血清型的禽高致病性大肠杆菌E058株和低致病性大肠杆菌E526株在体外LB培养基和鸡血清培养状态下进行差异表达分析.结果:在体外LB静置培养状态下,低致病株E526与高致病株E058相比共有16个差异基因,均为下调基因.在鸡血清静置培养中,E526与E058相比共有15个差异基因,均为下调基因.应用基因芯片成功筛选了禽致病性大肠杆菌在体外不同条件下的毒力基因及可能毒力基因中差异表达基因,表明一些铁摄取系统相关基因对APEC的毒力较重要,同时也筛选出了一些新的可能致病基因aes-1,aes-2,aes-3,aes-4,aes-6,aes-8,aes-10,aes-13,aes-15,aes-31等.     

不同培养基中MDCK细胞生长及代谢动力学研究

[目的]为筛选适应于MDCK细胞大规模培养的最佳培养基并揭示其代谢动力学规律。[方法]选取商业化的培养基DMEM(试验组A)、EMEM(试验组B)、MEM(试验组C)、M199(试验组D)、DMEM/F12(试验组E)及DMEM:EMEM复合培养基(试验组F)用于MDCK细胞传代培养,研究不同培养基对MDCK细胞生长特性的影响,分析MDCK细胞生长过程中葡萄糖(Gluc)、乳酸(Lac)、谷氨酰胺(Gln)和氨(NH4+)的代谢情况,并进一步进行细胞工厂的培养验证。[结果]结果表明MDCK细胞均能在试验组A、B、E、F四种培养基中生长,其最大增殖浓度E A F B,差异显著(P 0. 05);倍增时间B F A E,差异显著(P 0. 05);细胞比生长速率E A F B,差异不显著(P 0. 05)。不同培养基培养MDCK细胞对数生长期平均葡萄糖比消耗速率、谷氨酰胺比消耗速率及氨比生成速率差异均不显著(P 0. 05),乳酸比生成速率差异显著(P 0. 05)。在试验组A和E培养基中细胞能实现高密度增殖,再将其进行细胞工厂扩大培养验证,发现两种培养基在培养48 h时均能达到单层致密,且细胞密度均达到8. 0×10~8/cells以上,差异不显著(P 0. 05)。[结论]综合研究结果及规模化生产成本因素,采用DMEM培养基(试验组A)培养MDCK细胞,其最大增殖浓度达到6. 4×10~5/m L,倍增时间为22. 835 h,比生长速率为0. 558,可进行大规模培养,为工业化生产提供依据。     

lpxL和lpxM基因对O1、O78血清型禽致病性大肠杆菌毒力的影响

【目的】为探究脂多糖对O1、O78血清型禽致病性大肠杆菌(Avian pathogenic Escherichia coli,APEC)致病作用的影响。【方法】选取负责脂质A生物合成相关基因lpx L和lpx M,利用λ噬菌体的Red同源重组系统分别构建APECE516(O1血清型)和APECE522(O78血清型)缺失株E516Δlpx L、E516Δlpx M、E516Δlpx LΔlpx M、E522Δlpx L、E522Δlpx M和E522Δlpx LΔlpx M,并通过体内外试验对其生物学特性及致病性进行研究。【结果】各菌株生长速度基本一致。E516Δlpx L、E516Δlpx LΔlpx M、E522Δlpx M和E522Δlpx LΔlpx M的抗血清补体杀菌能力和抗鸡巨噬细胞HD-11吞噬能力较野生株显著下降,而缺失株E516Δlpx M、E522Δlpx L与野生株相比无明显差异;半数致死剂量测定结果显示,除E516Δlpx M、E522Δlpx L外,各缺失株毒力降低1000倍左右;SPF鸡体内动态分布试验结果显示,各缺失株在鸡体内定殖能力较野生株显著下降,但回补株的毒力未能恢复至野生株水平。【结论】lpx L和lpx M基因与O1血清型APECE516株和O78血清型APECE522株的毒力有关,但是lpx L和lpx M基因对E516和E522菌株毒力的影响存在差异。     

