植物细胞表面蛋白的研究——Ⅱ.烟草细胞表面蛋白束缚二价金属离子的能力

烟草细胞表面蛋白(TCSP)能溶于稀碱(0.1NNaOH)溶液,微溶于中性盐溶液,但难溶于二价金属盐溶液中。在中性盐溶液中,pH(2—9)对其溶解度无多大影响。用乙醇和丙酮分级沉淀时,90%乙醇的得率只有58%左右,而同样浓度丙酮的得率可达70%以上。在有Mg~( )离子存在的条件下TCSP 特征光谱由270毫微米向长波方向漂移20毫微米,并在波长230毫微米处出现一个新的吸收峰。用ANS 探测结果表明,在添加Ca~( )或Mg~( )离子后,TCSP暴露的疏水链区减少。以SDS 增溶的TCSP对Mg~( )离子进行透析时,解聚的TCSP 发生重新聚合,电泳淌度也有改变。用Mg~( )离子滴定SDS 增溶的TCSP 溶液时,pH变化曲线不同于SDS 的滴定曲线。在不同离子环境中透析以降低SDS 浓度,即可形成TCSP 的聚合体,并具有不同形状。这些结果表明:TCSP 有束缚二价金属离子的能力。     

植物细胞表面蛋白的研究——Ⅳ 烟草细胞表面蛋白的盐溶性组分是部分质膜蛋白组分的外延

用EDTA和某些去垢剂在有0.15MNaCl存在的条件下提取烟草细胞表面蛋白,认为含有5％正丁醇、10 mM Tris-HC1、0.15 MNaCl和0.1mM EDTA的溶液(pH 7.5,B-TBSE)是比SDS-TBSE更为理想的溶剂。过氧化物酶、酯酶、磷酸酶和ATP酶可直接进行测定。溶液中亚丁醇和EDTA的浓度对ATP酶无明显的抑制作用。 TCSP中的盐溶性组分(TSP)可以用生理盐水直接从细胞表面洗脱。质壁分离时TSP大部分都吸附在墨表面,休克时有过氧化物酶和部分ATP酶释放出来。在高渗条件下吸附在壁表面的酶,大部分部可用1％胆酸钠增溶。除上述盐水可洗脱的酶以外,细胞壁中尚有一部分可用1％Triton X-100、1 MNaC1洗脱的和碱溶性的蛋白(ASP)结合的过氧化物酶。当细胞由对数生长期中期进入后期时,TSP的过氧化物酶活性增加而酯酶活性下降。实验表明TSP是部分质膜蛋白组分的外延。 1 mMEDTA、5 mMMgCl_2或含有1mMEDTA的5％正丁醇都不能从细胞表面洗下ATP酶。但预先用E DTA、MgCl_2或含有EDTA的正丁醇洗涤细胞,则可阻碍或促进ATP酶的分离。而且EDTA的阻碍作用可被MgCl_2抵消。     

植物细胞表面蛋白的分离和鉴定

我们发现用十二烷基硫酸钠(SDS)洗涤植物细胞,可以分离到两种蛋白。不同植物细胞的这两种蛋白,除了电泳淌度稍有不同以外,最主要的差异是量的不同。由于烟草细胞取材方便,我们对其进行了初步的分离和鉴定。SDS浸提液的紫外吸收光谱在230～240nm之间有一个肩,在260～280nm之间有一个吸收峰。Sephadex G-200凝胶过滤层析显示出两个既有茚三酮阳性反应,又含有中性糖的峰。汇集这两个峰的冼脱液进行超离心分析,结果证明是两个大分子。洗脱液经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后,用考马斯亮蓝R-250和过碘酸-Schiff试剂染色,结果表明是两种糖蛋白。这两种糖蛋白用沉淀剂三氯乙酸和磷钨酸可以分开:其一是含糖量超过30％的粘蛋白,另一是含糖量不到10％的糖蛋白。氨基酸组成分析结果表明:SDS浸提的蛋白象细胞壁蛋白一样,都是富羟脯氨酸蛋白。不同的是,SDS浸提的蛋白羟脯氨酸含量超过胞壁蛋白一半以上。SDS浸提蛋白的冻干样品处观是一种有网眼结构的膜状物,磷钨酸变性后在电镜下可以观察到丝状结构。烟草细胞的SDS可浸提的蛋白含量,在细胞生长最快时显著降低。     

