新生隐球菌的生态学、流行病学、分子生物学及临床研究

在我国,对新生隐球菌(Cryptococcus neoformans)已进行了较系统的研究。生态学方面,,由鸽粪分离的环境株具有表型的多态性,包括新生变种的A、D血清型及尿素酶阴性株,而这些多态性菌株均已在临床发现。分子生物学方面,G+Cmol％和核型已被进行分析。,由PFGE分析所得到的有意义的信息是两个变种和5种血清型新生隐球菌株具有明显不同的核型谱。临床方面,研制的一种新的可同时检测酚氧化酶和尿素酶的培养基可用于该菌的临床鉴定。使用一种高渗培养基诱导出于该菌的L-型,提示在感染期间L-型的形成可能与该病的慢性过程与复发有关。已证实氟康唑对治疗新生隐球菌病有良好的效果。进一步应重视联合治疗的可能性,例如使用氟康唑加二性霉素B脂质体。总之在我国对新生隐球菌的系统性研究已经初步开始进行,许多有意义的结果已经得到并且将进一步得到。     

新生隐球菌的酚氧化酶及用于菌种鉴定的研究

采用4％玉米浸汁咖啡酸琼脂(CACA)培养基。观察了具不同生物学特性的新生隐球菌的酚氧化酶活性,并对临床常见的多种酵母和酵母样真菌作了该酶的检测。结果,受试的3个变种、5种血清型和尿素酶阴性新生隐球菌均呈明确的阳性反应;150株常见酵母和酵母样真菌中43株新生隐球菌全部呈酚氧化酶阳性。107株其它酵母和酵母样真菌全部阴性。具各种不同生物学特性的新生隐球菌均特异性地产生酚氧化酶,用检测该酶的方法作该菌鉴定的特异性和敏感性均为100％,且可于72小时内得到结果。此外,结合尿素酶试验可以准确的鉴定出尿素酶阴性的新生隐球菌。     

获得性免疫缺陷综合征患者的新生隐球菌基因多态性研究

本文旨在调查2003 年1 月― 2007 年12 月分离自上海地区获得性免疫缺陷综合征( AIDS) 患者的新生隐球菌临床株的配型及基因型分布特征, 为隐球菌病的诊疗提供科学依据。首先以M13 为单引物对模板DNA 进行聚合酶链反应( PCR) 扩增, 参照标准株指纹图将临床株鉴定至基因型; 同时对12 株来自AIDS 患者的新生隐球菌临床株的内转录间隔区( ITS) 基因进行PCR 扩增、序列分析, 以CLUSTAL W1. 83 软件多重比对分析ITS序列的差别,MEGA3. 1 软件处理数据, NJ 法绘制系统进化树, Bootstrapping 法对系统进化树结果进行统计学检验, 区分新生隐球菌格鲁比变种、新生变种及格特变种菌株; 最后选用特异性引物PCR 特异性扩增相关基因, 鉴定α和a 配型。结果显示, 分离自上海地区的12 株隐球菌临床株中, 9 株( 75% ) 为VNⅠ基因型/ α配型菌株,3 株( 25%) 为VNⅡ基因型/ α配型菌株, 且ITS基因序列分析可将各临床株鉴定至变种水平。本研究提示, 分离自上海地区AIDS患者的新生隐球菌临床株存在一定的遗传多态性, 以VNⅠ基因型/ α配型菌株为主, 有少量VNⅡ基因型/ α配型菌株。     

新生隐球菌的AFLP分析

目的评估AFLP-DNA指纹技术在新生隐球菌分类中应用情况。方法新生隐球菌基因组DNA用双酶酶切,双链接头连于其酶切末端,用与接头和酶切位点互补的引物扩增DNA片段,其产物在高分辨的变性聚丙酰胺凝胶上电泳分离,然后进行银染。结果分析来自5种血清型和临床分离株的18株新生隐球菌,可见有30多条大小在30～500bp的DNA-AFLP指纹,相同的血清型有不同的指纹图谱,来自同一患者不同病期的两株分离株和来自同一患者患者的不同部位的两株分离株都显示出相同的带型。结论显示了AFLP的高分辨率,是适用于新生隐球菌流行病学调查的有力工具。     

