布鲁氏菌L7/L12蛋白的基因克隆与原核表达

本研究对羊布鲁氏菌L7/L12蛋白进行了表达和纯化。首先从布鲁氏菌M5基因组中克隆L7/L12目的基因片段,连接至pMD-19T载体,转化入E.coli DH5α感受态细胞,PCR鉴定及测序鉴定正确后对其进行双酶切,构建重组质粒pGEX-6P-1-L7/L12并利用E.coli BL21(DE3)进行诱导表达。羊布鲁氏菌L7/L12基因片段大小为375 bp。SDS-PAGE检测蛋白大小为13 kD,与预测值相符。Western blotting方法检测其免疫学特性。实验结果表明,成功构建了pGEX-6P-1-L7/L12原核表达载体,并在大肠杆菌中成功表达了L7/L12重组蛋白,Western blotting法检测其具有免疫反应。本实验为下一步研究蛋白功能及布鲁氏菌新型疫苗的研制提供了实验基础。     

大肠杆菌N~α-乙酰基转移酶RimI对人胸腺素α原N末端乙酰化修饰的影响

目的:研究大肠杆菌Nα-乙酰基转移酶RimI对人胸腺素α原(ProTα)N末端乙酰化修饰的影响。方法:在大肠杆菌中共表达ProTα与大肠杆菌Nα-乙酰基转移酶RimI,同时设置只表达ProTα的对照菌,分别提取纯化ProTα,利用HPLC检测其发生乙酰化修饰的程度。结果:ProTα的乙酰化修饰发生在翻译后水平,有无RimI的过表达、诱导时间的长短以及这两个因素之间的交叉效应均对ProTα的乙酰化程度有影响,其F值分别为53.8、89.22及16.28,P值均小于0.0001;无论有无RimI过表达,乙酰化的ProTα所占比例在诱导6 h后逐渐升高(P<0.0001);在过表达Ri-mI的菌株中,乙酰化的ProTα在诱导12 h后占37.4%,而在无RimI过表达的菌株中占64.3%;RimI对ProTα乙酰化的抑制作用从诱导6 h后开始显现(P=0.0007)。结论:在大肠杆菌中,过量的Nα-乙酰基转移酶RimI可抑制人胸腺素α原的乙酰化修饰。     

胸腺素α1的乙酰化修饰不依赖于乙酰转移酶RimL

目的：考察大肠杆菌乙酰转移酶RimL对胸腺素α1（Tα1）乙酰化修饰的影响。方法：构建含500bp同源臂的卡那抗性基因打靶片段,利用Red同源重组系统,使大肠杆菌B121（DE3）的rimL基因插入失活,随后导入质粒pCP20去除抗性基因,构建突变菌株rimL-BL21（DE3）;将重组质粒pET-Tα1-L12分别转入出发菌株和突变菌株中进行表达,经固定金属离子亲和层析和反向高效液相层析后,将所得纯品进行质谱分析,精确测定相对分子质量。结果：PCR鉴定结果证明成功敲除rimL基因;质谱结果表明,rimL基因敲除菌中所表达的Tα1-L12融合蛋白与出发菌株一样,均有部分乙酰化修饰。结论：Tα1的乙酰化修饰并不依赖于RimL。     

人组蛋白α-氨基乙酰基转移酶Nat11表达纯化、晶体生长及底物结合研究

α-氨基乙酰基转移酶11(Nat11)催化组蛋白H4和H2A氨基端乙酰化修饰,发挥着重要的表观遗传调控功能。将人Nat11基因构建到原核表达载体p SUMO中,转化入大肠杆菌BL21(DE3)进行重组表达。通过镍柱亲和层析等一系列体外纯化步骤,获得高纯度Nat11。利用等温滴定量热法(ITC),测得Nat11与底物多肽微摩尔量级结合常数。利用质谱技术,发现纯化后的Nat11结合有大肠杆菌内源产生的乙酰辅酶A或辅酶A,在ITC滴定过程中可以产生对多肽底物的乙酰化修饰,表明纯化获得的Nat11在溶液中具有酶活力。随后,对Nat11进行晶体生长研究,通过初筛优化获得蛋白截短体及底物-酶融合蛋白单晶。     