甜茶组织培养研究

甜茶的茎段和实生苗培养在MS基本培养基中,研究植物激素对器官形成的影响,试验结果表明BA0.5-2.0毫克/升明显促进芽的形成和增殖;而对照(基本培养基)无形成芽。细胞分裂素对芽的起动是必需的。BA0.5-2.0毫克/升和GA_s1.0毫克/升配合使用,对茎段形成芽和增殖反而减少,但形成的苗较高和幼叶生长良好。通过继代培养,可繁殖大量小苗,它揭示出同一块外植体生长出许多小植株的可能,将无根苗转入含有IBA0.25-0.50毫克/升的1/2MS培养基中,能诱导生根,发展完整植株。试管苗移植土壤中,获得成功,幼苗生长良好。     

宿主特异性差异导致沙门氏菌在猪体内定植对特定基因要求的不同

自1885年Salmon等分离得到猪霍乱沙门氏菌以来,目前已检出沙门氏菌血清型2 500余种。沙门氏菌(salmonella)属的成员可感染多种动物和人,大部分具有很强的致病性。其中许多血清型菌能在人和动物之间交叉感染。目前,人们利用全身性疾病小鼠模型对沙门氏菌的致病性做了大量的研究。常用的小鼠模型与体外细胞培养分析相结合,这一     

不同培养基对发菜细胞生长和光合活性的影响

研究测定了发菜(NostocflagelliformeBorn.etFlah.)细胞在不同培养基中的生长速率、光合作用和叶绿素荧光活性。结果显示培养11d后:Detmer培养基中叶绿素a的含量为1.08mg/L,Kratz-Myers培养基中叶绿素a的含量为1.87mg/L,水生104号培养基中叶绿素a的含量为1.21mg/L,BG11培养基中叶绿素a的含量为2.18mg/L,表明在BG11培养基中培养的细胞具有最高生长速率;与另外4种不同浓度的BG11培养基相比,上述BG11培养基培养的发菜具有最大的光合速率Pm(218.1μmolO2.mg-1chla.h-1)和最高的PSII光化学效率(Fv/Fm=0.349)。实验结果表明,BG11是适合发菜生长的培养基,对其光合作用和叶绿素荧光活性具有显著促进作用。     

流感病毒在无动物细胞的细菌共生培养基里的培养研究

流行性感冒病毒流行时,在一些病人的上呼吸道里,常可以见到流感病毒和一些细菌(如甲型链球菌、葡萄球菌、流感杆菌等)共存,以往的实验也证明它们的关系比较密切。此试验发现:流感病毒在仅有甲型链球菌生长的培养基中有自我复制的现象,共生培养的病毒经过一系列的病毒学实验方法,证明确实是流感病毒。流感病毒在共生培养基里与它在鸡胚里的生长曲线基本相同,共生培养基里,只要细菌生长,流感病毒就能生长,在不同的温度(15℃、22℃、37℃)条件下,流感病毒和细菌的生长趋势出现密切的平行关系。甲型链球菌以外的其它细菌,如乙型链球菌、肠球菌、葡萄球菌、酵母菌、革兰氏阳性杆菌等菌株也能与流感病毒共生,只有个别的菌株不共生。共生培养的流感病毒能在较低的温度(22℃)环境下保持它的活性达2个月之久;在8℃的环境里,流感病毒也能共生繁殖,经过长期低温共生培养,其致病性减弱;流感病毒和其它两种病毒能在同一共生培养基里共生繁殖。实验研究中还简要讨论了共生的机理和实际应用等问题。     

luxS基因缺失对禽致病性大肠杆菌O1、O2和O78三种血清型分离株的生物学特性影响

【目的】LuxS/AI-2型密度群体感应系统产生的自诱导信号分子AI-2(AI-2的产生需要luxS基因编码的Lux S蛋白参与)参与对细菌众多生理功能的调控。探讨luxS对不同血清型禽致病性大肠杆菌(Avian Pathogenicity Escherichia coli,APEC)生物学特性的影响。【方法】本研究以APEC优势血清型APECO_1(O_1血清型)、DE17(O_2血清型)、E940(O_(78)血清型)及其相应luxS缺失株为研究对象,对野生株和缺失株的生长特性、生物被膜形成、rdar(red,dry and rough)形态、运动性和耐药性等特性进行分析。【结果】luxS基因的缺失不影响APEC生长特性,但导致APEC不能产生AI-2;此外,luxS基因的缺失显著降低APECO_1和E940的生物被膜形成(P0.05),而DE17的生物被膜形成无显著变化。对各菌株的rdar形态和运动性检测结果表明,luxS基因的缺失改变了APECO_1的rdar形态,对DE17和E940并无影响;显著降低了APECO_1和DE17运动能力,对E940并无影响。荧光定量PCR检测结果表明,luxS基因的缺失显著降低APECO_1、DE17和E940与细菌运动性相关的鞭毛基因fli G和fli I的转录水平(P0.05)。此外,对各菌株的耐药性检测结果表明,luxS基因缺失导致APECO_1对头孢吡肟和丁胺卡那由耐药变为高敏,同时对氯霉素与E940相同由高敏变为耐药,但对DE17的耐药性无显著改变。【结论】luxS对APEC的生物学特性具有重要的调控作用,且这种调控具有菌株特异性。     

