表达H5亚型禽流感病毒HA基因和鸡IL-18基因重组禽痘病毒的构建

[目的]获得共表达H5亚型AIV HA基因和鸡IL-18基因的重组禽痘病毒.[方法]将含痘病毒启动子LP2EP2的HA基因和鸡IL-18基因插入到禽痘病毒转移载体pSY681中,获得重组转移载体pSYHA/IL-18.用脂质体将其转染已感染亲本禽痘病毒S-FPV-017株的鸡胚成纤维细胞,使其在鸡胚成纤维细胞内与禽痘病毒基因组发生同源重组,产生表达HA和IL-18的重组禽痘病毒(rFPV-HA-IL-18).在含有X-gal的营养琼脂培养基上进行蓝斑筛选后,对重组禽痘病毒又进行了多次蚀斑克隆.[结果]以重组禽痘病毒DNA为模板,利用HA基因和鸡IL-18基因引物进行PCR,分别扩增出1条约1.7 kb带和1条0.6 kb左右的带.以间接免疫荧光试验、T细胞转化试验和SPF雏鸡免疫接种证实重组禽痘病毒能表达HA和鸡IL-18,并初步证明鸡IL-18增强HA免疫作用.[结论]重组禽痘病毒能表达具有生物学活性的HA和鸡IL-18.     

H5N1亚型禽流感病毒HA基因核酸序列的变异分析

从GenBank上获得194株不同来源的H5N1亚型禽流感病毒HA基因核酸序列,利用MEGA3分析了HA基N核酸序列碱基突变的特点。并通过比较序列同源性,构建NJ系统进化树,探讨了不同来源的H5N1病毒的系统进化关系。序列分析结果表明,被研究的194条H5N1亚型禽流感病毒HA基因核酸序列,碱基长度大约在1700bp左右,共发现了757个可变位点,其中Parsimony—informative sites有537个,Singleton sites有220个;病毒的变异速率很快,平均变异率为3．23％;病毒的序列变异具有显著的地区特点和时间特点;同时,全球化的贸易以及候鸟的迁徙在传播病毒过程中起一定作用。     

表达LacZ基因重组火鸡疱疹病毒（HVT）的构建

将不含任何启动子的Ｅ．ｃｏｌｉ ＬａｃＺ基因,插入火鸡疱疹平素ＦＣ－１２６株胸苷激酶编码区末尾的ＮｈｅⅠ位点,构建成转移载体质粒ｐＴＫＬａｃＺ。用此质粒和ＨＶＴ感染的细胞基因组总ＤＮＡ共感染鸡胚成纤维细胞,在Ｘ－ｇａｌ存在下,通过蓝斑筛选,分离到重组体ＨＶＴ。ｒＨＶＴ与野生型ＨＶＴ－ＦＣ－１２６株在ＣＥＦ中的生长特性完全相似,且在连续传代过程中能稳定表达ＬａｃＺ基因。     

禽流感病毒HA部分基因的克隆及其表达

禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)是正粘病毒科流感病毒属的成员。AIV核酸为单链线状分段RNA,病毒表面囊膜上镶嵌着两种重要纤突,即血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)。HA和NA与病毒的毒力、传染性密切相关。其中ha基因是最重要的免疫原性基因,它刺激机体所产生的抗体可中和病毒、抵抗感染,     

禽流感病毒H5HA、H7HA、H9HA亚型血凝素基因在毕赤酵母中的表达

利用毕赤酵母表达系统进行了禽流感病毒H5HA、H7HA及H9HA亚型血凝素基因的真核表达研究。首先将H5HA、H7HA及H9HA基因片段分别插入酵母分泌型表达载体pPIC9K中,获得重组质粒pPIC9K-H5HA、pPIC9K-H7HA和pPIC9K-H9HA;再将所获重组质粒分别经SacⅠ、BglⅡ及SalⅠ线性化后,电转化GS115感受态细胞,以插入/替换的方式进行重组,并经MD平板与MM平板筛选,及PCR鉴定,得到重组酵母工程菌GS115/pPIC9K-H5HA、GS115/pPIC9K-H7HA及GS115/pPIC9K-H9HA;用甲醇诱导分泌表达目标蛋白。经SDS-PAGE和Western-blotting检测,结果表明,H5HA、H7HA及H9HA蛋白在毕赤酵母中均获得表达。酵母表达了上述目的蛋白,可直接进行抗原检测,并可用于抗体检测试剂盒及亚单位疫苗制备的辅助研究。     