鼠肝中金属硫蛋白的纯化

旨在探索鼠肝中金属硫蛋白(MT)提取工艺并加以改进。按照经典方法工艺提取MT,用中空纤维柱超滤方法加以改进,依据MT自身特点进行分离和鉴定。结果显示,粗品符合MT特点:分子量在6.5kD左右;无280nm特征吸收峰,加酸后紫外吸收(200-300nm)肩峰消失;通过离子交换可以实现MT1、MT2的分离;通过原子吸收测定,含有锌、铜、镉3种金属,锌含量最高,具有重要的病理生理意义。因此,与其它方法比较,改进后方法更适宜实验室制备。     

表面活性剂对小麦光系统Ⅰ叶绿素结合状态和能量传递的影响

表面活性剂在光合膜色素蛋白复合物的分离纯化和结构功能研究中有十分广泛的应用。为了探讨表面活性剂与光系统Ⅰ（PSⅠ）的相互作用机理,选择了两种具代表性的表面活性剂TritonX-100和十二烷基磺酸钠（SDS）,选取一系列浓度值研究了它们对PSⅠ的相互作用机理,选择了两种具代表性的表面活性剂Triton X-100和十二烷基磺酸钠（SDS）,选取一系列浓度值研究了它们对PSⅠ的影响,结果表明,SDS处理时,PSⅠ在区和蓝区的表观吸收峰值下降,峰位蓝移：TritonX-100使红区吸收峰值下降,峰位蓝称,但却使PSⅠ颗粒蓝区表观吸收升高,四阶导数光谱显示小麦（Triticum aestivumL.)PSⅠ颗粒中较长吸收波长的669nm和683nm状态叶绿素a分子受影响较大,两吸光度值互为消长且变化呈轴对称形式,而649nm组分（叶绿素b)在两作用下变化较小。表面活性剂使PSⅠ颗粒长波长荧光急剧下降,并在680nm左右出现新的荧光发射峰,可见其阻碍了激发能由天线色素向反应中心的传递。以上的变化说明SDS和TritonX-100对PSⅠ载体蛋白的微环境甚至结构产生影响而导致色素与蛋白结合状态发生改变,或从蛋白上脱落下来,最终影响到光能的吸收和能量传递。     

紫球藻藻红蛋白的分离纯化及光谱学特性

采用4℃反复浸提、离心、硫酸铵沉淀、DEAE—Sepharose Fast Flow离子交换柱层析,从紫球藻（Porphyridium cruentum Naegeli）冻干粉中分离纯化藻红蛋白,分离纯度达到4．85,总收率51．9％;经羟基磷灰石柱层析纯化,藻红蛋白纯度达到5．10,总收率34．0％,聚丙烯酰胺凝胶电泳显示1条带。所分离纯化的藻红蛋白含有3个亚基（α、β、γ）,在可见光区545nm和560nm处有2个吸收峰,在498nm处有1个吸收肩峰。实验结果说明所分离纯化的藻红蛋白纯度符合要求。     

紫色非硫光合细菌Rhodopseudomonas capsulata铁氧还蛋白的分离纯化

采用超声破碎,Triton X-100处理,30％丙酮提取,经三次DEAE-52纤维素离子交换柱层析分离纯化,我们第一次从紫色非硫光合细菌Rps.capsulata N-3菌株中,获得聚丙烯酰胺凝胶电泳纯的铁氧还蛋白(Ferredoxin)及其结晶。吸收光谱的峰值位于275舳,375nm;在450 nm、480 nm处各有较小的吸收峰。特征吸收峰比A375nm/A275nm=0.74。凝胶过滤测定它的分子量为9,000道尔顿;每分子含有8个非血红素铁和等数量的酸性不稳定硫。铁氧还蛋白能被连二亚硫酸钠化学还原,氢气和氢酶构成的酶体系还原,亦能作为电子传递载体参与菠菜叶绿体催化的DCPIPH_2→铁氧还蛋白→NADP~ 光还原。     

短梗霉黑色素的分离纯化及结构的初步分析

采用热碱提取、水煮酸沉法从短梗霉发酵液中提取得到黑色素粗品,再经DMSO萃取、酸性甲醇(pH=2)沉淀得到不含多糖和蛋白的短梗霉黑色素。此黑色素不溶于水及常规有机溶剂,可溶于碱性溶液和DMSO;离子交换色谱分析表明黑色素组分均一,出峰时间26±0.5 m in;紫外光谱谱图最大吸收峰为215 nm左右,未见蛋白(280 nm)与核酸(260 nm)的特征吸收峰;红外光谱谱图具有黑色素3μm和6μm的特征吸收峰,并含大量的羟基、氨基,与核磁共振和液质联机谱图结合分析推出短梗霉黑色素可能含有酚羟基、羧基和吲哚等官能团,主要结构骨架为5,6-二羟基吲哚-羧酸和多巴醌,推断该黑色素为酪氨酸酶控制合成的真黑素。     