植物乳杆菌培养上清对不同血清型沙门氏菌的抑制效果及作用机理

【目的】探究植物乳杆菌培养上清(Lactobacillus plantarum culture supernatant,LPC)对3种血清型沙门氏菌猪霍乱(Salmonella cholerae,SC)、肠炎(Salmonella enteritidis,SE)和鸡白痢(Salmonella pullorum, SP)的生长和致病性的抑制作用效果及机理。【方法】将2%LPC与3种沙门氏菌分别共培养后,采用比浊法及牛津杯抑菌圈试验检测沙门氏菌生长情况及LPC中的主要抑菌物质,使用实时荧光定量PCR (quantitative real-time polymerase chain reaction, qRT-PCR)探究沙门氏菌致病性相关基因表达水平,最后通过结晶紫染色法检测沙门氏菌的生物被膜。【结果】2%LPC能够显著抑制3种沙门氏菌的生长,其作用效果与庆大霉素(gentamicin, GM)相近且对SE的生长抑制效果优于GM,其主要抑菌物质为有机酸;2%LPC对3株沙门氏菌SPI-1编码的主要毒力基因(InvA、InvF、SopE、SopB、SipB、HilA和SipA)、SPI-2毒...     

哺乳类基因工程的一些实验操作 实验10X噬菌体DNA 体外包装

一、需用的菌株及其特性鉴定 1.菌株及其基因型 (1）大肠杆菌E. coli BHB2688，基因型为：N205 rec＾一〔rimm"`9 clts, b2, red-, Earn, Sam/r.lo (2）大肠杆菌E. coli BHB 2690，基因型为： N205 recA- [rimm"9`. cIts, b2, red-. Dam, Sam/r]. (3）大肠杆菌E. coli K802，基因型为：hsdR+, hsdM+.} gal-, met-, SUPHO 2.鉴定clrs基因 (1) BHB 2688和BHB 2690各自接种在2只LB 培养基上。一只置32℃下培养，另一只置42℃下培 养。在32℃培养的平板上挑取单菌落，接种在LB培 养液中，32℃培养过夜。 (2）再将培养液中生长的细菌划线接种在2只 LB培养基上，分别置32℃和42℃下培养。如果细菌 只在32℃ 下生长，则可用于制备包装用的抽提物。 3.鉴定，cA基因 (1)在LB平板上，平行划线接种BHB 2688, BHB 2690和K802o (2）用厚纸遮住培养皿的一半，打开培养皿盖置 紫外线下照射。然后在犯℃下培养过夜。 (3）厚纸遮挡部分的培养基上，BHB2688和BHB 269。生长，紫外线照射的培养基上则不生长。K802 不受紫外线照射的影响都能够生长。     

大肠艾希氏菌腹泻(续二)

<正> 2.2肠致病性大肠艾希氏菌(EPEC)流行病学把大肠艾希氏菌当作婴儿肠炎病原的想法是1885年Echerich第一次从婴儿腹泻分离出细菌开始的。在二十年代和三十年代有几位工作者试图证明E.coli的几种特异血清型是病原,但直到1940年Kaufmann制订出明确的血清分型表,仍未取得重要的进展。四十年代末期在伦敦和阿伯丁两地婴儿腹泻严重流行时的流行病学调查表明某些血清型是其病原。在其后的年代里,经流行病学调查证明还有一些其他血清型是其病原,在1961年有17种“O”血清群被认做是许多国家的流行性婴儿肠炎的病原。它们是O群:18,20,25,26,28,44,55,86,111,112,114,119,125,126,127,128及142。这些O群中的六种(26,55,111,119,127,118)特别普遍。在这些O群的     