痘苗病毒E3L蛋白的结构与功能

E3L蛋白是痘苗病毒基因组所编码的一种非常重要的毒力蛋白。E3L结构高度保守,其N端为Z-DNA结合域(Zα),C端为双链RNA结合域(dsRBM),两者均为其致病性所必需。E3L具有抵御宿主细胞干扰素及其诱导蛋白的抗病毒作用,以及抑制细胞凋亡、抵抗RNA干扰等多方面的重要功能,这些策略有助于逃避宿主的抗病毒免疫。     

幽门螺杆菌PPK 的纯化与功能分析*

目的:表达纯化幽门螺杆菌多聚磷酸激酶,并测定其功能。方法:将幽门螺杆菌多聚磷酸激酶基因克隆入原核表达载体PQE80L中,在大肠杆菌(E.coli)DH5-α中表达。用BD Talon resin纯化目的蛋白。并在体外测定其合成多聚磷酸盐及转化多聚磷酸盐至ATP的能力。结果:成功构建了原核表达载体,得到高表达量的融合蛋白。经BD Talon resin纯化获得较高纯度的His-多聚磷酸激酶N端融合蛋白。体外实验证实该酶可以有效合成不同链长的多聚磷酸盐,并且在适当条件下可将多聚磷酸盐转化为ATP。结论:利用原核表达载体可很好表达幽门螺杆菌多聚磷酸激酶,纯化后的蛋白具有良好生物活性,是一个具备合成多聚磷酸盐及转化其为ATP的双向功能的酶。     

人胸腺素α1在大肠杆菌中的融合表达

利用基因工程表达的方法,在大肠杆菌中通过与GST蛋白融合的方式高效表达了胸腺素α1前体基因,随后经亲和层析和SP强阳离子树脂纯化相结合的方式,得到了胸腺素前体肽段31肽和N端未经乙酰化修饰的28肽。融合蛋白表达量达到菌体总蛋白的35%～40%,样品肽的产量也达到了约200mg/L（肽/发酵液）的产量。经质谱测定,分子量分别为3366和3066。BalB/C小鼠脾脏淋巴细胞体外测活表明,所构建的GSTTα1融合蛋白和纯化后的产物对于淋巴细胞具有比较明显的增殖作用,其中N端未经乙酰化的28肽产物与31肽产物活性相近,均对淋巴细胞具有明显的刺激增殖作用。     

真菌细胞色素P450在大肠杆菌中的表达

【背景】真菌细胞色素P450蛋白在大肠杆菌中表达水平低甚至不表达,近期研究发现通过对该类蛋白氨基端(N端)氨基酸序列的修饰可优化其表达水平。【目的】在大肠杆菌系统中表达预测功能为P450酶的焦曲霉094102菌株的Au8002蛋白,为真菌P450蛋白在大肠杆菌表达系统中的N端氨基酸序列修饰策略提供有效依据。【方法】对野生型P450蛋白Au8002的氨基酸序列进行分析,对其N端序列进行了3种序列修饰,并在诱导蛋白表达时添加P450生物合成前体5-氨基乙酰丙酸(5-ALA),研究N端氨基酸序列修饰策略及前体添加对真菌P450在大肠杆菌中蛋白表达的影响。【结果】SDS-PAGE和Westernblot检测结果显示,对目的蛋白进行的3种氨基酸序列修饰均使Au8002蛋白获得了表达,前体5-ALA的添加提高了目的蛋白表达量。其中对目的蛋白进行N端全长截短时可部分增加其可溶性,同时也验证了其特征性的CO结合能力。【结论】对预测为P450酶的菌株094102蛋白Au8002氨基端(N端)氨基酸序列的修饰有效解决了其在大肠杆菌内不表达的难题,实现了其可溶性表达;另一方面P450生物合成前体5-ALA的添加也能有效提高该类蛋白的表达水平,上述策略对改善其它该类蛋白在大肠杆菌内的表达水平具有借鉴意义。     