盐泽螺旋藻藻胆蛋白的分离和特性研究

盐泽螺旋藻(Spirulina subsalsa)的水溶性色素粗提物经过硫酸铵沉淀和羟基磷灰石(HA)柱层析后可以分出两种藻胆蛋白,即藻蓝蛋白(c-PC)和别藻蓝蛋白(APC)。它们的纯度(指其在可见光部分的最大吸收与280nm处吸收之比)可分别达到7．27(c-PC)和6．55(APC)。而一般认可的纯度标准,PC为5,APC为6。纯化后的c—PC和APC在聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)中仅见一条色带,其最大吸收峰分别在620nm和650nm,其室温荧光发射峰分别为642nm和657nm。     

柱孢鱼腥藻的藻蓝蛋白亚基和F_(678)色素蛋白

柱孢鱼腥藻的藻蓝蛋白包含有两个亚基。β亚基具有578nm吸收峰和600nm荧光发射峰,分子量19.80±0.40KD,可表明β亚基仅有一个载色团。α亚基具有578nm和630nm吸收峰及645nm的荧光发射峰,分子量17.35±0.38,α亚基可能有两个载色团。别藻蓝蛋白有635nm和650nm吸收蜂及664nm的荧光发射峰。具藻胆体的类囊体膜从高盐浓度缓冲液移至低盐浓度缓冲液时表现678nm荧光发射峰,可能柱孢鱼腥藻存在的F_(678)色素蛋白相当于GLazer(1975)的别藻蓝蛋白B。     

发菜藻蓝蛋白分离纯化的研究

以发菜为材料,比较了提取液类型和饱和硫酸铵浓度对藻蓝蛋白提取的影响,并对藻蓝蛋白的提取程序和部分特性进行了研究。结果表明:50 mmol/L KP缓冲液(pH值7.2)是合适的提取液,体积分数为40%~50%饱和硫酸铵盐析效果优于其它浓度。经过DEAE-Toyopeal 650 S离子交换层析和SuperdexTM200凝胶过滤层析后,藻蓝蛋白纯度达6.2,最大吸收峰位于615 nm,荧光发射峰位于649 nm,由α和β2个亚基组成,其分子质量分别为18 051.17和19 142.27 Da。因此,发菜藻蓝蛋白分离纯化较为理想的程序为:藻粉→50 mmol/L KP缓冲液(pH值7.2)浸泡→French pressure(1 500 kg/cm2)破碎细胞→40%~50%饱和硫酸铵盐析→DEAE-Toyopeal 650 S离子交换层析→SuperdexTM200凝胶过滤层析→较纯的藻蓝蛋白。     

基于纳米金修饰的核酸适体生物传感器用于环孢素浓度的体外测定

利用环孢素(CsA)的两条高亲和力核酸适体生物传感器用于环孢素浓度的体外测定,在柠檬酸三钠为还原剂条件下,以氯金酸为原料,制备纳米金(Au)溶液,并对其进行表征,将aptamer-Ⅰ经酰胺化反应共价结合到磁性纳米颗粒表面,以纳米金(Au)修饰aptamer-Ⅱ,以固定在磁性纳米颗粒表面的aptamer-Ⅰ与环孢素孵育,再与Au-aptamer-Ⅱ作用,形成磁性纳米颗粒/环孢素/纳米金三明治夹心结构,磁分离技术分离三明治复合物,210 nm处检测分离前后紫外吸收强度的变化,对环孢素进行定量检测。结果紫外检测结果显示,制备的纳米金溶胶在520 nm处呈现典型的吸收峰,JEM-4 000EX电镜结果显示,纳米金溶胶颗粒粒径分布均匀、形貌、分散度较好,粒径大小在30 nm左右,此法对环孢素的响应范围是50~1 500 ng/m L,其线性回归方程为Y=4×10~(-3)X+5.769×10~(-1),R=0.997 3。此法可在1~2 h内完成检测,有望用于血液环孢素浓度的测定。     