禽流感病毒HA基因真核表达质粒的构建与表达

血凝素蛋白（HA）基因是禽流感病毒（AIV）重要的保护性抗原基因.为了研究 HA基因疫苗,用PCR扩增H5亚型AIV HA基因,将其克隆到质粒pcDNA4/HisMax和pRc/CMV上得到真核表达质粒pC4H5和pCMVH5.采用Tfx^TM-20、Superfect转染试剂和电转染法转染HeLa细胞,转染后的HeLa细胞经蛋白质印迹和血凝试验检测HA蛋白及其活性.结果表明,Superfect转染和电转染均能正确表达HA蛋白并具有生物学活性,蛋白质印迹检测到HA和HA裂解的HA1和HA2,与AIV 的HA、HA1、HA2蛋白的分子质量一致.从血凝试验结果看,Superfect和电转染表达的HA均具有血凝活性,而经Superfect转染的pC4H5的表达量是pCMVH5的8倍,表明pC4H5是一高效的真核表达质粒.     

禽流感病毒H5N1亚型HA基因表达及其产物的应用

根据GenBank公布的禽流感病毒H5N1亚型血凝素基因 (HA) (GenBank DQ023145) 序列设计一对引物P1、P2,以重组质粒pUC-HA为模板扩增去除信号肽的HA成熟蛋白. PCR 产物克隆入pMD18-T载体,经测序发现在967位A突变为T,形成一个终止密码子TAA. 在突变位点附近设计两条有21个碱基配对的突变引物P3、P4,采用重叠延伸剪切法 (SOE) 用A定点替换T碱基,然后将正确的基因片段定向插入到表达载体pET-32a (+) 中,诱导表达获得正确的表达产物.Western-blot分析表明,表达的重组蛋白能与经BL21(DE3)大肠杆菌菌体裂解液处理的H5亚型禽流感病毒阳性抗血清发生特异性反应.利用纯化的重组HA蛋白初步建立了检测H5亚型禽流感病毒抗体的间接ELISA方法,该方法可以代替传统的血凝与血凝抑制方法用于区分禽流感病毒的血清亚型.本研究为禽流感病毒亚单位疫苗及新型诊断试剂盒的研究奠定了基础.     

禽流感病毒HA部分基因的克隆及其表达

禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)是正粘病毒科流感病毒属的成员.AIV核酸为单链线状分段RNA,病毒表面囊膜上镶嵌着两种重要纤突,即血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA).HA和NA与病毒的毒力、传染性密切相关.其中ha基因是最重要的免疫原性基因,它刺激机体所产生的抗体可中和病毒、抵抗感染,同时,由于AIV基因组中ha基因极易发生变异,故对ha基因的研究已成为目前研究AIV的热点.我们已成功克隆了禽流感ha基因的部分片断,并对其分子特性作了初步研究,现报告如下:     

禽流感病毒H5N1亚型HA基因表达及其产物的应用

根据GenBank公布的禽流感病毒H5N1亚型血凝素基因(HA)(GenBank:DQ023145)序列设计一对引物P1、P2,以重组质粒pUC-HA为模板扩增去除信号肽的HA成熟蛋白。PCR产物克隆入pMD18-T载体,经测序发现在967位A突变为T,形成一个终止密码子TAA。在突变位点附近设计两条有21个碱基配对的突变引物P3、P4,采用重叠延伸剪切法(SOE)用A定点替换T碱基,然后将正确的基因片段定向插入到表达载体pET-32a( )中,诱导表达获得正确的表达产物。Western-blot分析表明,表达的重组蛋白能与经BL21(DE3)大肠杆菌菌体裂解液处理的H5亚型禽流感病毒阳性抗血清发生特异性反应。利用纯化的重组HA蛋白初步建立了检测H5亚型禽流感病毒抗体的间接ELISA方法,该方法可以代替传统的血凝与血凝抑制方法用于区分禽流感病毒的血清亚型。本研究为禽流感病毒亚单位疫苗及新型诊断试剂盒的研究奠定了基础。     