大肠杆菌和肺炎克雷伯氏菌的共培养研究

为研究大肠杆菌(Escherichia coli)和肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)混菌体系,构建了基于抗生素筛选的2株重组菌。将携带卡那霉素抗性基因的载体pET-28a转化到肺炎克雷伯氏菌中,获得重组菌K.pneumoniae(pET-28a);将携带氯霉素抗性基因cm的重组载体pET-cm(卡那霉素和氯霉素双抗性载体)转化到大肠杆菌中,获得重组菌E.coli(pET-cm),在卡那霉素抗性培养基中单独培养及混合培养上述两株重组菌。结果发现:单独培养条件下,E.coli与K.pneumoniae的相对菌体密度为57.87%;混合培养条件下,E.coli与K.pneumoniae的相对菌体密度为1.94%;E.coli和K.pneumoniae相对于各自单独培养的存活率分别为2.57%和76.60%。上述结果表明,K.pneumoniae为混菌体系的优势菌,可强烈抑制E.coli的生长。     

比较研究白蚁巢上生长的担子菌——鸡(土从)菌及其分生孢子阶段小白球菌的生长与其基质的生态关系

鸡(土从)菌Termitomyces albuminosus(Berk.)Heim..及其分生孢子阶段小白球菌在基础培养基上生长缓慢,而在基础培养基上分别添加乌头酸、延胡索酸、柠檬酸或者添加生物素、VB_1、VB_2等都能促进鸡(土从)菌和小白球菌菌丝体及其分生孢子的生长。实验还表明维生素混合使用效果比单一添加为好。鸡(土从)菌和小白球菌生长的合适的碳源是麦芽糖、葡萄糖、果糖、蔗糖,而淀粉、甘露醇效果不良;合适的氮源是蛋白胨、花生粉、黄豆粉、甘氨酸和铵盐,但是小白球菌生长的培养基中含氮量不宜过高,一般为0.2％左右,而鸡(土从)菌要求含氮量较高,最佳的氮源浓度范围为0.4—0.6％。鸡(土从)菌和小白球菌菌丝体生长的pH值范围为4.0—5.5之间,鸡(土从)菌最适的pH值在4.0—4.5之间,而小白球菌最适pH值随着培养基组成和CO_2浓度的不同会有所变化。小白球菌具有忍耐高浓度CO_2(15％)的特性,静置培养比摇瓶培养生长更好。鸡(土从)菌菌丝体却需要较低的CO_2浓度方能生长良好,它更适宜于摇瓶培养。目前鸡(土从)菌和小白球菌菌丝体在实验室条件下生长都非常良好,液体培养已获得成功,为人工栽培和利用鸡(土从)菌提供了一条可能的途径。     

光照和培养基对内生真菌棘豆链格孢Alternaria oxytropis苦马豆素含量的影响

以小花棘豆内生真菌棘豆链格孢Alternaria oxytropis野生株OW7.8及其酵母氨酸还原酶基因缺失突变株M1为材料,研究它们在不同培养基上和不同光照下菌落生长速率与苦马豆素含量。结果表明：OW7.8在胡萝卜葡萄糖琼脂培养基上暗培养时生长速度最快,为(2.57±0.17)mm/d,而M1则在马铃薯葡萄糖琼脂培养基上暗培养时生长速度最快,为(4.93±0.10mm)/d。不同培养基和光照条件下,相同菌株苦马豆素的含量差异不显著（P>0.05）;不同菌株在相同培养条件下其苦马豆素含量差异显著（P<0.05）。     

成牛血清低分子量成分在杂交瘤细胞体外“无血清”培养中的利用

利用适量的(3．5～14％)成牛血清低分子成分超滤液(LMW－CS,排阻M=300 00)、10mg／L转铁蛋白(T)、10 mg／L胰岛素(I)、20μmol／L乙醇胺(E)、40 n mol／L硒酸钠(s,当以RPMll640为基础液时用)等诸补充成分替代胎牛血清加到基础液RPMll640或1：1(v／v)的IMDM与Ham’s F₁₂混合液中构成本实验性“无血清”培养基。培养在此种培养基中的杂交瘤细胞其最高细胞密度可以达到甚至超过培养在含胎牛血清的生长培养基中的最高细胞密度。对于杂交瘤细胞生长,4％的LMW－CS基本满足要求;T、I、E、S四种补充成分中乙醇胺(E)是首位影响因子; LMW－cs与TIES两部分之间的协同作用极为显著,两者缺一不可。     

