检测不同毒力结核分枝杆菌感染对巨噬细胞凋亡的影响及其Caspase-3和Bcl-2的表达

该文为探讨不同毒力的结核分枝杆菌感染对巨噬细胞凋亡的调控作用及其机制。实验用结核分枝杆菌国际标准强毒株H37Rv株和卡介苗BCG分别感染巨噬细胞RAW264.7株,同时设空白对照组,在感染后1,6,12,24 h,用流式细胞技术检测各组巨噬细胞的凋亡率,应用Western blot检测细胞Caspase-3和Bcl-2蛋白表达。结果发现,结核分枝杆菌感染组的凋亡率显著高于对照组,差异具有统计学意义(P<0.05);BCG感染组凋亡率高于H37Rv感染组,在感染后1,12,24 h凋亡率显著升高,差异具有统计学意义(P<0.05)。巨噬细胞感染结核分枝杆菌后其Caspase-3蛋白表达增高,结核分枝杆菌感染组的Caspase-3蛋白表达高于对照组:对照组相似文献   

结核分枝杆菌海藻糖磷酸磷酸酶诱导小鼠体液和细胞免疫应答

目的 研究结核分枝杆菌(M．tuberculosis)海藻糖磷酸磷酸酶(TPP)诱导小鼠体液和细胞免疫。方法 差速离心分离结核分枝杆菌H37Rv和卡介苗(BCG)的各细胞组分,通过Western杂交检测抗原TPP在结核分枝杆菌H37Rv和BCG中的亚细胞定位情况。分别用5×10~6CFU的BCG和50μg的TPP蛋白免疫C57BL/6小鼠,检测小鼠血清中抗TPP的IgG1和IgG2a抗体效价。取免疫小鼠的脾细胞,体外抗原刺激,用酶联免疫斑点试验(ELISPOT)检测γ干扰素(IFN-γ)分泌细胞。结果 TPP亚细胞定位于结核分枝杆菌H37Rv和BCG的胞壁和细胞膜组分。TPP蛋白免疫后小鼠产生的TPP特异性IgG1和IgG2a抗体效价明显高于BCG免疫小鼠,并且IgG2a的抗体效价高于IgG1。体外抗原刺激TPP蛋白和BCG免疫小鼠的脾细胞,都能诱导较高的IFN-γ分泌。结论 结核分枝杆菌细胞壁蛋白TPP能诱导小鼠Ⅰ型辅助性T细胞介导的免疫反应,可作为抗结核疫苗的候选抗原。     

结核分枝杆菌的热休克蛋白及其抗原

<正>由病原性分枝杆菌引起的疾病,仍然是人类发病率和死亡率引起的主要原因,在发展中国家的死亡率中仅结核病就达7％。目前预防和控制分枝杆菌感染的研究,已转向包括病原菌与其哺乳类宿主细胞间相互关系的分子机理的阐明。根据结核杆菌和麻风杆菌一些重要蛋白抗原的序列分析,已知它们是热休克蛋白谱系中的成员,和大肠杆菌蛋白的Dnak、GroEL和GroES相关。本文分析了热休克对结核杆菌蛋白合成的作用,以期为阐明分枝杆菌分子遗传学与宿主-寄生间相互关系提供重要资料。     

SDS可溶性菌体蛋白在分枝杆菌菌型鉴定中的应用研究

用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)技术,对比分析了未经超声破碎,而直接以SDS、2-巯基乙醇、EDTA提取的四种分枝杆菌菌体蛋白图谱,显示人型结核分枝杆菌H₃₇R_v株与牛型分枝杆菌BCG株的图谱极相似,尤其在95KD、85KD、67/66KD、60KD及50/49KD 5条主带上完全对应,而堪萨斯及鸟分枝杆菌具有自己独特图谱。从而证实电泳对分枝杆菌的分种具有实际意义。     

