TNF-α刺激大鼠骨髓间充质干细胞的机制研究

目的:研究肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)刺激大鼠骨髓间充质干细胞(marrow-derived mesenchymalstem cells,MSCs)的作用机制。方法:采取大鼠骨髓,以密度梯度离心分离出单个核细胞(MNCs),于体外培养并由牛垂体提取物(PEX)诱导扩增传代培养出骨髓间充质干细胞(MSCs)。经形态学和流式细胞仪检测MSCs表面标志物鉴定后,用TNF-α刺激骨髓间充质干细胞(MSCs),通过酶联免疫吸附剂测定法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)观察比较不同组别细胞的生长因子分泌和蛋白印迹法(western blot)来观察细胞中蛋白的变化。结果:①经形态学观察和流式细胞仪检测MSCs表面标志物鉴定,提示骨髓间充质干细胞的培养成功。②无TNF-α刺激组与TNF-α刺激组比较,TNF-α刺激组的生长因子分泌显著性增加,而通过磷酸化IκB的表达量显著性增加提示NF-κB被激活(P<0.05);同时TNF-α刺激组与TNF-α+NF-κB抑制剂组比较,TNF-α+NF-κB抑制剂组的生长因子分泌显著降低,而通过磷酸化IκB的表达量显著减少提示NF-κB的活性被抑制(P<0.05)。结论:NF-κB对TNF-α刺激下的骨髓间充质干细胞分泌生长因子有关键性作用。     

TNF-α刺激大鼠骨髓间充质干细胞的机制研究

目的：研究肿瘤坏死因子-α（Tumor necrosis factor-α,TNF-α）刺激大鼠骨髓间充质干细胞（marrow-derived mesenchymalstem cells,MSCs）的作用机制。方法：采取大鼠骨髓,以密度梯度离心分离出单个核细胞（MNCs）,于体外培养并由牛垂体提取物（PEX）诱导扩增传代培养出骨髓间充质干细胞（MSCs）。经形态学和流式细胞仪检测MSCs表面标志物鉴定后,用TNF-α刺激骨髓间充质干细胞（MSCs）,通过酶联免疫吸附剂测定法（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）观察比较不同组别细胞的生长因子分泌和蛋白印迹法（western blot）来观察细胞中蛋白的变化。结果：①经形态学观察和流式细胞仪检测MSCs表面标志物鉴定,提示骨髓间充质干细胞的培养成功。②无TNF-α刺激组与TNF-α刺激组比较,TNF-α刺激组的生长因子分泌显著性增加,而通过磷酸化IκB的表达量显著性增加提示NF-κB被激活（P〈0.05）;同时TNF-α刺激组与TNF-α＋NF-κB抑制剂组比较,TNF-α＋NF-κB抑制剂组的生长因子分泌显著降低,而通过磷酸化IκB的表达量显著减少提示NF-κB的活性被抑制（P〈0.05）。结论：NF-κB对TNF-α刺激下的骨髓间充质干细胞分泌生长因子有关键性作用。     

体外缺血缺氧条件下大鼠骨髓间充质干细胞凋亡发生的机制研究

目的:研究体外大鼠骨髓间充质干细胞(Bone marrow-derived mesenchymal stem cells,BMSCs)在缺血缺氧条件下发生凋亡的作用机制。方法:采取大鼠骨髓,以密度梯度离心分离出单个核细胞(MNCs),于体外培养并由牛垂体提取物(PEX)诱导扩增传代培养出骨髓间充质干细胞(MSCs)。经形态学和流式细胞仪检测MSCs表面标志物鉴定后,骨髓间充质干细胞(BMSCs)在缺血缺氧条件下培养,通过Annexin V/PI双染细胞凋亡检测比较不同组别细胞的凋亡率和蛋白印迹法(western blot)来观察细胞中蛋白的变化。结果:①经形态学观察和流式细胞仪检测MSCs表面标志物鉴定,提示骨髓间充质干细胞培养成功。②对照组(无缺血缺氧)与缺血缺氧组比较,缺血缺氧组的凋亡率显著性增加,而通过磷酸化Akt的表达量显著性增加提示PI3K(Phosphoinosi-tide-3kinase)/Akt(ProteinkinaseB,PKB)信号通路被激活(P<0.05);同时缺血缺氧组与缺血缺氧+PI3K/Akt抑制剂(LY294002)组比较,缺血缺氧+PI3K/Akt抑制剂(LY294002)组的凋亡率显著降低,而通过磷酸化Akt的表达量显著减少提示PI3K/Akt信号通路被抑制(P<0.05)。结论:PI3K/Akt信号通路对体外缺血缺氧条件下培养的骨髓间充质干细胞凋亡发生有关键性作用。     