表达H5N1亚型禽流感病毒HA蛋白的重组鼠白血病病毒的特性

通过反转录 聚合酶链式反应 (RT PCR)扩增了H5N1亚型鹅源禽流感病毒 (AIV)完整的血凝素 (HA)基因并进行了克隆与鉴定。序列测定结果已经登陆GenBank ,登陆号为AY6 394 0 5。序列分析表明所扩增的HA基因开放性阅读框架 (ORF)由170 7个核苷酸组成 ,共编码 5 6 8个氨基酸 ,裂解位点的氨基酸组成为RKKR↓GLF ,含连续的碱性氨基酸 ,具有高致病性AIVHA基因裂解位点的特征。构建了含HA基因的真核表达载体pcDNA HA ,通过与鼠白血病病毒 (MuLV)假病毒构建体系的两种质粒pHIT6 0和pHIT111共转染人胚肾细胞 2 93T ,4 8h后收集假病毒上清 ,超离后通过Western blot证明HA蛋白能够在假病毒颗粒表面表达 ,表明HA能够整合到此病毒粒子表面。通过感染 2 93T、COS 7和NIH3T3三种不同的靶细胞 ,证实所构建的假病毒粒子具有感染性和泛嗜性。本研究成功构建了具有感染性的MuLV HA假病毒体系 ,为研究鹅源禽流感病毒侵入细胞的机理及其组织嗜性的变异提供一种新方法。     

甲型H5N1流感病毒M2与HA双基因载体疫苗在小鼠体内的免疫学评价

高致病性H5N1亚型禽流感病毒 (AIV) 严重威胁到人类健康,因此研制高效、安全的禽流感疫苗具有重要意义。以我国分离的首株人H5N1亚型禽流感病毒 (A/Anhui/1/2005) 作为研究对象,PCR扩增基质蛋白2 (M2) 和血凝素 (HA) 基因全长开放阅读框片段,构建共表达H5N1亚型AIV膜蛋白基因 M2和HA的重组质粒pStar-M2/HA。此外,还通过同源重组以293细胞包装出表达M2基因的重组腺病毒Ad-M2以及表达HA基因的重组腺病毒Ad-HA。用间接免疫荧光 (IFA) 方法检测到了各载体上插入基因的表达。按初免-加强程序分别用重组质粒pStar-M2/HA和重组腺病毒Ad-HA+Ad-M2免疫BALB/c小鼠,共免疫4次,每次间隔14 d。第1、3次用DNA疫苗,第2、4次用重组腺病毒载体疫苗,每次免疫前及末次免疫后14 d采集血清用于检测体液免疫应答,末次免疫后14 d采集脾淋巴细胞用于检测细胞免疫应答。血凝抑制 (HI) 实验检测到免疫后小鼠血清中的HI活性。ELISA实验检测到免疫后小鼠血清中抗H5N1亚型流感病毒表面蛋白的IgG抗体。ELISPOT实验检测到免疫后小鼠针对M2蛋白和HA蛋白的特异性细胞免疫应答。流感病毒M2与HA双基因共免疫的研究,为研究开发新型重组流感疫苗奠定了基础。     

H5N1亚型禽流感病毒进化的研究进展

由H5N1流感病毒引起的高致病性禽流感,在禽类之间广泛传播。当人类接触这些禽类时,可能会被感染并产生严重的呼吸道症状,且死亡率高达60%。血凝素(hemagglutinin,HA)是H5N1病毒中和抗体的主要抗原,为了便于对病毒的HA突变进行研究,根据HA遗传基因的差异远近,所有的H5病毒株都被划分在20个分支内。对于H5N1病毒进化的研究在禽流感疫苗的研制、禽流感大流行的预防等方面均具有重要意义。现对禽流感、H5N1病毒特征、血凝素的结构功能、H5N1病毒的分支以及病毒进化的研究进行概述。     

