使用激光微束研究哺乳动物早期胚胎分化

近年来，一些研究者用显微操作方法证实， 哺乳动物早期胚胎至少直至8一细胞期，每个卵 裂球仍然是全能的，即还没有开始分化。1965 年Daniel用激光微束照射破坏2一细胞期兔胚中 一个卵裂球后，另一卵裂球在培养条件下发育 至桑堪胚期。此外，还有Tarkowski和Wroblewska (1967）的卵裂球分离实验，Mintz (1965) 卵裂球重聚合实验以及最近Willadsen (1979) 羊胚卵裂球分离实验等。     

激光显微照射金鱼受精卵对其胚胎发育的影响

2-细胞期胚胎经激光显微照射(功率为90毫瓦)其中一个卵裂球时能产生明显的损伤光斑,受照射的卵裂球立即停止发育。另一未受照射的卵裂球仍能正常卵裂直至孵化幼鱼,所获得的幼鱼在形态上与正常幼鱼相同。8-细胞或囊胚期胚胎经激光显微照射(功率为372毫瓦)时,则可在受照射的卵裂球上产生明显伤斑,并在照射部位溢出部分细胞内含物,绝大部分胚胎发育成不正常的胚体和各种畸形幼鱼。     

小鼠2-细胞胚胎单个卵裂球体外培养及其发育形成囊胚的玻璃化冷冻保存技术的研究

单个卵裂球分离和培养是生产同卵双胎或一卵多胎动物的一种有效方法。在羊和牛已经获得了来源于2-细胞和4-细胞期胚胎的单个卵裂球的活体后代;在兔也获得来源于4-细胞胚胎的单个卵裂球后代;在猪已获得8-细胞单个卵裂球的后代。但多数的研究者发现,小鼠单个卵裂球培养后的体外发育率、移植妊娠率和产仔率都很低。上述均为新鲜胚移植结果,至于分离后卵裂球发育成的囊胚再进行玻璃化冷冻保存尚未见报道。本实     

小鼠胚胎致密化起始的调控机制

植入前小鼠胚胎的发育事件包括第一次卵裂、胚胎基因组激活、桑椹胚致密、囊胚形成。小鼠受精卵胚胎的致密化发生在8-细胞阶段晚期, 致密过程中, 胚胎卵裂球本身以及卵裂球之间发生了一系列的变化。这些变化包括卵裂球微绒毛以及胞质成分的极性化分布, 卵裂球之间形成特殊的胞间连接。致密化是哺乳动物胚胎发育过程中的第一个细胞分化事件, 即导致了内细胞团以及滋养外胚层的产生。植入后, 内细胞团将发育成为胚体, 滋养外胚层将发育成为胎盘等胚外组织。细胞粘附分子E-cadherin介导的胞间粘附起始了致密化。卵裂球发生粘附所需的组分在致密前已经存在, 但是直至8-细胞阶段晚期连接复合体才表现出明显的粘附活性。敲除E-cadherin基因, 发现母源性的E-cadherin足以介导致密。E-cadherin介导的胞间粘附是细胞粘附的第一步。文章综述了E-cadherin介导胞间粘附的具体过程以及蛋白激酶C(Protein kinase C, PKC)调控该过程的相关 机制。     

体细胞来源及培养代数对核移植重构胚发育的影响

为探讨体细胞来源及培养代数对核移植重构胚发育的影响,实验采用电融合法将小鼠2—细胞胚胎卵裂球、胚胎干细胞(ES)、胎儿成纤维细胞、耳成纤维细胞、尾尖成纤维细胞、睾丸支持细胞和精原细胞以及不同培养代次的胎儿成纤维细胞进行了核移植。结果显示：2—细胞胚胎卵裂球供核重构胚发育最好,囊胚率为7．4％;ES细胞重构胚虽然发育率低,但仍有囊胚出现,比例为0．7％;胎儿成纤维细胞重构胚最高发育阶段为桑椹胚,比例为0．2％;精原细胞重构胚只能发育到8-细胞阶段,比例为0．3％;其他几类细胞重构胚则仅能发育至4-细胞阶段。不同培养代数的胎儿成纤维细胞重构胚除第3代外都可发育到8-细胞阶段,且发育率差异不显著,但第一代细胞重构胚2-细胞发育率(40．7％)显著低于2、3和4代细胞重构胚。结果表明：不同分化程度的细胞核移植后,重新编程的难易程度是不一样的,分化程度越高则重新编程越难;未调整细胞周期的ES细胞由于多数处于S期,所以重构胚发育率很低;体外培养传代有利于体细胞核移植后重新编程。     