组蛋白去乙酰化酶HDAC2突变体构建及其SUMO修饰E3连接酶功能研究

目的:针对人源HDAC2外显子拼接功能区(CDS)基因,运用双管法突变体构建技术,构建HDAC2去乙酰化酶功能失活的片段缺失与关键位点突变体,检测突变体的SUMO化修饰E3连接酶功能活性,探究此HDAC2新功能是否受到其固有的去乙酰化酶功能的影响.方法:设计HDAC2 100-322位氨基酸密码子缺失的片段突变体引物与142位H→A点突变体引物,利用HDAC2的pcDNA3.1真核表达质粒为模板,通过耐热Fusion酶PCR反应双管扩增相应的单链DNA,并经退火、模板酶切、乙醇纯化、感受态转化、抗性平板筛选、测序鉴定获得两种HDAC2去乙酰化酶功能失活的pcDNA3.1真核表达质粒.免疫印迹检测突变体质粒在细胞中的表达,荧光素酶(LUC)报告基因实验检测其SUMO化修饰E3连接酶功能活性.结果:成功构建HDAC2去乙酰化功能失活的片段缺失突变体pcDNA3.1/HDAC2 (DEL 100-322AA)与关键位点突变体pcDNA3.1/HDAC2(142 H→A).C-myc标签的免疫印迹检测显示两种突变体在细胞中可稳定表达.将突变体转染进入三种细胞,LUC报告基因分析结果显示突变体仍具有E3连接酶功能活性.结论:HDAC2的E3连接酶功能不依赖于其去乙酰化酶活性,并且E3连接酶功能结构域位于其序列C端.     

Red同源重组敲除nagE和manX对大肠杆菌发酵生产氨基葡萄糖的影响?

氨基葡萄糖(GlcN)又称氨基葡糖或葡糖胺,是葡萄糖的一个羟基被氨基取代后的化合物,在医药和保健领域具有广泛应用。在前期研究中,我们构建了一株可高效合成GlcN和其乙酰化衍生物N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)的重组大肠肝菌Escherichia coli-glms-gna1(在下游提取过程中用弱酸进行脱乙酰化即可将GlcNAc转化为GlcN)。但研究发现,发酵过程中GlcN和GlcNAc能被转运至胞内作为碳源利用,导致胞外产量显著减少。为阻断胞外GlcN和GlcNAc向胞内的转运,利用Red同源重组技术将E.coli-glms-gna1的乙酰氨基葡萄糖磷酸转运子编码基因nagE和甘露糖磷酸转运子编码基因manX敲除,获得nagE基因敲除的工程菌E.coli-glms-gna1-nagE和nagE/manX基因双敲除的工程菌E.coli-glms-gna1-nagE-manX,并在7 L发酵罐上利用构建的工程菌进行GlcN和GlcNAc的发酵生产。实验结果表明:培养对照菌株E.coli-glms-gna1至12 h时GlcN产量达到最大值4.06 g/L,GlcNAc产量达到最大值41.46 g/L;而培养单基因敲除菌株E.coli-glms-gna1-nagE至12 h时GlcN产量达到最大值4.38 g/L(是对照菌株的1.08倍),GlcNAc产量达到最大值71.80 g/L(是对照菌株的1.7倍);培养双基因敲除菌株E.coli-glms-gna1-nagE-manX至10 h时GlcN产量达到最大值4.82 g/L(是对照菌株的1.2倍),GlcNAc产量达到最大值118.78 g/L(是对照菌株的2.86倍)。这表明nagE和manX基因的敲除可显著降低GlcN和GlcNAc向胞内的转运,进而提高其在胞外的积累。研究结果对最终实现GlcN的工业化生产具有一定的指导意义。     

一种重组人α1型干扰素突变体IFN-α1/86D的纯化与鉴定

本文研究了重组人α1型干扰素突变体IFN-α1/86D在摇瓶培养和分批发酵培养的重组大肠杆菌DH5α株中的表达动态,并采用阳离子交换层析和抗α1型干扰素单克隆抗体亲和层析的两步流程对其进行了纯化,得到SDS-PAGE纯及高效液相层析(HPLC)纯的IFN-α1/86D产品,共比活性为2.3×10~7单位/毫克蛋白。N端氨基酸序列测定的结果表明,纯化产品的纯度在95％以上,但其N端不均一,产品中含有两种N端序列正确的IFN-α1/86D活性分子,即约75％为去Met分子和约25％为带Met分子。     