叶绿体膜的结构与功能——Ⅷ.镁离子对叶绿体类囊体膜的叶绿素-蛋白复合体聚合的影响

小麦叶绿体类囊体膜用SDS 短时间增溶后,在不连续的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳上分离出七条含叶绿素的带,我们依其迁移率的增加及参考文献上的定名,称为CPI_(?)、CPI(P700-叶绿素a-蛋白质)、LHCP~1、LHCP~2、CP_(?)(含光系统Ⅱ反应中心的复合体)、LHCP~3(捕光叶绿素a/b-蛋白质)和FC (游离色素-SDS 复合物)。在叶绿体类囊体膜的SDS 提取物中加入Mg~( )后,则只能分离出四条含叶绿素的带,依其迁移率,并经室温吸收光谱和萤光光谱鉴定为CPI、CP_a、LHCP~3和FC。Mg~( )强烈地引起CPI_(?)和CPI 相聚合,LHCP~1、LHCP~2和LHCP~3相聚合。聚合后的蛋白复合体的吸收光谱表明:CPI 在红区的吸收峰为675nm,蓝区的吸收峰为436nm;CP_(?)在红区的吸收峰为669nm,蓝区的吸收峰为434nm;LHCP~3在红区的吸收峰为652和671nm,蓝区的吸收峰为436和470nm。分别与对照的CPI、CP_(?)和LHCP~(?)的吸收光谱相类似。而室温下二者的LHCP 的萤光激发光谱和发射光谱也彼此相似。Mg~( )引起LHCP 的聚合对叶绿体类囊体膜的结构具有重要意义。值得注意的是在叶绿体类囊体膜的SDS 提取物中加入Mg~( )后,引起CPI_(?)与CPI 的聚合,这种聚合对膜的结构与功能的影响目前仍不清楚,还有待进一步探索。     

美味侧耳病毒及其生化特性

自美味侧耳(Pleurotus sapidus)子实体中分离到两类病毒颗粒,一是球形,直径为25nm(少数为19、32am);一是杆状,具较深锯齿状亚基,大小为12～14×40～600nm,病毒具核蛋白吸收峰,最大吸收为E257nm,最小为242nm,ISCO蔗糖密度梯度离心中出现3个峰。 病毒具有分子量为44000和22000两条主要衣壳多肽,自子实体中提取到分子量约1.2×10~(?)道尔顿的dsRNA,可能是球形病毒的基因组,病毒与同属真菌糙皮侧耳(P,ostreatus)和德平菇(P,floride)球形病毒之间有血清学关系。     

B-藻红蛋白和R-藻红蛋白γ亚基的分离、特性及其在分子中的空间位置分析

紫球藻 (Porphyridiumcruentum)B 藻红蛋白和多管藻 (Polysiphoniaurceo lata)R -藻红蛋白经蛋白酶K部分酶切消化后 ,分离得到近似天然态的γ亚基 ,并且对它的光谱特性以及在藻红蛋白分子中的空间位置进行了研究 .酶解动力学分析表明γ亚基位于R- 藻红蛋白和B -藻红蛋白六聚体 (αβ) ₆的中央空洞中 .分离的γ亚基上藻红胆素的吸收峰位于 5 89nm ,荧光发射峰位于 6 2 0nm ,与藻蓝蛋白的吸收峰重叠 ,有助于藻胆体中藻红蛋白与藻蓝蛋白分子间高效能量传递 .     

马槟榔甜味蛋白的研究——Ⅰ.提取、纯化和某些特性

从中药马槟榔(Capparis masaikai Levl.)成熟种子中分离了一种能引起持久甜味的蛋白质,取名为马槟榔甜蛋白(Mabinlin),分子量11,700,等电点pH11.8,在280nm波长有最大吸收峰,其引起甜味感觉的最低浓度为0.1％,种仁含甜蛋白量约4％。     

