乙偶姻生物合成代谢调控及其应用

许多微生物在糖酵解过程中能够将糖类转化为乙偶姻来避免过度酸化。乙偶姻能够调节NAD＋/NADH的比率并存储碳源。此外,乙偶姻作为一种具有特殊奶油香气的食用香料,广泛应用于食品,烟草、酒类和化妆品行业。近些年研究发现许多植物根际促生菌能够通过产生乙偶姻激活植物对外界环境压力的抗性,激活植物系统抗性,抵御病原菌的侵袭。乙偶姻还可以促进植物生长,提高产量。另外,乙偶姻还是调节根际促生菌与宿主植物相互作用的信号分子。简述乙偶姻的生物合成路径及其调控,并介绍乙偶姻在食品、医药、化工、化妆品、植物保护、生物燃料等方面的应用。     

乙酸合成途径阻断及NADH氧化酶表达对于谷氨酸棒杆菌生产乙偶姻的影响

【目的】研究乙酸合成途径阻断及NADH氧化酶表达对于谷氨酸棒杆菌生产乙偶姻的影响。【方法】在谷氨酸棒杆菌CGF2中异源表达als SD操纵子构建乙偶姻生产菌株CGT1,考察敲除乙酸生成途径cat和pqo对乙偶姻的影响。然后引入短乳杆菌的NADH氧化酶,在优化的溶氧条件下研究其对乙偶姻产量的影响。【结果】CGT1在摇瓶发酵中可积累6.27 g/L乙偶姻,敲除cat使乙偶姻产量显著提高30.94%,达到8.21 g/L;双敲除cat和pqo没有进一步提高产量。通过优化发酵的溶氧水平,乙偶姻产量达到10.06 g/L。在高溶氧水平下引入NADH氧化酶导致菌株的生长和糖代谢速率提高,但乙偶姻产量略有降低。在分批补料发酵中,重组菌株乙偶姻产量达到40.51 g/L,产率为0.51 g/(L?h)。【结论】在谷氨酸棒杆菌中阻断乙酸合成途径cat能够有效提高乙偶姻产量,NADH氧化酶在高溶氧水平下表达不利于乙偶姻的合成,需要进一步调节表达水平以确定其效果。     

生物法制备平台化合物乙偶姻的最新研究进展

乙偶姻(3-羟基-2-丁酮)作为一种应用广泛的食用香料和重要的平台化合物,具有广阔的工业应用前景。与传统的化学合成方法不同,高效、环保的乙偶姻生物制备方法,可以减轻资源和环境压力,促进我国低碳经济的发展。近来,生物法制备平台化学品乙偶姻取得了丰硕的研究成果。总结了最近几年国内外在该领域最新的研究热点及方向,简述了发酵法生产乙偶姻的优势菌株概况,重点综述了以糖类物质为底物生产乙偶姻的最新策略及研究成果、将微生物改造为生产手性乙偶姻的高效细胞炼制工厂以及将2,3-丁二醇或双乙酰作为发酵底物的研究趋势,并介绍了乙偶姻的分离纯化工艺。使用非致病性的安全菌株,高效率地利用廉价底物,并采用经济、简单、环保的分离纯化方式,从而生产具有高附加值的食品级或高手性纯度乙偶姻,是生物法制备乙偶姻产业化发展的可靠保障。     

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1 氧初始浓度对乳酸乳球菌、乳酸亚种、双乙酰乳酸生物变种产生双乙酰和乙偶姻的影响 许多乳酸菌,特别是乳酸乳球菌、乳酸亚种、双乙酰乳酸生物变种,能利用柠檬酸产生芳香化合物,例如乙偶姻和双乙酰。后者是新鲜、未熟奶酪中最需要的芳香化合物。柠檬酸发酵途径中,柠檬酸通过柠檬酸透性酶进入细胞,再由柠檬酸裂解酶裂解成草酰乙酸和乙酸。草酰乙酸经脱羧作用产生丙酮酸,再转化成乙醛-硫胺焦磷酸和α-乙酰乳酸。α-乙酰乳酸通过氧化脱羧作用形成双乙酰。乙偶姻     