重组人干扰素α-2b在大肠杆菌中分泌表达

人干扰素α-2b原始基因在重组原核工程菌中表达量偏低,所以我们在不改变干扰素原有氨基酸组成的前提下,根据大肠杆菌密码子偏爱性使用定向突变技术对huIFNα-2b基因进行点突变。将大肠杆菌STⅡ信号肽基因与突变后huIFNα-2b基因融合并于信号肽5′端和huIFNα-2b基因3′端引入合适的酶切位点。融合基因克隆至载体pCSE,pET-22b和pPAK4L中,此3种载体分别含有组成型启动子、T7启动子和phoA启动子。融合基因在载体pCSE中表达量很低,其中约有50%的目标蛋白能够成功实现分泌。在E.coliBL21中,pET-22b经过IPTG诱导可以实现huIFNα-2b的高表达,但STⅡ信号肽不能被有效切除。含有phoA启动子的载体pPAK4L其在E.coliW3110中可以实现huIFNα-2b较高水平的分泌表达,经过低磷诱导其表达量最高可至20μg/mL(A550)菌液,约有30%的目标蛋白质信号肽能够被成功切除并分泌到胞间质中。     

氨糖合酶的定向改造及其在氨糖生物合成中的应用

本研究采用基因工程手段克隆表达和定向改造氨糖合酶GLS,并通过共表达氨糖乙酰化酶GNAL进一步增强宿主菌氨糖产生能力。首先通过不同表达质粒和宿主的优化筛选出最优GLS表达体系,成功构建获得E.coli Rosetta-gami(DE3)-p ET-24a-GLS工程菌,检测其氨糖Glc N产量为1.63 g/L。为提升重组酶的转化能力,采用易错PCR技术对氨糖合酶进行非理性改造,通过高通量筛选方法从2 700余株克隆的文库中筛选获得一株高产Glc N的突变株,其产量达到3.57 g/L,相比出发菌株提高1.19倍。由于Glc N的积累对于氨糖合酶重组菌生长及代谢活动具有一定的抑制作用,本研究进一步通过共表达氨糖乙酰化酶GNAL,将Glc N部分转化为乙酰化氨糖Glc NAc,减少产物的抑制效应,结果表明GNAL与GLS串联表达能显著提升菌株的转化能力,Glc N及Glc NAc累积产量达到7.83 g/L,比单独表达GLS时提升2.19倍。经过初步摇瓶发酵优化,在5 L发酵罐上最高产量达到9.85 g/L。本研究从GLS的改造策略出发,通过易错PCR非理性改造的方式提升了GLS对于产物氨糖的耐受性,增强了GLS合成氨糖的能力,为进一步提升大肠杆菌发酵合成氨糖能力奠定基础。     

生物基塑料单体5-氨基戊酸的生物合成新途径

5-氨基戊酸(5-aminovalanoic acid,5AVA)可作为新型塑料尼龙5和尼龙56的前体,是合成聚酰亚胺的有前途的平台化合物。目前5-氨基戊酸的生物合成法普遍产率较低且合成过程复杂,成本高。为实现5AVA的绿色生物合成,本研究通过组合表达来自日本白腹鲭(Scomber japonicas)的L-赖氨酸α-氧化酶、来自乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)的α-酮酸脱羧酶和来自大肠杆菌(Escherichia coli)的醛脱氢酶,在大肠杆菌中建立了一条以L-赖氨酸为原料,以2-酮-6-氨基己酸盐为中间产物生物合成5AVA的途径。在葡萄糖浓度为55 g/L,赖氨酸盐酸盐40 g/L的初始条件下,最终消耗158 g/L的葡萄糖和144 g/L的赖氨酸盐酸盐,补料分批发酵产生了57.52 g/L的5AVA,摩尔得率为0.62 mol/mol。与文献报道的以2-酮-6-氨基己酸盐为中间产物的5AVA生物合成途径相比,本文报道的新途径无需使用乙醇和双氧水,且5AVA产量进一步提高。     

