大肠杆菌YggG与结合蛋白Era的相互作用研究

Era是细菌生长必须的一高度保守的GTPase。yggG是从大肠杆菌全基因组文库中钓取并克隆的Era结合蛋白基因,进一步的研究表明该基因在大肠杆菌中的表达与环境应激相关,提示yggG基因产物参与细菌的应激调控。为了阐明YggG蛋白与Era蛋白间的相互关系,利用所构建的双启动子表达载体pDH2-YggG-Ptac-Era在同一细胞中同时表达YggG与Era蛋白,并通过免疫共沉淀实验检测细菌裂解产物YggG与Era蛋白间的相互作用;在此基础上,构建并表达纯化了GST融合的Era蛋白氨基端截短肽和Era羧基端截短肽,通过GST Pull-down检测了Era不同功能区域与YggG蛋白间的相互作用。结果显示, Era/YggG 复合物仅存在于同时过表达Era和YggG蛋白的细菌细胞内,不诱导Era或者不诱导YggG蛋白过表达,均检测不到Era/YggG 复合物存在;纯化的GST不能Pull-down YggG蛋白,而纯化的GST融合的Era蛋白、Era氨基端截短肽及Era羧基端截短肽均可以Pull-down YggG蛋白;GST融合Era氨基端截短肽和GST融合的Era蛋白对YggG蛋白结合作用明显高于GST融合的Era蛋白羧基端截短肽。上述结果说明,YggG是一大肠杆菌Era结合蛋白,YggG与Era的氨基端和羧基端的结合活性存在差异。     

大肠杆菌中高表达重组Era可溶性蛋白的纯化及其生化特性

质粒pCE31含有在P_L起动子控制下的重组era基因,在大肠杆菌中、42℃诱导高表达出Era蛋白,经溶菌酶处理裂菌、沉淀离心洗涤后所得的纯Era是不溶的,生物活性也不高。改在40℃诱导2h,在Era底物GDP的存在下裂菌,60％以上的Era处于可溶状态。用蛋白酶抑制剂防止Era蛋白降解,经盐析、Q-SepharoseFF柱层析分离,获得可溶性纯Era蛋白。该蛋白能特异地与鸟苷酸结合、并具有GTP酶活性,表明Era是一种G蛋白。动力学定量分析结果:在4℃时,每分子Era肽链能结合一分子GTP或GDP,表明所纯化的Era蛋白几乎都具有活性;4℃下,Era蛋白与GTP或GDP结合的解离常数,分别为5.49和1.01μmol/L;37℃时,Era蛋白GTP酶的Km值为9.0μmol/L,催化GTP水解的最大速度为9.8mmolCTP/mol Era/min。     

era因的高表达

为了高表达产生Era蛋白,借助计算机从Gene Bank中寻找N端几个氨基酸序列与Era相同的蛋白质,选其中能在大肠杆菌内高表达的λEa8．5蛋白,以其基因5’端序列替代天然ern基因5’端序列,从而赋予era基因转录物以强的翻译起始信号,而不改变其编码的氨基酸序列。将此重组era基因置于PL启动子下游、构建得质粒pCE3l,引入大肠杆菌TAPl06,经诱导后大量合成Era蛋白,且其他蛋白质的合成显著被抑制,从而使Era的含量能超过菌体总蛋白量的80％。经简单裂菌、洗涤步骤,就获得具有能特异结合鸟苷酸活性的、电泳单带纯的：Era蛋白。     

大肠杆菌基因组中存在Era亲和蛋白的基因

构建了一个大肠杆菌基因组DNA λ ZAP表达文库,以Dig标记的Era为探针,从4×10⁴噬斑中筛选到一个与探针呈特异结合的噬斑,说明大肠杆菌基因组中确有Era亲和蛋白基因存在.将该噬菌体中插段DNA前800 bp的测序结果与1996年底完成的大肠杆菌基因组全序列作同源性比较,发现该插段序列位于大肠杆菌基因组的第267 section.     