柱孢鱼腥藻(Anabaena cylindkica)营养细胞和异形胞叶绿素蛋白复合体的比较研究

比较了柱孢鱼腥藻(Anabaena cylindrica)营养细胞和异形胞类囊体膜叶绿素蛋白复合体的种类和性质。以SDS增溶营养细胞类囊体膜和不连续聚丙烯酰胺电泳分离得到4个P700叶绿素a蛋白复合体,分别为GPIa、CPIb、CPIc和CPI;和1个系统Ⅱ叶绿素蛋白复合体CPa。相对迁移率小的4个复合体含有P700,呼收光谱红区吸收峰为675nm,液氮低温荧光发射光谱有728nm荧光发射峰。CPIa和CPI的分量子分别为205 和105千道尔顿。未见诸文献的CPIb和CPIc复合体的分子量介于CPIa和CPI之间。相对迁移率较大的CPa有着吸收光谱红区672nm吸收峰,液氮低温荧光发射光谱有687nm荧光发射峰,分子量为56千道尔顿。同时化学氧化还原差示光谱不表现P700吸收降低。柱孢鱼腥藻异形胞类囊体膜经SDS增溶和电泳分离得到2个系统Ⅰ叶绿素蛋白复合体,它们的吸收光谱特性和分子量大小相近于营养细胞分离的CPIa和CPI复合体。异形胞类囊体膜缺少系统Ⅱ叶绿索蛋白复合体。     

大肠埃希菌蛋白指纹图谱的建立

目的建立大肠埃希菌（Escherichia coli,E．coli）蛋白指纹图谱,为Ecoli感染快速诊断奠定基础。方法收集临床分离E.coli88株,提取细菌DNA,PCR检测Ecoli 16S rRNA。蛋白提取液提取细菌蛋白,干化学法测蛋白浓度,应用表面增强激光解析电离飞行时间质谱技术（SELDI-TOF-MS）检测Ecoli蛋白,采用Ciphergen Pro-teinchip软件自动采集数据。重复测定20次Ecoli混合标本,评价SELDI检测Ecoli蛋白分子量的重复性。结果E．coil标准菌株ATCC 25922和临床分离株均可检出16S rRNA。AU芯片能捕获近30个E．coli蛋白峰,其中19个蛋白峰构成E．coli特征性蛋白指纹图谱,各蛋白峰在临床分离E．coli间分子量变异系数≤0．2％。SELDI重复检测20次E．coli混合标本显示同一蛋白峰的分子量变异系数≤0．05％。结论E．coli在分子量3～20kD范围内具有特征性蛋白指纹图谱,为快速诊断E.coli感染提供了新思路。     

钝顶螺旋藻藻胆蛋白的分离,纯化及其理化特性

钝顶螺旋藻(Spirulina Platensis var.nanjingensis)一变异株的水溶性色素精提物,经固体硫酸铵沉淀,羟基磷灰石(HA)和Sephadex G-100柱层析后可分离、纯化出藻蓝蛋白(C-PC)和别藻蛋白(APC)。它们的纯度可分别达到AS 620/A_(277)=4.71;A_(650)/A_(270)=5.62。纯化后的C—PC和APC在聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)中仅见一条色带,其最大吸收峰分别在620nm和050nm。经12％的十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS—PAGE),以及高效液相色谱(HPLC)分离,C—PC和APC均可分为α和β两个亚单位。两者的亚单位分子量分别为:C—PC—α,15000;C—PC—β,14500;APC—α,15000;APC—β,13500。依此推算,该藻的C—PC和APC的最小分子量应为29.5kD和28.5kD。经等电电泳法测定,其C—PC和APC的等电点分别在4.8和4.9。氨基酸组成和含量分析结果表明,除色氨酸(Try)未测外,c—PC含有14种氨基酸,APC含有15种氨基酸,两者都缺乏组氨酸(His)和脯氨酸(Pro),C—PC还缺少蛋氨酸(Met)。     

固氮蓝藻Anabaena sp．7120的叶绿素蛋白复合体的分离和光谱特性的研究

用光合膜片增溶和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳方法,从固氮蓝藻Anabaena sp．7120分离到7条色素带。迁移率较慢的五条叶绿素蛋白复合体带,具有相同的吸收光谱和室温荧光光谱特性。它们的红区最大吸收峰在676nm;蓝区最大吸收峰在438nm。它们的室温荧光发射最高峰在672-673nm;在710,732和740nm都有小峰。这些是CPI叶绿素所特有的。我们认为这5条带都是属于光系统Ⅰ的叶绿素蛋白复合体。另一条迁移率稍快的叶绿素蛋白复合体带为CPⅡ。它的红区最大吸收峰在672nm;蓝区最大吸收峰在436nm。与CPⅠ带相比,两个峰均向短波端偏移。它们的室温荧光发射最高峰在675nm,没有CPⅠ所特有的小峰。这些性质说明此带和CPⅠ带不同,而是和光系统Ⅱ反应中心相关的一个复合体。迁移率最快的带是游离色素带。