通过染色体整合表达古菌乙酰化酶合成N-末端乙酰化胸腺肽β4

胸腺肽β4（Tβ4）是N-末端乙酰化的43肽,具有多种重要生物学功能.其生物合成存在两大难点,即乙酰化修饰和小分子肽的表达.本研究发现来自古菌Sulfolobus solfataricus的乙酰化酶ssArd1可以催化Tβ4的N-末端乙酰化修饰.利用Red同源重组技术将ssArd1基因表达盒整合至E.coli BL21（DE3）染色体的lpxM位点上,构建了可以实现Tβ4N-末端乙酰化修饰的新型宿主E.coli BDA.将Tβ4编码基因融合在改造的微型Spl DnaX Intein的N端,并在Intein的C端添加His标签,构建了表达载体pET-Tβ4-Intein.在E.coli BDA中表达的融合蛋白,经镍亲和层析纯化后用β-巯基乙醇诱导融合蛋白切割释放小分子多肽,获得了具有N-末端乙酰化的Tβ4.     

N端的改变对大肠杆菌精氨酰—tRNA合成酶的影响

得到了缺失Asn2 的大肠杆菌 (E .coli)精氨酰 tRNA合成酶 (ArgRS)的变种和在其N端添加酵母ArgRS的N端 2 3个氨基酸残基的嵌合变种。它们的基因在大肠杆菌中表达时 ,可能由于蛋白质误折叠 ,大部分产生了包涵体。与天然酶相比 ,缺失变种保留了全部的氨基酸活化活力 ,但氨基酰化活力下降了 2 6 % ;嵌合变种的以上两种活力下降了 90 %以上 ,不能氨基酰化酵母tRNAArg。缺失Asn2 和Ile3 的变种在E .coli中虽被表达 ,但不稳定。与天然酶相比 ,嵌合变种的荧光光谱的最大发射波长向长波移动 ,强度减小。表明变种酶的构象和天然酶不同 ,色氨酸更暴露。用远紫外CD光谱预测变种酶的二级结构表明 ,嵌合酶的α螺旋更少 ,β折叠更多 ,无规卷曲稍多。E .coliArgRS的N端结构域对活力和正确折叠是重要的     

HIV gp41基因分段低温诱导表达

人类免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus,HIV)GP41跨膜蛋白由于具有特殊的穿膜拓扑结构,对宿主菌细胞膜产生毒性作用而使其难以在E.coli中有效表达[1].本室前期工作发现GP41蛋白中有三个区域对表达菌细胞具有毒性作用,其分别为:位于N端2/3区域(N3片段:nt7373-8006)的融合肽(aa512-527)和跨膜区(Aa 684-705),它们含有丰富的疏水性氨基酸;以及位于C端1/3区域(C片段:nt8007-8339)的慢病毒裂解肽LLP1(aa 826-854)和LLP2(aa 768-788),可形成2个两亲性α螺旋,从而对宿主菌产生较强的细胞膜毒性作用使细菌大量死亡,最终致使GP41蛋白难以获得有效表达[2].为此我们尝试在低温条件(16℃)下对HIV-gp41N端2/3和C端1/3区域在大肠杆菌BL21(DE)3中进行诱导表达,并对低温条件下GP41蛋白表达对细菌细胞膜的毒性作用特征进行初步探讨.     

布鲁菌核糖体蛋白L7/L12的表达纯化及生物活性鉴定

目的:原核表达系统表达布鲁菌核糖体蛋白L7/L12与GST的融合蛋白GST-L7/L12,并纯化蛋白L7/L12,建立检测特异性抗体的间接ELISA方法。方法:对含有L7/L12的原核表达载体pGEX-4T-1-L7/L12进行了原核表达。利用亲和层析柱分别纯化融合蛋白GST-L7/L12和蛋白L7/L12,并用SDS-PAGE及Western印迹分析鉴定。以L7/L12为抗原包被微量板,优化抗原包被浓度和羊抗鼠IgG-HRP稀释度,建立间接ELISA方法,并检测其特异性。结果:SDS-PAGE结果显示在相对分子质量为38000和12000处可见纯化蛋白的条带,Western印迹分析表明这2条带均能被免疫兔血清识别,表明获得了纯化的有生物活性的融合蛋白GST-L7/L12和蛋白L7/L12。间接ELISA方法的L7/L12抗原包被浓度为5μg/mL,羊抗鼠酶标二抗稀释度为1∶1000。小鼠免疫血清与L7/L12抗原出现阳性反应,而与布鲁菌融合蛋白OMP31、结核分枝杆菌抗原85b及牛血清白蛋白则呈阴性。结论:成功地对布鲁菌核糖体蛋白L7/L12进行了原核表达和纯化,以其为基础建立的间接ELISA方法稳定且特异。     