利用双启动子表达载体pDH2-YggG-Ptac-Era研究E. coli Era和YggG 蛋白间的相互关系

yggG是从大肠杆菌全基因组文库中钓取并克隆的Era结合蛋白基因,研究表明该基因表达的YggG294(amino acids 1-294)蛋白对宿主菌的生长具有强烈的抑制作用。为了阐明YggG与Era间的相互关系,构建可同时可控性表达Era和YggG294蛋白的双启动子表达载体。利用所构建的双启动子表达载体在同一细胞中同时可控性地表达YggG294与Era蛋白。结果显示,在不表达和少量表达YggG294的细菌细胞内,Era 的表达量与总蛋白量的比值随着诱导时间增加而增高,而YggG294大量表达的细菌内Era 的表达量与总蛋白量的比值基本保持不变;Era 蛋白的预表达对YggG294表达所引起的细菌生长率下降无影响。由此可以推论,YggG294的过表达引起宿主菌生长抑制进而影响了Era蛋白的进一步表达,而YggG294的过表达引起宿主菌生长抑制与YggG和Era蛋白间的相互作用无关     

大肠杆菌中rnc与era基因的共表达

 rnc,era基因是大肠杆菌两个相邻的基因。用S_1核酸酶图谱法测得转录从rnc基因伸延到era基因。当rnc基因突变使所产生的RNaseⅢ丧失活性时,大肠杆菌中RNaseⅢ和Era蛋白的合成速度同对上升,且上升幅度相同,合成量相等。将此二基因分别或一起克隆入质粒并置于P_L起动子下游时,rnc能表达产生RNaseⅢ;rnc-era能表达产生RNaseⅢ和Era两种蛋白质,单独era则虽能转录却不产生Era蛋白。实验证明:era基因的表达依赖于rnc基因的表达,在体内两者共表达体现在转录和翻译水平上,两个基因同属于一个操纵子,共同受RNaseⅢ活性的反馈调节。单独转录的era-mRNA因缺乏有效的翻译起始序列而不能被翻译。     

表达型大肠杆菌基因组文库的构建及其应用

λZAP表达载体可用于原核和真核表达,含有插段的克隆可用DNA探针或抗体探针进行筛选,并能经体内剪切,以噬菌粒(Phagemid)的形式从λ噬菌体中剪切下来,以便于对插段进行分析。为了寻找大肠杆菌中Era亲和蛋白及其基因,作者以λZAP为载体构建了表达型大肠杆菌基因组文库。 野生型大肠杆菌株S3110A的基因组DNA,在控制条件下以Sau3A1作部分酶解,使     

人era真核表达载体的构建

Era是一个独特的含有RNA结合KH结构域的G蛋白亚家族,哺乳类era新近被克隆,目前还没有关于其功能的研究报道。构建了带流感病毒血凝素9肽表位标签（HA tag）的野生型人era基因的真核表达载体,瞬时转染体外培养细胞CHO,Western blot鉴定表明目的的基因得到表达。为深入探讨人era基因的功能奠定了坚实的基础。     

GⅡ.4基因型香港株P蛋白受体结合特征的研究

分析GⅡ.4基因型中国香港株（GⅡ.4 HongKong,GⅡ.4 HK）P颗粒蛋白与组织血型抗原的相互作用方式以探索GⅡ.4 HK的受体结合特征。利用大肠杆菌蛋白表达系统得到GⅡ.4 HK及GⅡ.4 Sydney的P颗粒蛋白，通过寡糖和唾液结合实验研究其与不同组织血型抗原的结合特异性；对序列和结构进行分析，比较P蛋白的结构和功能特征。成功制备到GⅡ.4 HK与GⅡ.4 Sydney的P颗粒蛋白，GⅡ.4 HK和GⅡ.4 Sydney P颗粒与人A、B、AB、O型唾液均有结合，也与含fucose的H双糖寡糖有很好的结合。GⅡ.4 HK与GⅡ.4 Sydney流行株具有相似的组织血型抗原结合特征，但结合能力弱于GⅡ.4 Sydney流行株，GII.4 HK在多个抗原位点有氨基酸改变，可能引起抗原改变，有必要对GⅡ.4 HK流行情况的持续监测。     