特异性抗原融合蛋白结核病疫苗研究进展

结核病是一种严重危害人类健康的重大传染病,由于BCG预防效果不佳,研制新型结核病疫苗迫在眉睫。研究开发新型结核病疫苗应根据机体抗结核杆菌感染的免疫应答特点、结合BCG的不足来开展。新型结核病疫苗主要分为三类:重组BCG或重组结核菌;重组痘病毒或重组腺病毒载体疫苗;蛋白抗原亚单位或重组融合蛋白抗原亚单位疫苗。由于蛋白亚单位疫苗可以不受机体已被分枝杆菌刺激的影响,能特异性地诱导CD4+Th1细胞和CD8+细胞毒性T细胞活化,并且使用安全性好,而备受研究者的青睐。目前主要是以BCG或重组BCG初次免疫,然后选择亚单位疫苗加强免疫作为结核病疫苗序贯免疫策略。然而,单个蛋白制成亚单位疫苗,其免疫效果有限,因此将多个具有保护效果的抗原或多肽表达成融合蛋白,联合适当的佐剂,制成融合蛋白亚单位疫苗。目前,已有一些融合蛋白亚单位疫苗进入临床试验阶段,更多的融合蛋白正处于研究阶段。     

结核分枝杆菌RD1区研究进展

RD1区是结核分枝杆菌(MTB)在长期传代过程中丢失的重要保护性抗原,RD1区仅存在于致病性分枝杆菌中,而在卡介苗(BCG)及环境分枝杆菌中缺失。RD1区基因全长9.5kb,共有9个开放读码框,分别编码9个蛋白。RD1区是MTB毒力的关键因素之一,同时RD1区存在一种新分泌表达体系,能保证ESAT6和CFP10蛋白分泌表达。RD1区蛋白有较强的免疫原性,在MTB的预防和诊断中将可能发挥巨大作用,并有可能成为筛选抗MTB药物的理想靶抗原。     

大肠杆菌-分枝杆菌分泌型穿梭表达质粒pBCG-SP-HSP65的构建及人结核杆菌HSP65的表达

用PCR技术从Bacillus Calmetteguérin(BCG)基因组中扩增出抗原85B(Ag85B)的信号肽(SP)DNA序列,从pCMVMTHSP65质粒中扩增出人结核杆菌HSP65全长基因。利用DNA重组技术将以上两个片段插入质粒pBCG2100的人结核杆菌HSP70启动子下游,构建成分泌型原核穿梭表达质粒(pBCGSPHSP65)。酶切鉴定、PCR和测序分析结果均表明分泌型原核穿梭表达质粒pBCGSPHSP65构建成功。利用电穿孔将该质粒转入耻垢分枝杆菌(Mycobacterial smegmatis, MS)中,用卡那霉素筛选出阳性重组子。经热诱导后用SDS-PAGE观察到在耻垢分枝杆菌中65kD蛋白占总蛋白的20%,而在重组耻垢分枝杆菌表达的65kD蛋白占菌体总蛋白的34.46%,占裂解物上清总蛋白的68.56%,表明重组的HSP65基因能在耻垢分枝杆菌中高效表达,表达的蛋白大部分以可溶状态存在。通过Westernblot证实分泌的该蛋白能与结核杆菌HSP65的抗体特异性结合,说明该重组蛋白具有HSP65的生物学活性。     

结核分枝杆菌蛋白亚单位疫苗与疫苗诱导的T细胞免疫记忆研究进展

牛分枝杆菌减毒活疫苗--卡介苗(bacillus Calmette-Guérin,BCG)对预防严重的儿童结核病有效,但其免疫保护效率随儿童年龄增长而降低。BCG不能提供终身免疫保护可能与其诱导的记忆性T细胞主要是寿命较短的效应记忆性T细胞有关。新型结核分枝杆菌蛋白亚单位疫苗将有效的抗原有机组合起来,在适宜的疫苗佐剂辅助下诱导Th1型免疫应答。动物实验表明,增加抗原谱可有效提高亚单位疫苗的保护效率。更重要的是,亚单位疫苗在体内持续时间较短,可诱导寿命较长的中央记忆性T细胞,提供比BCG更持久的免疫保护力。记忆性T细胞的分化受抗原特性与剂量、细胞因子、转录因子及雷帕霉素等的调控。对亚单位疫苗及其诱导的免疫记忆进行研究将对新型结核分枝杆菌疫苗的设计与评价产生积极影响。     