隐球菌感染体外血脑屏障模型的构建与应用

目的构建体外血脑屏障模型,并检测隐球菌不同菌株穿越血脑屏障的能力。方法本研究应用商品化的小鼠脑微血管内皮细胞系b END.3构建体外血脑屏障模型,并验证该模型应用于隐球菌穿越血脑屏障机制研究的可行性。通过构建模型,以非致病性的酿酒酵母作为阴性对照,比较新生隐球菌不同血清型标准株及基因缺陷株穿越体外血脑屏障能力的差异。结果跨膜电阻值(TEER)检测提示体外血脑屏障模型构建成功。检测结果显示酿酒酵母作为阴性对照穿越血脑屏障效率最低,新生隐球菌血清A型标准株H99穿越细胞屏障效率最强,血清D型标准株JEC21穿越细胞屏障效率显著低于H99。较之H99,黑色素酶缺陷株lac1裣穿越体外血脑屏障模型的效率没有显著差异;尿素酶缺陷株ure1裣效率显著下降(P0.05),约为标准株H99通过率的59.9%;荚膜缺陷株cap59裣突破体外血脑屏障模型效率最低,约为标准株H99的18%(P0.001)。结论隐球菌中枢系统感染体外模型成功构建。新生隐球菌突破血脑屏障的能力与其血清型以及荚膜、尿素酶等毒力因子的表达密切相关。     

隐球菌感染体外血脑屏障模型的构建与应用CSCD

目的构建体外血脑屏障模型,并检测隐球菌不同菌株穿越血脑屏障的能力。方法本研究应用商品化的小鼠脑微血管内皮细胞系b END.3构建体外血脑屏障模型,并验证该模型应用于隐球菌穿越血脑屏障机制研究的可行性。通过构建模型,以非致病性的酿酒酵母作为阴性对照,比较新生隐球菌不同血清型标准株及基因缺陷株穿越体外血脑屏障能力的差异。结果跨膜电阻值(TEER)检测提示体外血脑屏障模型构建成功。检测结果显示酿酒酵母作为阴性对照穿越血脑屏障效率最低,新生隐球菌血清A型标准株H99穿越细胞屏障效率最强,血清D型标准株JEC21穿越细胞屏障效率显著低于H99。较之H99,黑色素酶缺陷株lac1裣穿越体外血脑屏障模型的效率没有显著差异;尿素酶缺陷株ure1裣效率显著下降(P<0.05),约为标准株H99通过率的59.9%;荚膜缺陷株cap59裣突破体外血脑屏障模型效率最低,约为标准株H99的18%(P<0.001)。结论隐球菌中枢系统感染体外模型成功构建。新生隐球菌突破血脑屏障的能力与其血清型以及荚膜、尿素酶等毒力因子的表达密切相关。     

利用微卫星标记研究新生隐球菌分子流行病学

目的 研究国内隐球菌临床分离株的遗传多态性和分子流行病学.方法 选择与新生隐球菌遗传相关的9个微卫星标记,分析这9个位点从1993 ～2009年国内分离到的新生隐球菌临床株遗传背景、来源及变异程度.结果 116株被研究的隐球菌临床分离株,主要归属于3个微卫星复合物(MC2,MC3和MC12),其中大部分为MC2(103株).8株菌株属于目前为止未被国内外认识的新复合物(MC12).结论 利用微卫星DNA多态性研究新生隐球菌分子流行病学有较大的应用价值.     

新型隐球酵母氯离子通道在阳离子内稳态中的趋异作用

新型隐球酵母Cryptococcus neoformans有两个变种（varieties）,即grubii和neoformans。目前研究最多的两个菌株H99（血清型A）和JEC21（血清型D）分别代表这两个变种,两者的毒性差别显著,为研究新型隐球酵母菌株间毒性的进化提供了良好模型。我们通过比较JEC21的clc1-突变体Tx1与早先鉴定的H99 clc1-菌株Mlac3发现,JEC21 CLC1同样决定铜离子的吸收。Tx1中丧失的漆酶活力可以通过外源Cu2+的加入得以恢复,而漆酶基因LAC1的转录与野生     