骨折后CHI3L1的表达变化及其功能研究

目的:研究在骨折过程中几丁质酶3样蛋白1(CHI3L1)的表达变化情况和CHI3L1蛋白可能具有的生物学功能。方法:构建了小鼠的骨折模型,同时用TNF-α在体外刺激成骨细胞,通过real time RT-PCR和Western blot检测CHI3L1表达变化情况。用抗TNF-α抗体中和TNF-α活性,验证TNF-α对CHI3L1表达的特异性诱导作用。用Bayl 1-7082抑制NF(?)B活化,考察NF(?)B活化对TNF-α的诱导作用是否是必须的。通过RT-PCR检测核结合因子a1(core binding factor a1,cbfa1)、骨钙素(osteocalcin,OCN)的表达,同时测定碱性磷酸酶(ALP)活性,以检测成骨细胞分化状况。结果:在骨折炎症反应期和TNF-α刺激的成骨细胞中,CHI3L1表达明显升高。用抗TNF-α抗体或者Bayl 1-7082都能抑制TNF-α对CHI3L1的诱导作用。说明TNF-α首先活化NF(?)B,再由后者刺激CHI3L1表达。转染表达CHI3L1的载体后,成骨细胞的ALP活性增强,cbfa1、OCN的表达也明显升高。结论:TNF-α通过激活NF(?)B促进CHI3L1表达;在体外实验中,CHI3L1具有促进成骨细胞分化的活性。CHI3L1在骨折组织中很可能受到TNF-α等细胞因子诱导表达。在体内它可能通过刺激骨分化促进骨折愈合。     

鞭毛蛋白FliC突变体/HPV 18 L2N融合蛋白的表达与纯化

目的:人乳头瘤病毒(HPV)的持续性感染导致女性宫颈癌的发生。HPV的次要衣壳蛋白L2可以诱发交叉中和多种型别HPV的中和抗体,但是单独免疫L2诱发的抗体滴度较低。鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白FliC是一种有效的佐剂。删除FliC超变区域的突变体可与外源抗原融合表达并且显著增强外源抗原特异性抗体的产生。本研究旨在构建鞭毛蛋白FliC超变区删除突变体与HPV 18 L2N(aa.13-154)的融合基因,通过大肠杆菌原核表达系统表达FliC突变体与HPV 18 L2N的融合蛋白并纯化,为研究鞭毛蛋白的佐剂活性及新型HPV 18L2疫苗奠定基础。方法:以鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白编码基因fliC为模板,通过重叠PCR法构建删除fliC D3区域(fliC△D3)、D3+CD2a区域(fliC△D3CD2a)、D3+D2区域(fliC△D2D3)的突变体,同时将HPV 18 L2N基因插入置换突变体的超变区删除区域。含有重组基因的表达载体在大肠杆菌中诱导表达,经SDS-PAGE及Western blot鉴定分析。表达的融合蛋白经Ni-Sepharose亲和层析纯化及Q-Sepharose离子交换层析去除内毒素。纯化后的融合蛋白经Native-PAGE鉴定分析,通过鲎试剂凝胶法测量蛋白溶液中的内毒素含量。结果:构建了pET22b-fliC△D3/18 L2N、pET22b-fliC△D3CD2a/18L2N、pET22b-fliC△D2D3/18 L2N重组载体。重组载体在大肠杆菌以包涵体形式高效表达,且主要以单体形式存在。结论:通过原核表达及层析法纯化,成功获得了无热源、高纯度的鞭毛蛋白FliC突变体与HPV 18 L2N的融合蛋白,为增强HPV L2免疫原性提供了一种新的途径,为进一步研制HPV 18 L2疫苗奠定了基础。