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)发酵生产乙偶姻的pH调控策略

【目的】为了提高Bacillus subtilis CCTCC M 208157发酵生产乙偶姻的效率。【方法】在7 L发酵罐水平上考察不同pH条件对菌株生长及乙偶姻合成的影响。【结果】pH对菌株合成乙偶姻有显著影响,pH 4.5有利于细胞合成乙偶姻,但是延迟期较长;pH 5.5时菌株生长较快,但乙偶姻的产量偏低。因此提出了两阶段pH控制策略:发酵前期(0 16 h),控制pH 5.5;发酵中后期(16 72 h),控制pH 4.5。【结论】通过此策略,菌株合成乙偶姻的能力得到进一步提高,乙偶姻的产量、产率和生产强度分别为32.7 g/L、0.41 g/g和0.91 g/(L.h),分别比初始发酵条件下提高了41%、42%和69%。     

乙偶姻对解淀粉芽胞杆菌细胞生理的影响

以出发菌株解淀粉芽胞杆菌FMME044和其突变株E-11为研究对象,研究在不同浓度乙偶姻胁迫下,菌株的细胞活力、细胞存活率、胞内蛋白含量、膜电位和膜通透性的变化。结果表明:在不同乙偶姻浓度下,突变株E-11的细胞活力、菌体存活率、胞内蛋白含量和膜电位均高于出发菌株FMME044。当乙偶姻质量浓度为40、60和80 g/L时,与出发菌株相比,突变株E-11的细胞活力分别提高了7.16%、17.7%和40.1%;存活率分别提高了9.09%、18.3%和38.2%;胞内蛋白含量分别提高了9.63%、19.1%和31.6%;膜电位比出发菌株分别提高了6.28%、9.14%和27.1%。突变株E-11的膜通透性低于出发菌株,分别降低了6.33%、16.1%和33.1%。在抵抗外界乙偶姻情况下,乙偶姻耐受性菌株E-11的这些参数均高于出发菌株(膜通透性相反)。说明乙偶姻会对细胞产生毒性,但这种毒性可以通过增加菌体自身抗性而得以缓解。     

光滑球拟酵母线粒体抵御乙偶姻胁迫的生理机制解析

以光滑球拟酵母为出发菌株,利用生化和分子生物学实验研究微生物抵御有机溶剂胁迫的生理机制。首先,添加柠檬酸盐考察能量供给对细胞抵御乙偶姻胁迫的影响。与对照条件(0 mmol/L柠檬酸盐)相比,50 mmol/L柠檬酸盐可使细胞生物量在不同乙偶姻质量浓度(6、10、12和15 g/L)胁迫下分别提高了13.2%、14.2%、17.8%和25.2%。同时,通过表达线粒体融合分裂调控基因fzo1和dnm1,以细胞活力、胞内活性氧(ROS)和三磷酸腺苷(ATP)为研究指标考察调控线粒体融合分裂对乙偶姻胁迫的影响。结果表明:与对照菌株相比,在不同乙偶姻质量浓度胁迫下(12和18 g/L),增强线粒体融合可抑制胞内ROS的产生,使其水平分别降低了9.3%和16.2%;却使胞内ATP水平分别提高了9.7%和36.1%,从而延缓乙偶姻胁迫对细胞活力的影响,使细胞生物量相应地提高了9.1%和29.7%。因此,通过添加柠檬酸或改善线粒体生理功能以提高胞内能量供给,可有效提高微生物细胞抵御乙偶姻等环境胁迫的能力。     