尼帕病毒融合蛋白、受体结合蛋白的表达及特异性高免血清制备

尼帕病毒膜融合蛋白F和受体结合蛋白G在病毒感染和诱导机体产生保护性免疫中起重要的作用。通过PCR扩增获得尼帕病毒F1和G基因片段(均去掉信号肽和跨膜区),克隆至原核表达载体,IPTG诱导大肠杆菌表达目的蛋白,Western blot表明重组F1、G蛋白与兔抗尼帕病毒血清具有良好的反应原性;同时将F1和G基因克隆至经改造过的杆状病毒表达载体,获得了含有目的基因的重组杆状病毒,接种sf9单层细胞,间接免疫荧光检测表明F1、G蛋白在杆状病毒中正确表达,并与抗尼帕病毒血清具有良好的反应原性。以纯化原核表达的F1、G蛋白免疫兔获得了抗F1和抗G重组蛋白的特异血清,Western blot和间接免疫荧光检测表明所制备的血清具有特异性。试验所表达的抗原和制备的特异血清可用于尼帕病的诊断。     

外源基因在大肠杆菌中的高效表达

为了提高外源蛋白在大杨杆菌中的表达量,人们对大肠杆菌表达系统进行了许多研究。作者综述了有关外源基因在大肠杆菌中高效表达的研究进展。     

基于狂犬病病毒G蛋白scFv介导的靶向shRNA制备与鉴定

【目的】探讨以狂犬病病毒G糖蛋白单链抗体介导的载体表达shRNA靶向制剂,靶向抑制狂犬病毒复制的可行性。【方法】应用PCR技术获得狂犬病毒G糖蛋白单链抗体scFv(G)和绿脓杆菌跨膜区-酵母DNA结合结构域ETA-GAL4基因,通过搭桥PCR法获得scFv(G)-ETA-GAL4(SEG)嵌合基因;克隆至原核表达载体pET28a(+),构建重组表达质粒pET28a(+)-scFv(G)-ETA-GAL4(pET28a-SEG);在大肠杆菌BL21(DE3)中经IPTG诱导表达,利用镍柱亲和层析法纯化包涵体,经复性、鉴定制得SEG蛋白;ELISA法检测表达蛋白与狂犬病毒特异结合活性;将SEG蛋白与含shRNA的质粒(pRNATU6.3-shRNA)连接制成靶向shRNA,接入100 TCID50狂犬病毒感染BHK-21细胞,35 h观察细胞中绿色荧光蛋白(GFP)表达情况;48 h用直接免疫荧光抗体试验测定复合物抑制病毒效果。【结果】克隆得到1557 bp的SEG蛋白编码基因,大肠杆菌中成功表达57 KDa的SEG蛋白,能与抗His的单克隆抗体发生特异性反应,SEG蛋白经镍柱纯化、复性后得率为2.8 mg/mL。ELISA试验证明SEG蛋白在一定浓度范围内与RV结合呈正相关。细胞试验表明GFP在细胞内得到表达;直接免疫荧光试验测定该复合物能抑制76%病毒复制。【结论】SEG蛋白能与携带shRNA的质粒结合,可运送该质粒至RV感染BHK-21细胞中,抑制狂犬病毒的复制。     

Construction, expression and identification of a recombinant streptococcal protein G