完整的供体细胞膜及供体胞质对小鼠体细胞克隆胚发育的影响

利用显微注射和电融合的方法都可以成功地获得体细胞克隆小鼠, 由于电融合法操作耗时, 融合率低, 因而大多数克隆小鼠是采用注射方法。而注射法需要将供体细胞核从细胞中分离出来, 此分离操作有可能导致对DNA的损伤, 曾有人使用直径较粗的注射管进行完整的供体细胞注射, 这种方法操作相对简单而且对供体核没有损伤。为了研究这种方法在小鼠核移植中是否适用, 本实验使用完整的小鼠卵丘细胞作供体, 进行显微注射, 结果显示, 完整的卵丘细胞注入卵母细胞后, 无论在1小时或者6小时激活, 大部分的重构胚在2细胞期碎裂, 而去掉细胞膜的供体体细胞核注入卵母细胞后, 重构胚可以卵裂并进一步发育。卵母细胞去核后不注射供体也发生碎裂, 大部分的孤雌胚(不去核)在完整的卵丘细胞被注入后同样发生碎裂。在供体卵丘细胞刚破膜后即被注入卵胞质和供核被充分剥离后注入两种情况下获得的重构胚的体外发育中, 前者发育各期的比率显著低于后者。这些结果说明完整的卵丘细胞膜阻碍了卵胞质对体细胞核的重编程作用, 造成碎裂; 注入卵胞质的供体质膜和胞质成分影响了克隆胚的体外发育。     

人-山羊异种核移植胚胎发育的初步研究

以体外分离培养的人胚胎成纤维细胞为核供体,经血清饥饿培养后,通过显微操作技术移入山羊去核卵母细胞中,采用化学方法激活重组胚.通过体外培养观察,2-细胞胚胎发育率可达51.33%,4-细胞发育率为31.42%,但发育至桑椹胚阶段的胚胎数目大大减少,仅为9.73%.虽然目前尚未能获得异种核移植囊胚,但实验结果说明山羊成熟卵母细胞可以支持人体细胞核完成重编程,人-山羊异种体细胞核移植重组胚可在体外完成其早期发育.     

应用激光扫描共聚焦显微镜FRAP技术研究兔早期胚胎发育中细胞间隙连接介导通讯

本研究应用激光扫描共聚焦显微镜的光漂白恢复技术(FRAP)分析兔早期胚胎卵裂球之间通过间隙连接介导的细胞通讯(GJIC)。研究结果发现,用强激光分别将4-细胞期胚胎、异裂胚胎和8-细胞期胚胎的一个卵裂球荧光光漂白后,经过15分钟的荧光恢复,4-细胞期胚胎的光漂白恢复率为17.8％,异裂胚胎的光漂白恢复率为23.7％,二者之间没有明显的差异;8-细胞期胚胎的光漂白恢复率为78.2％,与前二者之间存在明显的差异。推测兔早期胚胎卵裂球细胞间隙连接建立的时间在8-细胞阶段,胚胎卵裂球间隙连接通讯可能是兔胚胎正常发育的重要条件。     

人体胚胎发育概况与新进展（二）：人胚早期发育

第1—8周是人胚早期发育阶段,又称胚期。在这个时期,受精卵经过分裂,增殖和分化,形成桑椹胚、胚泡,进而分化形成内、中、外三胚层,胚胎变成圆柱形及主要器官系统的雏形。另外,此期的胚胎发育对环境的影响十分敏感,在某些有害因素(如病毒、药物等)的作用下较易发生先天性畸形。第1周卵裂、胚泡形成与植入受精卵从输卵管向子宫方向的运行中,不断进行分裂、增殖的过程称为卵裂,卵裂产生的细胞称卵裂球。第一次卵裂是在受精后的30小时左右发生,以后每10几小时卵裂一次,第3天时形成一个由12—16个卵裂球构成的实心胚,称桑椹胚。桑椹胚继续细胞分裂并由     

山羊(Capra hircus)重构胚与再重构胚早期发育的研究

选择山羊8细胞期到桑椹胚期的正常胚胎或重构胚的卵裂球,或选择胚泡期胚胎的内细胞团细胞作为供核,并以LRH注射后26—28h的去核成熟卵球作为受体,制备重构胚或再重构胚,琼脂糖包埋,植入山羊输卵管内,体内培养4—6天发育结果表明:不同发育时期(8细胞期至胚泡期)的正常胚胎细胞核或重构胚细胞核中,至少有部分细胞核均保留着发育的全能性,这些细胞核在母系基因表达产物的调控下,实现重新编程,启动并完成正常发育的全过程。     

小鼠早期胚胎移植技术的研究

哺乳动物胚胎移植技术是实验胚胎学、遗 传学、发育生物学研究中的一项重要技术。在 卵母细胞的体外培养、卵的体外受精及对早期 胚胎进行显微手术等研究中,往往是通过观察 卵在体外培养中的卵裂情况来鉴定实验效果。 但是更理想的方法就是将有发育能力的胚胎移 入受体子宫或输卵管内,以观察胚胎能否继续 发育直至胎儿出生。为此,我们对小鼠早期胚 胎进行了外科、非外科手术移植的研究。     