新疆首次临床分离新生隐球菌菌株分子鉴定、基因分型及体外药物敏感性研究

目的对新疆首次临床分离的5株新生隐球菌进行分子鉴定、RAPD-PCR基因分型及体外药物敏感性研究。方法5株新生隐球菌分子鉴定采用核糖体DNA大亚基(LSU rDNA)D1/D2基因区域分子鉴定。分子分型采用引物SEQ-6结合RAPD-PCR法扩增5株新疆临床分离新生隐球菌菌株及5株由上海长征医院提供分离自上海新生隐球菌菌株,根据扩增产物带型进行基因型判定。采用临床实验室标准化协会(CLSI)的酵母微量液基稀释法(M27-A3)测定5株新疆临床分离新生隐球菌菌株对6种抗真菌药(伏立康唑、伊曲康唑、两性霉素B、特比萘芬、氟康唑、5-氟胞嘧啶)的体外敏感性。结果 5株新疆临床分离隐球菌菌株经过D1/D2区域序列分析在基因Bank中比对后鉴定为新生隐球菌。5株新疆临床分离新生隐球菌和5株上海新生隐球菌菌株经RAPD-PCR法扩增,带型显示分为A、B、C、D 4个基因型,其中新疆5株菌株A型1株、其余4株均为B型,上海菌株B型为1株,C型3株、D型1株,5株新疆临床分离新生隐球菌株对伏立康唑、伊曲康唑、两性霉素B、特比萘芬的MIC值(μg/mL)范围依次为:0.062 5~0.25、0.25~1、0.125~0.5、1~2,对氟康唑、5-氟胞嘧啶MIC值较高,MIC值范围依次为:4~16、8~32。结论新疆临床分离5株隐球菌株采用D1/D2基因序列鉴定为新生隐球菌。RAPD-PCR分型显示新疆临床分离5株新生隐球菌株以B型基因型为主。A型和B型对伏立康唑、两性霉素B敏感,对伊曲康唑、特比萘芬剂量依赖型敏感,对氟康唑、5-氟胞嘧啶耐药。     

播散性隐球菌病1例及其实验研究

目的 播散性隐球菌病1例临床及实验研究.方法 患者男,72岁,红皮病1年2个月,口服醋酸泼尼松治疗,双下肢出现结节、溃烂6个月.皮损组织病理、皮损组织真菌培养、尿素酶试验、PCR扩增测序比对明确诊断,同时做胸部及脑部CT.结果 皮损组织病理显示为感染肉芽肿改变,可见大量圆形和椭圆形酵母细胞.皮损组织真菌培养可见酵母样菌落生长,菌株尿素酶试验阳性,ITS区测序比对鉴定为新生隐球菌grubii变种.血清隐球菌荚膜多糖抗原乳胶凝集试验阳性(++++).胸部CT显示左下肺后基底段空洞性病灶.依据临床及实验室检查确诊为由新生隐球菌grubii变种引起的 播散性隐球菌病.给予患者静滴氟康唑400 mg/d治疗2周,之后改口服300 mg/d治疗,3个月后结节性皮损全部消退,胸片显示左肺陈旧性病变,血清隐球菌荚膜多糖抗原乳胶凝集试验阳性(++).治疗15个月后,血清隐球菌荚膜多糖抗原乳胶凝集试验仍阳性(++).结论 对该病例的临床和实验室研究为临床明确诊断和治疗提供了依据,确定菌种需要进行分子生物学研究.     

不同毒力差异基因型的新生隐球菌MLST分型及交配型鉴定研究

目的：了解及比较两组毒力差异明显的新生隐球菌格鲁比变种的多位点序列分型（MLST）的特点并进行交配型鉴定。方法采用多位点序列分型（MLST）的方法,设计7个看家基因（CAP59,GPD1,LAC1,PLB1,SOD1,URA5和IGS1）的引物,扩增并分析来源分别为环境和临床的各10株新生隐球菌格鲁比变种的基因型,并鉴定实验菌株交配型,与多位点微卫星分型（MLMT）结果对比,比较不同基因分型方法在分类中的稳定性和可靠性。结果在微卫星分型中为MLMT-36的10株环境分离株,MLST分型为ST-15,而在微卫星分型中为MLMT-13型的10株临床分离株,MLST分型为ST-32,所有菌株交配型均为MAT-α。结论MLST分型结果与MLMT分型结果高度一致,提示以上两种分子分型技术在真菌分类鉴定研究中可显示对于其分离背景及进化来源的高分辨率及稳定性。     