重组乳酸乳球菌表达禽流感病毒HA1基因载体的构建及在禽流感病毒防治领域的应用

目的构建以重组乳酸乳球菌为基础的黏膜输送载体。方法以高致病性禽流感病毒H5N1的HA1基因作为研究对象,利用nisin诱导表达控制系统,构建分泌型与非分泌型重组乳酸乳球菌表达载体,经口服灌胃途径免疫BALB/c小鼠,通过ELISA检测小鼠血清IgG和粪便IgA,最后,对免疫后的小鼠进行H5N1病毒攻击实验,进而比较分泌型与非分泌型重组乳酸乳球菌表达载体的免疫效率。结果分泌型重组乳酸乳球菌免疫小鼠后产生的抗体水平（IgG和IgA）高于非分泌型重组乳酸乳球菌,经过同型H5N1病毒攻击后,分泌型重组乳酸乳球菌免疫的小鼠的存活率为80%,而非分泌型重组乳酸乳球菌免疫的小鼠的存活率为60%。结论本研究为防治高致病性禽流感病毒提供可行的思路与方法。     

共表达H5N1流感病毒M1和HA基因的DNA疫苗与腺病毒载体疫苗的小鼠免疫评价

为评价在小鼠体内表达流感病毒M1和HA基因诱导的免疫反应,制备共表达H5N1亚型禽流感病毒 (A/Anhui/1/2005) 全长基质蛋白1 (M1) 基因和血凝素 (HA) 基因的重组DNA疫苗pStar-M1/HA和重组腺病毒载体疫苗Ad-M1/HA,将其按初免-加强程序免疫BALB/c小鼠,共免疫4次,每次间隔14 d。第1、3次用DNA疫苗,第2、4次用重组腺病毒载体疫苗,每次免疫前及末次免疫后14 d采集小鼠血清用于检测体液免疫应答,末次免疫后14 d采集小鼠脾淋巴细胞用于检测细胞免疫应答。血凝     

Proposed lead molecules against Hemagglutinin of avian influenza virus (H5N1)

Human infection with avian influenza H5N1 is an emerging infectious disease characterized by respiratory symptoms and a high fatality rate. Hemagglutinin and neuraminidase are the two surface proteins responsible for infection by influenza virus. Till date, neuraminidase has been the major target for antiviral drugs. In the present study we chose hemagglutinin protein as it mediates the binding of the virus to target cells through sialic acid residues on the host cell-surface. Hemagglutinin of H5 avian influenza (PDB ID: 1JSN) was used as the receptor protein. Ligands were generated by structure-based de novo approach and virtual screening of ZINC database. A total of 11,104 conformers were generated and docked into the receptor binding site using 'High Throughput Virtual Screening'. We proposed potential lead molecules against the receptor binding site of hemagglutinin based on the results obtained from in silico docking and hydrogen bond interaction between the ligand and the 1JSN protein molecule. We found sialic acid derivative 1 to be the lead molecules amongst the ligands generated by structure based de novo approach. However the molecules obtained from ZINC database were showing better docking scores as well as conserved hydrogen bond interactions. Thus we proposed ZINC00487720 and ZINC00046810 as potential lead molecules that could be used as an inhibitor to the receptor binding site of hemagglutinin. They could now be studied in vivo to validate the in silico results.     

The variable codons of H5N1 avian influenza A virus haemagglutinin genes

We investigated the selection pressures on the haemagglutinin genes of H5N1 avian influenza viruses using fixed effects likelihood models. We found evidence of positive selection in the sequences from isolates from 1997 to 2007, except viruses from 2000. The haemagglutinin sequences of viruses from southeast Asia, Hong Kong and mainland China were the most polymorphic and had similar nonsyn-onymous profiles. Some sites were positively selected in viruses from most regions and a few of these sites displayed different amino acid patterns. Selection appeared to produce different outcomes in vi-ruses from Europe, Africa and Russia and from different host types. One position was found to be positively selected for human isolates only. Although the functions of some positively selected posi-tions are unknown, our analysis provided evidence of different temporal, spatial and host adaptations for H5N1 avian influenza viruses.     