山羊（Capra hircus）重构胚与再重构胚早期发育的研究

选择山羊９细胞期到桑椹胚期的正常胚胎或重构胚的卵裂球,或选择胚泡期胚胎的内细胞团细胞作为供核,并以ＬＲＨ注射后２６－２８ｈ的去核成熟卵球作为受体,制备重构胚或再重构胚,琼脂糖包埋,植入山羊输卵管内,体内培养４－６天发育结果表明：不同发育时期（８细胞期至胚泡期）的正常胚胎细胞核或重构胚细胞核中,至少有部分细胞核均保留着发育的全能性;这些细胞核在母系基因表达产物的调控下,实现＝重新编程,启动并完成正常     

家兔胚胎细胞核移植的研究

本研究以兔为实验材料,对细胞核过程中显微操作、电融合、电活化以及移核胚的培养等基本问题进行了研究。对兔进行PMSG－hCG超数排卵,收集成熟母细胞和16－细胞胚;后者经胰蛋白酶消化,去除胶膜和透明带,在不含Ca62 、Mg^2 的分离中分成单个卵裂球;然后,分别对两者做CB预处理;首次尝试采用WQilladsen法,去除卵母细胞核、并将单个卵裂球注入透明带,同时、与McGrath-Solter法进行比较;通过电融合使供体核进入去核的卵母细胞内;将所得移核胚在体外或在中间内体内培养并观察。结果表明：一、Willadsen法与McGrath-Solter法比较,核移植操作的成功率及以后的电融合率均无明显差异（Tab.1)。相对于后者,Willadsen法更简便、易于掌握并提高去核率。二、hCG超排注射后13－15h,观察卵母细胞发现：其中,67．8％保留有第一极体。此时的卵子若去除1／3胞质量,去核率可以达到58．3％。若推迟去核时间,第一极体退化,失去去核标志。三、比较不同电脉冲条件,发现强度为0．63kv/cm,持续160μs的一次电脉冲可获较高移核胚的融合率（70．8％）（Tab.2）;并可使61．1％的成熟卵母细胞活化。四、比较移核胚在体外和在中间有体内两种培养条件,前者只有34．6％能发育到6－8细胞期,而后者有23．0％能发育到桑椹胚或囊胚（Tab.3)。说明：需进一步优化家兔胚体外培养条件。     

IVF-20培养液用于大鼠体外受精的实验研究

目的探讨人用体外受精液用于实验大鼠体外受精的可行性,为实验大鼠的胚胎保种提供参考。方法选用人体外受精IVF-20培养液作为大鼠精子获能和受精培养液,对SD、Wistar、GK、F344等四种不同品系的实验大鼠进行体外受精;用mR1ECM培养液对体外受精所得胚胎进行体外培养实验。同时,将所得2-细胞胚胎移植给经假孕处理的受体鼠。结果四个品系大鼠体外受精后的卵裂率分别可达83.2%、72.6%、87.8%和71.6%。体外受精卵裂胚能够在体外进一步发育,SD大鼠囊胚发育率为16.7%,与体内受精胚胎在体外培养的囊胚发育率(24.5%)差异不显著。80枚2-细胞胚胎移植给2只受体鼠后均妊娠成功,产下正常仔鼠10只,产仔率12.5%。结论用于人体外受精的IVF-20培养液同样适合于实验大鼠精子的体外获能和受精,可以在多种品系获得较高的卵裂率,所得卵裂胚能够在体外发育到囊胚,并且所得卵裂胚在移植给受体鼠后能够产下正常仔鼠。     

兔体细胞核移植的初步研究

实验以兔胎儿成纤维细胞为核供体,对兔体细胞核移植技术的融合,激活和发育等环节进行了初步研究。实验通过比较不同电场强度对兔2细胞胚胎卵裂球融合以及卵母细胞激活的影响,证实200和260V/mm的电场强度可有效地诱导2细胞胚胎的融合和兔卵母细胞的孤雌激活。然后将200和260V／mm电场强度用于体细胞核移植,融合率分别为44．4％和48．4％,卵裂率分别为58．8％和53．8％,桑椹胚／囊胚发育率分别为5．9％和5．5%。但112枚核移植胚胎移植到5只受体后没有幼子出生。结果表明,实验中所建立的程序至少可以支持兔体细胞克隆胚胎的早期发育。     