肝移植后播散性隐球菌病1例及其实验研究

目的播散性隐球菌病临床及实验研究。方法患者女,47岁,肝移植术后2 d,面部、肩部、四肢皮肤出现多发溃疡,伴昏迷。通过脑计算机断层扫描、皮损组织病理检查、PAS染色、皮损组织真菌培养及激光俘获显微切割结合PCR扩增序列分析确诊,并对获得菌株进行尿素酶试验、API试验、PCR扩增测序等实验研究。结果皮损组织病理可见大量圆形和椭圆形菌体,PAS染色阳性。血液和脑脊液真菌镜检均为阴性。皮损组织真菌培养可见酵母样菌落生长,菌株尿素酶试验阳性,API试验鉴定为新生隐球菌。ITS区序列分析鉴定为新生隐球菌grub ii变种。激光俘获显微切割结合PCR扩增,序列分析与培养获得的菌株直接PCR扩增后序列分析结果一致。脑脊液特异性隐球菌抗原（＋＋）,血液特异性隐球菌抗原（＋＋＋＋）。脑CT显示为多发结节灶。依据临床及实验室检查确诊为播散性隐球菌病,致病菌为新生隐球菌grubii变种。结论通过对该病例的深入研究,为临床明确诊断播散性隐球菌病奠定基础,确立了显微切割技术在皮肤真菌感染中的应用价值。     

我国新生隐球菌临床株基因型分析

为了解中国大陆地区新生隐球菌临床株基因型分布情况, 我们对来自我国中东部地区的18个省、直辖市的120株血清A型和9株血清B型新生隐球菌临床株采用PCR指纹分析、IGS序列测定和MLST(Multilocus sequencing test)方法进行分析。结果显示血清A型菌株的M13指纹图谱中主要条带与VNI型标准株相同, 但次要条带与VNI现有各亚型均不相符, 我们将这种新VNI亚型命名为VNIc型, 但VNIc型并不只分布在中国大陆, MLST分析显示中国大陆地区的VNIc型菌株同来自美国、日本、马拉维和巴西的7株菌株亲缘关系高达75, 提示VNIc型可能是一种世界范围内分布的基因型; 对血清A型菌株采用(GACA)4和URA-5 RFLP指纹分析则呈现与VNI标准株完全一致的主次条带; 9株血清B型菌株基因型为VGI型。本研究初步揭示了我国大陆地区新生隐球菌临床株的基因型分布。     

芽孢杆菌胞内酯酶的电泳分析

应用聚丙烯酰胺凝胶电泳对13株Bacillus的胞内酯酶进行了分析。结果证明,不同种的Bacillus具有自己特定的酯酶区带;同一个种而血清型不同Bacillus的变种,也具有自己特定的酯酶区带。在分类鉴定上,应用这一技术可为快速、准确地鉴定Bacillus不同种和变种,提供依据。     

一株尿素酶阴性的新生隐球菌

本文报告从鸽粪标本中分离出的一株尿素酶试验阴性、咖啡酸玉米吐温琼脂培养呈棕色菌落的酵母样真菌。根据该菌袜的生理、生化特性及致病力,认为是尿素酶阴性的新生隐球菌。此外,应注意这种菌在自然界中的存在和对人类造成感染的可能。这是关于从自然环境中分离出尿素酶阴性新生隐球菌的首次发现和报告。     