A dual reporter gene based system to quantitate the cell fusion of avian influenza virus H5N1

Membrane fusion is central to the entry of influenza virus into host cells. To quantitatively determine the fusion activity of hemagglutinin (HA) of avian influenza virus H5N1, we established a cell fusion assay based on a dual luciferase reporter gene. The HA fusion activity was assayed by measuring luciferase expression in fused cells, allowing a rapid, sensitive, and quantitative comparison of HA fusion activities at various pHs and in different cells types. The simplicity and the quantitative nature of this novel assay are ideally suited for identifying viral receptors or screening for inhibitors of viral entry in the future.     

H3N2亚型猪流感病毒M1基因克隆及表达特性分析

从H3N2亚型猪流感病毒感染的鸡胚尿囊液中提取病毒基因组RNA,采用RT-PCR方法克隆M1全长基因,将M1基因亚克隆至pET-28a(+)表达载体中,构建重组表达质粒pET-28a-M1,将该重组质粒转化大肠杆菌BL21并经IPTG诱导表达。诱导产物经SDS-PAGE电泳分析显示重组蛋白M1获得大量表达,表达蛋白纯化后免疫Wistar大鼠制备多克隆抗体。Westernblotting检测结果表明制备的抗M1蛋白多克隆抗体可以识别大肠杆菌表达的M1蛋白和病毒感染细胞的病毒M1蛋白。构建M1基因真核重组质粒p3xFLAG-CMV-7.1-M1并转染Vero细胞,Western blotting检测表明抗M1蛋白多克隆抗体可以识别在Vero细胞中得到表达的M1蛋白,成功建立M1基因的真核表达系统。分析了病毒感染过程中M1蛋白的变化及其作为病毒复制指示分子的可能性。鼠源M1蛋白多克隆抗体的制备和M1基因真核重组表达质粒的构建,为进一步研究猪流感病毒的复制机理以及M1蛋白在病毒复制过程中的生物学功能奠定了基础。     

Expression of recombinant HA1 protein for specific detection of influenza A/H1N1/2009 antibodies in human serum

The hemagglutinin genes (HA1 subunit) from human and animal 2009 pandemic H1N1 virus isolates were expressed with a baculovirus vector. Recombinant HA1 (rHA1) protein‐based ELISA was evaluated for detection of specific influenza A(H1N1)pdm09 antibodies in serum samples from vaccinated humans. It was found that rHA1 ELISA consistently differentiated between antibodies recognizing the seasonal influenza H1N1 and pdm09 viruses, with a concordance of 94% as compared to the hemagglutination inhibition test. This study suggests the utility of rHA1 ELISA in serosurveillance.     

重组虎源H5N1流感病毒HA基因犬2型腺病毒的构建与实验免疫研究

H5N1流感病毒可以对虎和猫产生致死性感染,为研制可用于预防猫科动物流感的新型疫苗,构建了重组虎源H5N1流感病毒HA基因的犬2型腺病毒。将A/Tiger/Harbin/01/2003(H5N1)的HA基因克隆入pVAX1载体中,然后将含有HA基因的表达盒(CMV HA PolyA)克隆入pVAXΔE3的SSPⅠ酶切缺失处,获得含有HA表达盒的穿梭载体pΔEHA。用SalⅠ NruⅠ分别对pΔEHA和pPoly-2-CAV2进行双酶切,将含有HA表达盒的SalⅠ NruⅠ片段克隆入pPoly2-CAV2,获得了在E3区缺失处插入HA表达盒的重组质粒pCAV-2/HA。释放CAV-2/HA重组基因组转染MDCK细胞,获得了重组活病毒CAV2/HA,经Western blot分析表明重组表达产物可被流感病毒HA单克隆抗体3A13所识别。使用该重组病毒免疫猫可以产生效价为1∶8~1∶16的抗H5亚型流感病毒血凝抑制抗体。