加强表达6-磷酸果糖激酶提高Bacillus subtilis乙偶姻合成效率

乙偶姻是枯草芽孢杆菌的主要胞外产物,它是一种广泛使用的食用香精,同时也可作为重要的化学中间体,因此提高枯草芽孢杆菌乙偶姻的产量和生产效率有重要意义。本研究克隆了编码枯草芽孢杆菌6-磷酸果糖激酶(PFKA)和丙酮酸激酶(PK)的编码基因pfk A和py K,并分别将其在高产乙偶姻的枯草芽孢杆菌BM(敲除了2,3-丁二醇脱氢酶的编码基因bdh A)中过量表达。结果表明过量表达PFKA或者PK能有效提高糖酵解速率以及发酵过程的生物量,并且过量表达PFKA与过量表达PK相比更有利于乙偶姻的合成。在5 L发酵罐上对工程菌进行发酵实验发现,经底物流加发酵,乙偶姻产量达到66.8 g/L,生产效率达到0.74 g·(L·h)-1。本研究为利用枯草芽孢杆菌作为细胞工厂生产相关化合物有重要的借鉴意义。     

多粘类芽胞杆菌利用生物柴油副产物粗甘油生产乙偶姻

研究多粘类芽胞杆菌利用廉价底物生物柴油副产物粗甘油批次发酵生产乙偶姻,考察不同pH条件、不同转速下乙偶姻、2,3-丁二醇和乙酸3种主要产物的产量,根据发酵结果设计一种三阶段溶氧调节的方法,结果表明:经76h批次发酵,乙偶姻产量为14.62 g/L,副产物2,3-丁二醇和乙酸分别为1.24和2.93 g/L;副产物量低,且易于分离,可以有效减少后期分离提取产物的成本。     

枯草芽孢杆菌氧化还原感应全局调控因子Rex对乙偶姻合成的影响

【背景】枯草芽孢杆菌体内含有一种可响应胞内氧化还原水平的因子,称之为氧化还原感应全局调控因子Rex (由基因ydiH编码)。Rex可通过感知辅酶NADH/NAD+水平的变化来调节胞内氧化还原平衡。【目的】研究Rex对枯草芽孢杆菌乙偶姻合成和辅因子代谢的相关性。【方法】利用比较转录组挖掘乙偶姻和2,3-丁二醇可逆转化过程中显著差异的基因,并通过Cre/lox基因敲除技术敲除ydiH、acuA (乙酰AcsA)和acoC (二氢脂酰胺乙酰转移酶)。随后,利用实时荧光定量PCR (RT-qPCR)技术分析敲除菌株中乙偶姻相关基因的转录水平。【结果】通过发酵实验发现,敲除ydiH会在一定程度上抑制菌体的生长速率,但发酵前期乙偶姻单位细胞产量和底物转化率都得到了显著提高;敲除acuA和acoC后,对乙偶姻合成、菌体生长和糖耗速率均影响不大;敲除ydiH后,与乙偶姻合成相关基因alsR (alsSD的正转录调控因子)、alsS (α-乙酰乳酸合成酶)、alsD (α-乙酰乳酸脱羧酶)和bdhA (2,3-丁二醇脱氢酶)的转录水平显著上调。【结论】枯草芽孢杆菌氧化还原感应全局调控因子Rex通过抑制与...     

食品上的应用

924601核黄素杂文生产菌的典型代谢产物对培并物生长和维生素生成的影响「俄〕/Akimova,0.L.…厂Biotekhnologiya一1992,i一49~52〔译自DBA,1992,11(11),92一06325〕 利用核黄素杂交生产菌株枯草杆菌24(质粒pMX45)研究了不同的代谢产物(双乙酷、乙偶姻、丁二醇)对微生物生产核黄素的影响。在发酵终了时用气相色谱法检测双乙酞、乙偶姻、2,3一丁二醇、乙酸乳酸和乙酸。这些化合物对生长和核黄素生产的作用相似。双乙酞对核黄素生物合成的毒性阖值为。.029/l,乙偶姻和2,3一丁二醇的相应值分别为2和159/l。当指数生长期开始时往培养物中加…     