化学合成链球菌蛋白G的C3D基因片段,通过分子生物学的方法对蛋白G(proteinG)的C3[1]片段进行PCR扩增,拼接形成含有两个和三个重复C3片段的重组链球菌蛋白G,C3片段间以链接区D连接,即形成C3DC3和C3DC3DC3的形式,进而克隆到质粒pET21中,在大肠杆菌BL21(DE3)中表达.重组表达的蛋白经过DEAE - Sepharose和IgG- Sepharose纯化,得到纯化的重组蛋白.采用非竞争性酶免疫法对重组蛋白与不同来源IgG的结合常数进行测定,实验结果显示两种重组链球菌蛋白G均可有效地与小鼠、兔及山羊等多种不同来源抗体特异性结合.这些实验结果为下一步研究奠定了基础.     

便于产物纯化的融合表达载体的构建

本文构建了便于目的产物纯化的融合表达载体pBG-2,即在pBV220质粒的P_RP_L启动子下游插人链球菌荡白G的IgG F_c结合区基因片段（编码60个氨基酸）,该插人片段下游仍保留多克隆位点并引人剪切融合蛋白的特异位点．SDS-PAGE显示,在大肠杆菌中融合基因片段能表达到占菌体总蛋白的30%的水平,Western-blot结果表明,表达产物能很好地与IgG结合．     

定点突变改善红色荧光指示蛋白玉米尿卟啉原Ⅲ甲基化酶的水溶性研究

尿卟啉原Ⅲ甲基化酶是一种新型的红色荧光指示蛋白,但是,在大肠杆菌重组表达的SUMT水溶性相对较低,限制了它的应用范围,而且对于结合在蛋白的色素组分尚不清楚。利用定点突变产生玉米尿卟啉原Ⅲ甲基化酶L88R/L89G双突变体和L166A突变体,两种突变体分别在大肠杆菌中重组表达,Ni-NTA一步纯化。紫外可见光谱扫描和质谱分析确定从纯化的L88R/L89G双突变体蛋白分离的色素组分。L88R/L89G双突变体在大肠杆菌细胞内有酶活,而L166A突变体胞内酶活丧失。结合蛋白的主要组分为三甲基化咕啉。纯化的双突变体蛋白水溶性增加,为提高它作为荧光指示蛋白检测外源融合蛋白的水溶性打下基础。     

Gαq介导的信号通路增强RGS4蛋白表达

RGS(regulators of G protein signaling)是G蛋白偶联信号通路中一类重要的调节蛋白,通过加速Gα结合的GTP水解,即GAP(GTPase activating protein)活性,来中止G蛋白信号通路。RGS4是RGS蛋白家族中的重要成员之一,它能有效中止Gαq介导的信号通路。作者研究了Gαq蛋白对RGS4蛋白的表达调控。当在HEK293细胞中共转染这两个蛋白时,持续性激活的Gαq能特异性地显著增加RGS4蛋白的表达。蛋白降解实验结果证明这种增强作用与RGS4的降解被抑制无关,而与RGS4 mRNA表达增强有关。进一步克隆RGS4蛋白的启动子区域并研究其与RGS4表达相互关系的实验结果又表明,持续性激活的Gαq能够显著增强RGS4启动子区的转录活性,且具有时间和浓度效应。同时,转录因子结合区突变体实验证明,ICE(inverted CCAAT box element)转录因子结合区的突变显著影响RGS4基因的转录活性。以上结果表明Gαq可能通过RGS4的启动子区调控其基因的表达,促进RGS4蛋白表达。     

链球菌蛋白G的构建、重组表达及鉴定

化学合成链球茵蛋白G的C3D基因片段,通过分子生物学的方法对蛋白G（proteinG）的C3片段进行PCR扩增,拼接形成含有两个和三个重复C3片段的重组链球茵蛋白G,C3片段间以链接区D连接,即形成C3DC3和C3DC3DC3的形式,进而克隆到质粒pET21中,在大肠杆菌BL21（DE3）中表达。重组表达的蛋白经过DEAE—Sepharose和IgG—Sepharose纯化,得到纯化的重组蛋白。采用非竞争性酶免疫法对重组蛋白与不同来源IgG的结合常数进行测定,实验结果显示两种重组链球茵蛋白G均可有效地与小鼠、兔及山羊等多种不同来源抗体特异性结合。这些实验结果为下一步研究奠定了基础。     