分枝杆菌所致家兔皮肤液化病理模型研究

目的 建立卡介苗( BCG) 、H37Ra 和耻垢分枝杆菌感染的新西兰兔皮肤模型, 为肺结核干酪样坏死和继而发生的液化提供研究模型。方法 新西兰兔皮内分别注射BCG、H37Ra 和耻垢分枝杆菌的5 ×10⁶CFU、5 ×10⁴CFU、5 ×10²CFU/ml 菌液, 6 周后在病灶周围再次以相同剂量皮内注射,14 d 后病变明显时取材, 制作切片, 行HE 染色, 显微镜下观察。结果新西兰兔分别经皮内接种BCG、H37Ra 或耻垢分枝杆菌后, 高剂量组观察到明显的炎症反应和脓肿液化、破溃等改变。再次免疫可观察到郭霍现象。引起病变的严重程度依次为BCG 强于H37Ra, 后者又强于耻垢分枝杆菌。显微改变可具典型的结核结节样病灶。皮肤模型处取材, 行细菌抗酸染色, 结果阳性。BCG 中、低剂量组再次免疫可诱导小结节样病变, 但不发生液化溃疡, 其余中剂量组及低剂量组没有观察到明显改变。结论 BCG、H37Ra 和耻垢分枝杆菌均可引起皮肤干酪样坏死和液化,病理损伤与感染细菌剂量密切相关, 5 ×10⁶CFU/ml 浓度的分枝杆菌可有效诱导液化和坏死, 其中BCG 引起的病理改变最明显。     

卡介苗的黏膜免疫途径

卡介苗(BCG)是目前预防结核病的唯一疫苗,为牛分枝杆菌减毒株,自发现以来接种达30亿剂,是应用最广泛的疫苗.尽管BCG应用了80多年,但其保护效果存在争议,从0至80%不等,原因有BCG有效抗原的丢失、环境分枝杆菌的干扰等.此外接种剂量、菌株及接种途径的影响也在受到关注.世界卫生组织(WHO)推荐使用皮内接种BCG.     

大肠杆菌-分枝杆菌穿梭表达质粒pBCG-2100的构建及应用

利用分子生物学方法,构建了大肠杆菌分枝杆菌(E.coliMycobacterium)穿梭表达质粒pBCG-2100,研究了编码日本血吸虫中国大陆株谷胱甘肽S转移酶(Glutathione Stransferase,GST)抗原基因在卡介苗(Bacillus Calmette Guerin,BCG)中的表达。以含人结核杆菌热休克蛋白(Heat shock protein,hsp)70基因全长序列的质粒pMT-70为模板,扩增出hsp70启动子,测序选出无错配的启动子,将其定向克隆入E.coliMycobacterium穿梭质粒pBCG-2000中,构建成E.coliMycobacterium穿梭表达质粒pBCG-2100。再将编码GST的cDNA按正确的阅读框顺序,克隆到pBCG-2100中hsp70启动子的下游,得到分枝杆菌表达质粒pBCG-GST。将pBCG-GST电转化入BCG中,筛选出重组BCG疫苗,经热诱导后所表达的重组GST(rGST)抗原,为可溶性蛋白,经纯化后,在SDS-PAGE上分子量为26kD处可见明显的表达蛋白带,其表达量占BCG菌体总蛋白的13%。Western blot提示rGST能与抗GST的抗体反应。     

基于光激活定位显微镜的膜蛋白鉴定技术

病原菌膜蛋白的原位标记和定位追踪是一项非常繁琐的工作。为了建立一种可以用于快速鉴定膜蛋白、且分辨率达到纳米级别的膜蛋白荧光定位技术,将结核分枝杆菌外膜蛋白OmpA与具有光敏活性的蛋白mEos2m在无致病性的耻垢分枝杆菌中进行融合表达。重组菌固定在载玻片上后,利用405 nm激光激活mEos2m。利用普通荧光体视显微镜、正置荧光显微镜和超分辨率光激活定位显微镜观察OmpA-mEos2m,分析融合蛋白在细菌内的分布情况,并捕获光激活蛋白在细胞膜上释放的光子信号。通过超分辨率光激活定位显微镜,发现OmpA-mEos2m融合蛋白在细胞膜上呈"带"状环绕分布,这是观察到膜蛋白在细胞膜上定位的最直接证据。mEos2m与OmpA融合表达后,并不改变OmpA的膜蛋白属性和定位特征。因此可以将mEos2m用于其他非多聚体膜蛋白的融合和定位研究。可以应用非致病性的耻垢分枝杆菌作为模型,采用高分辨率活菌成像技术,研究致病性的结核分枝杆菌蛋白结构、定位和功能。这是目前为止国内采用光激活定位显微成像技术研究膜蛋白的首次报道。     