魔芋软腐病菌分子鉴定与遗传多样性

通过对分离的魔芋软腐病菌株和其它参试菌株的致病性测定、选择性培养基培养性状观察和16S-23S rDNA转录间隔区PCR(ITS-PCR)分析,将测试的33株软腐病菌株主要分为3个组群。第1组群为胡萝卜软腐欧文氏杆菌胡萝卜软腐亚种(Erwinia carotovorasubsp.carotovora,E.c.c.);第2组群为菊欧文氏杆菌(Erwinia chrysanthemi,E.ch.);还有一组未能确定的菌株。利用细菌基因组重复序列通用引物BOX和J3进行Rep-PCR特异性扩增,引起软腐病的菌株E.c.c.和E.ch.(ITS-PCR鉴定)种内的Rep-PCR指纹存在明显的遗传分化,经聚类分析,在0.1水平上把E.c.c.13株区分为5个类群。     

培养基血清浓度对人表皮干细胞增殖分化的影响

目的:比较不同血清浓度培养体系对表皮干细胞增殖分化的影响.方法:采用两步酶消化法和IV型胶原差速贴壁相结合的方法获得人原代表皮干细胞,分别以0%、5%、10%、15%和20%血清浓度的培养基在96孔板中进行培养.观察表皮干细胞形态,克隆形成及增殖的情况,应用四甲基偶氯唑蓝(MTT)比色法检测各组细胞存活和生长情况,分析量效和时效关系;持续传代培养细胞,每次传代的同时取适量细胞,用免疫细胞化学的方法进行表皮干细胞和表皮细胞相应标志物(K19、K14和K10)的测定.结果:表皮干细胞在各种血清浓度的培养基内均能形成克隆,增殖良好.用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法测定,所得相同时间点各组OD值在统计学上没有差异(P>0.05),表皮干细胞生长速度各组间无差异.第1代表皮干细胞K19均有表达,而K14和K10表达均为阴性;其后高血清浓度(15%、20%)培养基中细胞较低血清浓度(0%、5%)先出现K14、K10蛋白的表达;培养至第10代是各组细胞均出现K10高表达,而K19、K14表达阴性.结论:在低血清浓度(0%、5%)的培养基中表皮干细胞生长良好,且能够相对较好保持表皮干细胞的特性.     

从多花野牡丹和野牡丹花柄直接诱导出芽

1植物名称多花野牡丹(Melastoma affine)和野牡丹(M.candidum). 2材料类别野外生长并处于开花期的花柄和幼嫩叶片. 3培养条件 MS基本培养基,含2%蔗糖、0.6%琼脂,pH 5.4.诱导培养基:(1)MS NAA 1.0 mg·L-1(单位下同) 6-BA 1.0,(2)MS 6-BA 1.0,(3)MS NAA 1.0;芽的生长增殖培养基:(4)MS NAA 0.5 6-BA 3.0;生根培养基:(5)MS IBA 0.1.培养温度(27±3)℃,光照度1100lx,光照时间10 h·d-1.4生长与分化情况嫩叶外植体先以洗洁精刷洗干净后,以0.1%升汞消毒8 min,并以无菌水清洗,切成2～3段放在诱导培养基上暗培养.花柄外植体经0.1%升汞消毒10 min后,以无菌水清洗.剥去花柄表面的粗糙皮层,然后将其切成0.3 cm长的切段,接种于诱导培养基上暗培养.     

抑制差减杂交筛选禽致病性大肠杆菌基因组差异片段及其分析

采用抑制差减杂交技术(Suppression subtractive hybridization,SSH)对禽致病性大肠杆菌E037株(血清型O78)与非致病菌株K-12MG1655以及同一O2血清型高致病菌株E058与低致病菌株E526进行基因组差异片段克隆与分析。从E037株中共检出17个特异性差异片段,E058株中共检出32个特异性差异片段。经同源分析,这些序列可分为4类:质粒相关序列、噬菌体相关序列、已知功能序列、未知功能序列。这些差异片段包含许多重要的大肠杆菌毒力相关基因,如大肠杆菌素、气杆菌素受体、铁基因簇等。49个片段中,14个片段与其它微生物基因组同源性较高。结果表明,大肠杆菌高致病株与低致病菌株或非致病菌株基因组间存在较多差异基因,其中包括毒力、毒力相关基因、代谢以及噬菌体等基因成分。