代谢工程改造枯草芽孢杆菌发酵生产乙偶姻

乙偶姻是枯草芽孢杆菌的主要代谢产物,它作为一种食用香精,广泛应用于食品、烟草、化妆品、清洁剂、酒类等行业。本研究首先在不产芽孢的枯草芽孢杆菌(BSD1,阻断了芽孢的合成途径)中敲除了2,3-丁二醇脱氢酶(BDH)的编码基因bdh A、乳酸脱氢酶(LDH)的编码基因ldh和乙酸激酶的编码基因(ACK)ack A,随后克隆了来自菌株B.subtilis168的α-乙酰乳酸合成酶(ALS)和α-乙酰乳酸脱羧酶(ALDC)基因als S和als D,并将其在上述敲除菌中过量表达,结果表明阻断副产物合成途径和加强乙偶姻合成途径关键酶的表达,会显著提高乙偶姻的产量,最终乙偶姻产量达到38.08 g/L,产率为0.45 g·L~(-1)·h~(-1),产率提高了约87.5%。     

应用合成生物学策略构建全细胞生物催化剂合成(S)-乙偶姻

目的:在大肠杆菌宿主中过量表达丁二酮还原酶(DAR),同时构建辅酶NADH原位再生系统,利用全细胞高效催化丁二酮不对称还原合成(S)-乙偶姻。方法:PCR克隆多黏芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa) dar基因连到质粒pETDuet-1,转化至大肠杆菌(Escherichia coli) BL21(DE3),构建重组菌E. coli BL21(DE3)-DAR;通过Hi Trap TALON柱亲和层析纯化表达产物DAR酶蛋白,测定DAR的比酶活和分子动力学参数。在重组菌E. coli BL21(DE3)-DAR中构建辅酶NADH原位再生系统,协同表达枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的葡萄糖脱氢酶(GDH),构建重组菌E. coli BL21(DE3)-DAR/GDH,并以此重组菌为全细胞生物催化剂,优化催化条件,提高(S)-乙偶姻的产量和产率。结果:获得重组工程菌E. coli BL21(DE3)-DAR和E. coli BL21(DE3)-DAR/GDH。DAR以NADH为辅酶还原丁二酮的米氏常数Km、最大催化速率Vmax、催化常数Kcat分别为2. 59mmol/L、1. 64μmol/(L·min·mg)、12. 3/s,还原丁二酮生成(S)-乙偶姻光学的纯度为95. 86%,具有较好的催化效率和立体异构体选择性。构建辅酶NADH原位再生系统后,重组菌E. coli BL21(DE3)-DAR/GDH可高效催化丁二酮合成乙偶姻。在最优催化条件下分批补料,乙偶姻产量达51. 26g/L,转化率为81. 37%,生产速率为5. 13g/(L·h)。结论:使用非手性化合物原料丁二酮生产高附加值的手性化合物(S)-乙偶姻,以重组菌为全细胞生物催化剂合成(S)-乙偶姻,不需额外添加昂贵的辅酶,具有较高的生产应用价值。     

利用发酵法生产四甲基吡嗪研究进展

2,3,5,6-四甲基吡嗪(2,3,5,6-Tetramethylpyrazine,TTMP)是一种重要的食品香料添加剂,同时具有治疗心脑血管疾病、呼吸系统疾病和肾小球疾病等的药用价值。回顾了微生物发酵法生产TTMP的研究进展,并分析了TTMP的产生机制,总结了提高生产TTMP的有效途径,包括筛选内源性高产菌株、发酵过程优化、外源添加铵盐和分阶段的发酵控制等策略。提出合成TTMP的过程是一个生化反应过程,是生物酶催化代谢产生乙偶姻和乙偶姻与铵离子自发生成TTMP两个阶段综合作用的结果,利用分阶段温度控制的发酵策略可有效提高TTMP产量。对产物的提取和纯化进行了介绍,并根据目前的进展、面对的挑战和发展趋势对发酵法生产TTMP研究前景进行了展望。     

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1.在固定化酵母生物反应器中进行啤酒快速成熟试验 在啤酒酿造中,通常α-乙酰乳酸自然氧化成双乙酰,再由酵母将双乙酰转化成乙偶姻。这两步是同时进行的,总共约需一个月时间,其中第一步是限速的关键。加温可以加速α-乙酰乳酸向双乙酰的转化,但也会影响酵母的生活力或阻断乙醇的形成。为了加速酿造过程就需要将这两个同时进行的步骤分为前后两步进行。啤酒快速酿造法的主发酵是在固定化酵母反应器中连续进行的。生产的新鲜啤酒中,α-乙酰乳酸的浓度比常规方法生产的啤酒略高。由于啤酒酵母没有α-乙酰乳酸脱羧酶,本系统的第一步是用热处理将80％α-乙酰乳酸快速转化成乙偶姻,余下的在第二步固定化酵母反应器中由酵母转化成乙偶姻。     