恒磁场抑制缺血缺氧条件下大鼠骨髓间充质干细胞凋亡

目的:研究恒磁场对体外缺血缺氧培养条件下大鼠骨髓间充质干细胞(Bone marrow-derived mesenchymal stem cells,BMSCs) 凋亡的影响并探讨其作用机制.方法:采取大鼠骨髓,以密度梯度离心分离出单个核细胞(MNCs),于体外培养并由牛垂体提取物(PEX)诱导扩增传代培养出骨髓间充质干细胞(MSCs).经形态学和流式细胞仪检测MSCs表面标志物鉴定后,将骨髓间充质干细胞(BMSCs)在缺血缺氧条件下培养,通过TUNEL检测比较不同组别细胞的凋亡率和蛋白印迹法(western blot)来观察细胞中特定蛋白质的变化.结果:①经形态学观察和流式细胞仪检测MSCs表面标志物鉴定,提示骨髓间充质干细胞培养成功.②缺血/缺氧组与缺血/缺氧+磁场组比较,缺血缺氧组的凋亡率显著性增加,Akt磷酸化水平显著上升(P＜0.05).提示恒磁场可以使PI3K(Phosphoinositide-3kinase)/Akt(ProteinkinaseB,PKB)信号通路被激活而抑制凋亡的发生.结论:恒磁场通过激活PI3K/Akt信号通路抑制体外缺血缺氧条件下培养的骨髓间充质干细胞的凋亡.     

绝经后骨质疏松症TNF-α通过激活NF-κB促进RANKL诱导的破骨细胞形成

本研究检测了绝经后骨质疏松症妇女的肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和雌激素水平,并探讨了TNF-α对破骨前体细胞RAW264.7中破骨细胞标志物核因子κB受体激活因子(nuclear factor kappa-B, RANK)、组织蛋白酶K (Cathepsin K, CTSK)和凝血酶受体激活肽(thrombin receptor activating peptide, TRAP)以及核因子-κB (NF-κB)亚基(p65)和NF-κB抑制蛋白(IκBα)的影响。研究结果表明,绝经后骨质疏松症患者的TNF-α水平显著升高,而雌二醇水平显著降低。核因子κB受体激活因子配体(receptor activator for NF-κBligand, RANKL)处理1周后,破骨前体细胞RAW264.7中破骨细胞标志物RANK、CTSK和TRAP的mRNA和蛋白高度表达。与RANKL对照组相比,TNF-α处理可上调RANK、CTSK和TRAP m RNA的表达。但是,仅TNF-α不能诱导培养的RAW264.7细胞分化为破骨细胞成。TNF-α以剂量依赖性方式诱导NF-κB亚基p65和IκBα磷酸化,而NF-κB抑制剂处理则有效降低了RANK和TRAP的表达。本研究结论表明,绝经后骨质疏松症中TNF-α通过激活NF-κB来促进RANKL诱导的破骨细胞形成。     