结核分枝杆菌热休克蛋白GroEL1的研究进展

结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)的GroEL1蛋白是基因复制产物,作为热休克蛋白(HSP)一员,不但行使原有的助折叠分子伴侣功能,而且可作为抗原,在抗原呈递中起作用。另外,由于其独特的结构特点,GroEL1还具有多种生物功能,如作为蛋白分子伴侣,控制细胞因子依赖性肉芽肿的产生;作为DNA分子伴侣,保护DNA免受损害。而在分枝杆菌属的其他物种如耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)中却行使不同的生物学功能。这些功能产生的原因和机制有待进一步研究,从而为结核病的发生及结核分枝杆菌的进化机制提供更多的依据。     

从大容量噬菌体抗体库中筛选抗Acr蛋白人源单链抗体

目的:从天然的大容量噬菌体抗体库中筛选特异的抗结核分枝杆菌晶体蛋白( alpha-crystallin Acr)的人源抗体.方法:以结核分枝杆菌Acr蛋白包被免疫管,通过对噬菌体抗体库进行4轮“吸附-洗脱-扩增”的过程从大容量抗体库中筛选特异性抗结核分枝杆菌Acr蛋白的抗体,并对可变区序列进行了测序分析.将特异性的噬菌体抗体感染HB2151菌,经IPTG诱导表达,制备了抗结核分枝杆菌Acr蛋白的可溶性单链抗体;对其序列和抗原结合活性进行分析鉴定.结果:经过4轮筛选,获得了43个与结核分枝杆菌Acr蛋白结合的阳性克隆,其中29个特异结合的克隆;测序分析有26不同的可变区片段;通过可溶性单链抗体(scFv)表达筛选到14株特异性结合Acr蛋白的可溶性单链抗体克隆;经过基因测序,分析了可变区基因的亚群.成功制备了可溶性单链抗体.Westren blotting分析证实筛选的人源单链抗体能与天然蛋白结合.结论:利用单链大容量抗体库获得抗结核分枝杆菌Acr蛋白的噬菌体抗体并且成功制备抗结核分枝杆菌Acr天然蛋白的可溶性单链抗体,为今后的研究和应用奠定基础.     

分枝杆菌膜蛋白相关抗结核药物靶标的研究进展

结核病是由结核分枝杆菌引起的慢性传染病。当前结核病耐药等问题愈加严重,基于新靶点的抗结核新药研发也变得尤为重要。分枝杆菌膜蛋白是镶嵌于细胞膜磷脂双层或与脂双层结合的一类蛋白,参与细胞结构合成、物质跨膜转运、催化等重要的生物学功能,并在宿主感染中参与免疫识别、免疫逃逸、毒力因子释放等致病机制。另一方面,膜蛋白具有特定的拓扑结构和细胞定位,药物靶标可及性强,因此膜蛋白是抗结核药物作用的理想靶标。本文就分枝杆菌膜蛋白在细胞壁合成、物质跨膜转运、细菌休眠、细菌与宿主互作及分泌系统相关研究进展进行综述,旨在为抗结核药物研发提供新思路。     

结核分枝杆菌P16蛋白的研究进展

P16蛋白是结核分枝杆菌主要的膜蛋白,对该菌的生存力和稳定性起重要的调节作用.P16蛋白主要以9个亚基的寡聚体形式存在,有抗蛋白酶的水解作用;在氨基酸序列有一α-crystallin结构,该结构与P16蛋白的分子伴侣活性密切相关;P16蛋白具有高效、自发的再折叠,再组装能力,具有极强的抗热性.P16蛋白具有较强的免疫原性,可作为预防结核的亚单位疫苗及血清学诊断试剂.     