G蛋白偶联受体及其类型的预测

G蛋白偶联受体是非常重要的信号分子受体,其功能失调会导致许多疾病的产生。在前期工作的基础上,作者将序列特征分析与支持向量机技术结合起来,通过分析序列的特征差异,对G蛋白偶联受体分子及其类型进行识别。首次提取了G蛋白偶联受体对应的mRNA序列的绝对密码子使用频率作为特征,这主要因为它既包含了基因密码子使用偏性的信息,也包含了基因所编码蛋白的氨基酸组成信息。结果显示：在G蛋白偶联受体序列及其类型预测的问题中,设计支持向量机分类器时,最好选择使用包含基因序列绝对密码子使用频率和蛋白序列双联氨基酸使用频率两部分信息的组合特征作为特征,同时采用径向基核作为核函数。     

家蝇肽聚糖识别蛋白(PGRP-SA)的克隆表达及细菌结合研究

对家蝇PGRP-SA基因进行克隆表达以及研究其重组蛋白与细菌结合能力。从构建的家蝇(Musca domestica)幼虫cDNA质粒文库中筛选到PGRP-SA基因,以cDNA质粒为模板设计引物,通过PCR扩增,获得PGRP-SA基因完整编码序列。运用生物信息学方法对该基因及其编码蛋白进行预测和分析。构建pET-28a(+)-PGRP-SA重组质粒,转化到大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达及蛋白纯化。利用半定量RT-PCR检测PGRP-SA在家蝇3龄幼虫不同组织中的表达量差异。PGRP-SA重组蛋白进行微生物结合实验。结果表明,PGRP-SA基因ORF全长615 bp,编码204个氨基酸,理论分子量22.8 k D,等电点9.11,具有保守的PGRP结构域。成功构建了pET-28a(+)-PGRP-SA重组质粒,蛋白经IPTG诱导后在大肠杆菌中获得表达,经亲和层析柱纯化获得目的蛋白,利用Western blot检测证明纯化蛋白与预期大小相符。PGRP-SA在家蝇3龄幼虫血淋巴、脂肪体、前肠、中肠、气管、马氏管都有表达,血淋巴组织中表达量最高,后肠无表达,由此说明PGRP-SA基因的表达具有一定的组织性。PGRP-SA重组蛋白能与金黄色葡萄球菌和大肠杆菌结合,与白色念珠菌不能结合。成功表达及纯化家蝇PGRP-SA蛋白,证实家蝇PGRP-SA能与金黄色葡萄球菌和大肠杆菌结合。     

APOBEC3G蛋白的原核表达及纯化

目的：原核表达重组APOBEC3G蛋白,为其功能及免疫原性研究奠定基础。方法：提取H9细胞全细胞基因组RNA,通过RT-PCR获得目的基因,经纯化、酶切后克隆到原核表达载体pET32a中,转化大肠杆菌BL21（DE3）菌株获得表达工程菌株,并对表达条件和纯化条件进行优化;利用Western Blot分析鉴定目的蛋白。结果：构建了APOBEC3G蛋白的原核表达载体Apo-His-pET32a,并在大肠杆菌中获得高表达,目的蛋白以可溶性蛋白形式存在;经Ni-NTA亲和层析柱一步纯化,获得了高纯度的重组APOBEC3G蛋白,蛋白浓度可达1．2mg／mL;Westem Blot显示获得了目的蛋白。结论：在原核表达系统中表达、纯化了可溶性APOBEC3G蛋白,为进一步对其进行免疫原性和功能研究奠定了基础。