34例HIV患者新生隐球菌感染分子流行病学及临床特点分析

目的了解HIV患者新生隐球菌感染的分子流行病学及其临床特点,为HIV患者新生隐球菌感染的预防和治疗提供依据。方法收集首次分离自HIV患者的新生隐球菌34株,回顾性分析患者一般资料;VITEK MS质谱仪进行菌种鉴定,ATB Fungus3测定新生隐球菌对5种抗真菌药物的MIC值;利用PCR对特异性引物扩增,确定变种和交配型;多位点序列分型(MLST)对菌株进行分子遗传学分析。结果 34株新生隐球菌绝大部分分离自中年男性,且主要来自脑脊液(73.5%)标本;初次脑脊液压力平均为(27.26±11.52)mmH2O,CD4细胞计数中位数28cells/μL(3~163cells/μL),脑脊液白细胞中位计数32(2~110)×106/L,蛋白质定量中位数为362 mg/L(160~2 730 mg/L),葡萄糖含量中位数为2.28mmol/L(1.50~5.98mmol/L);所有菌株对5种抗真菌药均敏感,且所有菌株均为Aα、VNⅠ型;MLST分析共检出3种ST型,ST5(n=32)、ST32(n=1)和ST186(n=1)。结论近两年本地区HIV合并新生隐球菌感染主要以中年男性多见,常规实验室检查缺乏特异性,对临床常用抗真菌药物耐药性不强,ST5是其感染的主要克隆系。     

昆虫病原菌苏云金芽孢杆菌群(Bacillus thuringiensis Group)的分类

采用形态、生化、血清学的方法对国外引种的15株巳知菌和本国51株未知菌进行了变种的分型研究。结果表明：苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)作为有益的细菌资源在藏国分布较广。51株菌中属于血清型H1苏云金芽孢杆菌苏云金变种(Baeillus thuringiensisvar. Thuringiensis)有11株,血清型H50-5b苏云金芽孢杆菌蜡螟变种(B．Thur．Var．Galleriae)31株,血清型H4-4b苏云金芽孢杆菌松蜩变种(B.thur. Var. dengrolimut)3株,血清型H4-4a。苏云金芽孢杆菌肯尼亚变种(B. thur. Var kenyae) 5株,同时发现血清型H．苏云金芽孢杆菌玉米螟变种(B. thur var. ostrinia,)一株。玉米螟变种不同于该菌群的巳知菌株,认为是一个新变种。实践证明,利用血清学抗原抗体具有高度特异{生的凝集反应来鉴别苏云垒芽孢杆菌变种,简便,快速,准确。而该群噬菌体却不能作为区分变种的标准。     

幽门螺杆菌hpaA基因RFLP研究

用限制性片段长度多态性(RFLP)的方法评价幽门螺杆菌不同菌株鞭毛粘附素基因(hpaA)的变异性。PCR扩增9株幽门螺杆菌710bp的hpaA基因,用Hha Ⅰ、HaeⅢ限制性内切酶对该基因片段进行酶切分析。hpaA基因HaeⅢ单酶切可见4种带型,HhaⅠ单酶切出现5种带型。从临床分离的H.pylori菌株hpaA RFLP互有差异,且不同于国际标准菌株;临床分离株感染动物后分离得到的动物适应株其hpaA基因也发生了变异。不同H.pylori菌株间hpaA基因表现出明显的多态性,为开展H.pylori的分子流行病学调查提供了一种有效的方法。     

淋球菌AFLP基因分型的初步研究

采用扩增片段长度多态性技术(AFLP)对奈瑟氏淋球菌菌株进行基因分型研究。以EcoRI和MesI酶切26株淋球菌临床分离株基因组,并进行AFLP分析。同一地区的淋球菌分离株之间存在相当大的DNA多态性。AFLP是鉴别淋球菌临床分离株有用而敏感的基因分型技术,有助于了解流行淋球菌菌株的来源、流行菌株之间的克隆相关性,以及抗生素耐药性菌株的传播情况。     

新生隐球菌SER5基因的敲除与功能验证研究

目的构建新生隐球菌SER5基因缺陷株,并初步探究其功能。方法敲除SER5基因,通过体外应激应答、黑色素诱导、荚膜诱导、尿素酶测定、生长曲线测定、酵母双杂交实验考察SER5在新生隐球菌中的功能。结果成功构建SER5基因缺陷株,SER5基因缺失后对新生隐球菌的体外应激、荚膜、分解尿素及生长没有显著的影响,但新生隐球菌黑色素合成有显著的降低,通过酵母双杂交实验筛选出可能与Ser5相互作用的19种不同的蛋白编码基因。结论新生隐球菌Ser5影响新生隐球菌黑色素生成,可能与内质网蛋白、内质网稳定蛋白、VAMP7、磷脂转运蛋白、Gmt1、Vti1a等存在相关作用,提示Ser5参与新生隐球菌黑色素的合成或转运过程。