人-牛异种克隆胚构建及其线粒体来源

通过人-牛异种核移植技术获得异种克隆囊胚, 便于在不消耗人类卵母细胞的情况下从异种克隆胚中分离出人类干细胞。通过透明带下注射法将人胎儿成纤维细胞和牛耳成纤维细胞分别注入去核牛卵母细胞中构建异种和同种胚胎, 并比较两者之间的融合率、卵裂率、8-细胞发育率以及囊胚率。并对处于2-细胞、4-细胞、8-细胞、桑椹胚、囊胚阶段的异种克隆胚的线粒体DNA来源进行检测。结果表明, 异种克隆胚体外各个阶段的发育率均低于同种克隆胚, 尤其是8-细胞到囊胚阶段的发育率, 以及囊胚率都显著低于同种克隆胚(P<0.05)。异种克隆胚在2-细胞到桑椹胚阶段检测到人、牛线粒体DNA共存, 囊胚阶段只检测到牛线粒体DNA。结果表明: 牛卵母细胞可以重编程人胎儿成纤维细胞, 完成异种克隆胚植入前的胚胎发育, 异种克隆胚由于核质相互作用的不谐调, 影响其发育能力, 使其囊胚率显著低于同种克隆胚。牛线粒体DNA存在于植入前异种胚胎发育的各个阶段。异种克隆胚胎用于人类胚胎干细胞分离具有可行性。     

烟草合子与二胞原胚在离体培养中的发育

用酶解-研磨法分离烟草与大叶烟草受精后的胚囊,继之以显微解剖分离合子与二胞原胚。将3—5个合子或二胞原胚置于微室的琼脂糖小滴中,以预先培养3—4天、分裂1—2次的烟草、大叶烟草或黄花烟草叶肉原生质体饲养。培养基为KM8p与其它附加成分。在25℃与黑暗下静置培养。培养3—4天,约60%合子完成第一次分裂。多数行不等分裂产生大小两个细胞。12天后形成少数原胚或多细胞团。二胞原胚培养亦分裂为多细胞原胚。研究了合子分离方法、合子发育时期、饲养细胞种类与培养天数等因素对合子离体发育的影响。     

施氏獭蛤融合卯裂及其胚胎发育过程观察

对施氏獭蛤胚胎发育过程进行了观察,结果显示:(1)与其他双壳类相似,施氏獭蛤胚胎发育过程可以分为卵裂期、囊胚期、原肠期、担轮幼虫期和面盘幼虫期;(2)在卵裂阶段,施氏獭蛤的卵裂方式完全不同于其他动物;施氏獭蛤卵子发育到第一次成熟分裂前期(胚泡破裂前)即有受精能力,但卵子受精后未观察到极体排出的现象,而是有多核受精卵产生;在以后的卵裂过程中,受精卵没有进行其他动物的经裂或纬裂,而是以一种独特的、复杂的分裂方式--融合卵裂进行卵裂,即:二细胞、叫细胞、八细胞进行下一次卵裂之前,细胞核逐渐消失,分裂球逐渐融合成一个细胞,一段时间后在细胞中央逐渐出现数量加倍的细胞核,细胞核逐渐向外周移动,最后一次性地分裂出数量加倍的分裂球.     

光捕捉活细胞染色体

本文综合报道了作者近数年来以PTK_2细胞为实验材料,用Nd:YAG激光器所发射的1.06微米波长和氩离子泵浦Titanium-Sapphire激光所发射的700—760毫微米波长的连续激光微光束作为光捕捉在显微操作染色体方面的一些主要实验结果。所得结果表明光捕捉可诱发中期细胞的落后染色体向中期板加速移动,抓住后期细胞的一对染色体,使其停留在中期板保持静止不动,而其余的染色体对照常进行染色单体的分离並移向两极,在后期一直用光捕捉抓住的那对染色单体,最终在胞质分裂时将进入一个子细胞,或丢失在分裂沟中或两染色单体分开,各自分别进入原相对的子细胞。作为光捕捉Titanium-Sapphire激光器发射的700—760毫微米波长的激光束,比Nd:YAG激光的1.06微米波长能在更高的输出能量水平下操作而产生较小的对细胞损伤的副作用,从而更容易操作染色体。在适宜的输出能量水平下操作,光捕捉不会对细胞造成损伤,受光捕捉的细胞一般都能继续分裂直至形成两个子细胞。实验结果证明光捕捉技术是一项研究活细胞纺锤体、染色体运动等细胞生物学问题而又不损伤细胞的良好工具。光捕捉技术也可能对诱发单体、三体细胞,研究细胞遗传提供新的手段。     

微束激光照射黑眶蟾蜍早期胚胎产生骈联胚的研究

用红宝石激光微束照射黑眶蟾蜍卵二细胞期的卵裂沟,具有产生双头或双头双尾的骈联胚。本文对获得的三只骈联胚进行研究。