一株耐受高浓度葡萄糖且产乙偶姻菌株的筛选及产物鉴定

为获得一株耐受高浓度葡萄糖且产乙偶姻的菌株,利用高糖培养基以及乙偶姻显色液从烟田土壤中筛选到一株全新菌株;将筛选出的菌株利用全基因组测序技术和16S rDNA序列比对分析对菌株进行鉴定,并利用不同浓度葡萄糖的培养基对菌株进行耐受实验;最后,利用GC-MS(气相-质谱)将菌株的发酵产物定性分析,并对菌株进行72 h的初步发酵。结果显示,筛选获得菌株为金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus),命名为PX03。葡萄糖耐受实验中,菌株PX03在含有500 g/L葡萄糖的培养基中依然能生长,OD600可达65;300 g/L葡萄糖浓度下生长最好,OD600可达100。GC-MS定性结果分析发现,该菌株可产大量的乙偶姻(22.51%)和2,3-丁二醇(21.29%),同时可产乙酸(13.97%)、3,4-二羟基-3,4-二甲基己烷-2,5-二酮(8.52%)、吡喃酮(5.24%)和3-甲基-丁酸(4.47%)等一些香气成分。对菌株的初步发酵结果显示,该菌株乙偶姻产量可达41 g/L。     

α—乙酰乳酸脱羧酶的研究进展及其应用前景

在啤酒酿造中,双乙酸（diacetyl）是影响啤酒风味成熟、熟化期长短的主要因素,当其含量超过阈值（0．15x10ed）时,产生令人难以接受的馊饭味．双乙酸主要是啤酒酵母代谢的产物,由a一乙酸乳酸（a－nnetoactate）经非酶氧化脱按产生,酵母的双乙酸还原酶将其还原成乙偶姻（ec     

酱香大曲中地衣芽孢杆菌及其特征风味代谢产物的分析研究

从酱香型酒生产用的高温大曲中筛选到三株产酱香的革兰氏阳性杆菌,有芽孢,兼性厌氧。经形态学、生理生化特性和16S rDNA序列分析,鉴定其为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)。初步探索这三株细菌液态培养的最适条件,以麸皮浸出汁为培养基,150 r/min 55℃发酵6d,产生明显的酱香香气。从发酵液中检测到的乙偶姻、四甲基吡嗪和呋喃扭尔,是产酱香细菌发酵产生的特征性产物。     

用带有α-乙酰乳酸脱羧酶编码基因的固定化酵母生产啤酒

啤酒酵母VTT-A-88085(A-85)是含有α-乙酰乳酸脱羧酶(α-ALDC)基因的试验菌株。它是由深层发酵啤酒酵母VTT-A-63015(A-15)菌株构建的转化子。A-85是一株整合菌昧,即α-ald基因插入到酵母染色体DNA上,因此比用质粒转化得到的转化子更稳定。转化子产生的α-ALDC酶可直接把α-乙酰乳酸转化成乙偶姻而不形成双乙酰,因此可以免除或缩短常规啤酒发酵所需的冗长的后期发酵。     

葡萄酒中重要挥发性硫化物的代谢及基因调控

葡萄酒中的挥发性硫化物是由酿酒微生物在葡萄酒发酵过程中代谢所产生的,主要包括硫化氢、硫醇、硫醚、硫醇酯、含硫杂醇油及杂环化合物等,它们对葡萄酒的风味会产生重要影响。本综述介绍了葡萄酒中重要的挥发性硫化物的主要代谢途径及相关基因的调控机制,并提出酿酒微生物的相关研究是提高优良风味物质含量,同时抑制不良风味产生的有效途径。