结核分枝杆菌Rv1009的生物信息学分析及克隆、表达

以往在对藤黄微球菌的研究中发现了促进复活因子(RPF),该因子可以有效促进休眠期的多种革兰氏阳性细菌复活和生长。生物信息学分析表明在多种革兰氏阳性细菌的基因组中均存在编码RPF样蛋白的基因。从GeneBank中获得了结核分枝杆菌、麻风分枝杆菌、谷氨酸棒杆菌和微链霉菌等革兰氏阳性细菌的多种RPF样蛋白相关信息,通过同源性分析发现这些蛋白均含有一个由75个氨基酸残基构成的高度保守序列,即RPF作用域。进一步对结核分枝杆菌H37Rv株的Rv1009进行了分析,并用PCR法克隆了其编码基因全长,定向克隆至pGEX 4T-2,在大肠杆菌BL21 (DE3)中获得了Rv1009-GST融合蛋白的高效表达,为深入探讨其生物学功能奠定了基础。     

HSP70基因上游调控序列对GST基因在耻垢分枝杆菌中表达效率的 影响

将外源基因——日本血吸虫26kD抗原(Sj26GST)基因克隆 到大肠杆菌分枝杆菌穿梭质粒中,构建成四个不同的表达截体,研究它们在耻垢后分枝杆 菌(Mycobacterium smegmatis)中的表达效率。首先将含有结核杆菌热休克蛋白70(Heat Shock Protein,HSP70)的启动子的质粒pMT70用NcoI切,进行两种不同的修饰后,得到 不同的SD序列;将Sj26GST基因克隆进去。再将含HSP70启动子和Sj26GST基因的片段切下, 克隆到分枝杆菌大肠杆菌穿梭质粒pBCG2000中,筛选出不同SD序列、不同方向和不同拷 贝数的分枝杆菌表达载体四个。所表达的重组天然Sj26GST(rSj26GST)为可溶性蛋白,在SDS PAGE上分子量为26kD处可见明显的表达蛋白带。通过薄层扫描分析,发现表达质粒中双拷 贝启动子外源基因组合,表达效率最高,是单拷贝组合的16倍,占分枝杆菌菌体总蛋白 的28%。而不同的克隆方向和不同的SD序列(两者相差3个碱基)对表达效率的影响不明显。     

母牛分枝杆菌制剂对T淋巴细胞增殖反应影响的研究

以氚标记胸腺嘧啶核苷(~3H-TdR)掺入法检测每分钟脉冲数(CPM),比较母牛分枝杆菌活菌悬液、辐射杀死菌悬液及高温杀死菌悬液对健康人外周血T淋巴细胞增殖反应的影响.以此作为评价治疗以细胞介导免疫为主的结核病免疫功能障碍免疫制剂效力的一个重要参数.在加入单一刺激因子实验中,对照组CPM为448±131;加入BCG、母牛分枝杆菌活菌悬液、辐射杀灭菌悬液以及高温杀死菌悬液的CPM分别为1037±194,2299±140,1819±528,994±186.这4种制剂的刺激指数均在2.0以上,尤其是母牛分枝杆菌活菌悬液、辐射杀死菌悬液分别为5.13,4.06.结果表明,母牛分枝杆菌3种制剂与BCG基本相似,在体外对T淋巴细胞增殖反应有明显的促进作用,其中以活菌悬液和辐射杀死菌悬液更为显著.另一试验中,以重组白细胞介素-2(rIL-2)作对照,BCG、母牛分枝杆菌悬液、辐射杀死菌悬液及高温杀死菌悬液分别加入rIL-2,目的在于观察菌体抗原加淋巴因子对T淋巴细胞增殖反应有无协同刺激作用.对照组的CPM为3721±1336,BCG加rIL-2组CPM为6904±1218;母牛分枝杆菌3种制剂的CPM分别为9544±172…     

结核分枝杆菌FurB蛋白的表达及其单克隆抗体的制备

目的:制备针对结核分枝杆菌FurB蛋白的单克隆抗体(mAb)并分析其特性。方法:利用E.coli DH5α表达含有6×His的融合蛋白FurB;采用小鼠腹股沟皮下包埋硝酸纤维素膜的方法免疫小鼠,然后进行细胞融合、克隆化制备抗FurB mAb,用ELISA法初步鉴定其特异性位点和相对亲和力。结果:获得了高表达的融合蛋白,经SDS-PAGE分析,在相对分子质量15.0×10~3处有特异的目的蛋白条带。用该融合蛋白免疫小鼠后,获得了抗FurB mAb。结论:所获得的抗FurB mAb效价高、特异性强,为进一步研究FurB在结核分枝杆菌铁调控和致病过程中的作用提供了有效工具。