生殖支原体脂质相关膜蛋白激活核因子κB诱导人单核细胞表达前炎症细胞因子及凋亡

为了解生殖支原体(Mg)潜在的致病性及其脂质相关膜蛋白(LAMPs)诱导人单核细胞(THP-1)凋亡及表达前炎症细胞因子(CKs)的分子机制,用Mg提取的LAMPs刺激THP-1细胞,以ELISA法和RT-PCR方法分析CKs产生和其mRNA的表达。不同试实验组的细胞经AnnexinV联合PI染色后通过流式细胞仪检测细胞凋亡。采用EMSA方法检测LAMPs处理的THP-1细胞中核转录因子kappaB(NF-κB)的激活,并分析NF-κB抑制剂二硫代氨基甲酸吡咯烷(pyrrolidine dithiocoarbamate,PDTC)对LAMPs处理的THP-1细胞产生CKs的量和其mRNA表达及细胞凋亡的影响。LAMPs能以时间和剂量依赖方式刺激THP-1细胞产生TNF-α、IL-1β和IL-6,且能激活NF-κB诱导THP-1细胞表达CKs的mRNA及发生凋亡,PDTC能显著抑制CKs的mRNA表达水平和细胞凋亡。由于LAMPs能激活NF-κB诱导THP-1细胞表达CKs及产生细胞凋亡,因而可能是一个重要的致病因素。     

黄芩苷对脂多糖诱导的巨噬细胞NF-κB活化和炎症因子表达的影响

目的:研究黄芩苷对脂多糖(LPS)诱导小鼠巨噬细胞核因子κB(NF-κB)及肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白介素6(IL-6)表达的影响.方法:分别用LPS(终浓度1μgomL-1)和LPs+黄芩苷(终浓度10,50,100μmol moloL-1)处理生长良好的小鼠巨噬细胞RAW264.7,用RT-PCR法和Elisa法检测细胞及其上清液中TNF-α、IL-6 mRNA和蛋白的表达变化,用Western Blot法检测细胞核内NF-κB p65蛋白含量变化.结果:LPS刺激RAW264.7细胞可导致NF-κB激活,上调TNF-α、IL-6表达;黄芩苷预处理能降低LPS诱导的NF-κB出活化和TNF-α、IL-6表达.结论:黄芩苷可通过抑制NF-κB活化,下调LPS诱导的巨噬细胞TNF-α、IL-6的生成,发挥抗炎作用.这可能是其抗动脉粥样硬化的作用机制之一.     

体外缺血缺氧条件下大鼠骨髓间充质干细胞凋亡发生的机制研究

目的：研究体外大鼠骨髓间充质干细胞（Bone marrow-derived mesenchymal stem cells, BMSCs）在缺血缺氧条件下发生凋亡的作用机制。方法：采取大鼠骨髓,以密度梯度离心分离出单个核细胞（MNCs）,于体外培养并由牛垂体提取物（PEX）诱导扩增传代培养出骨髓间充质干细胞（MSCs）。经形态学和流式细胞仪检测MSCs表面标志物鉴定后,骨髓间充质干细胞（BMSCs）在缺血缺氧条件下培养,通过Annexin V／PI双染细胞凋亡检测比较不同组别细胞的凋亡率和蛋白印迹法（western blot）来观察细胞中蛋白的变化。结果：①经形态学观察和流式细胞仪检测MSCs表面标志物鉴定,提示骨髓间充质干细胞培养成功。②对照组（无缺血缺氧）与缺血缺氧组比较,缺血缺氧组的凋亡率显著性增加,而通过磷酸化Akt的表达量显著性增加提示PI3K（Phosphoinositide-3kinase）／Akt（ProteinkinaseB,PKB）信号通路被激活（P〈0．05）;同时缺血缺氧组与缺血缺氧＋PI3K／Akt抑制剂（LY294002）组比较,缺血缺氧＋PI3K／Akt抑制剂（LY294002）组的凋亡率显著降低,而通过磷酸化Akt的表达量显著减少提示PI3K/Akt信号通路被抑制（P〈0．05）。结论：PI3K／Akt信号通路对体外缺血缺氧条件下培养的骨髓间充质干细胞凋亡发生有关键性作用。     

脂多糖诱导成骨细胞中CHI3L1表达的分子机制研究

慢性骨髓炎因其病程漫长、易出现并发症以及复发率高成为临床上棘手的难题,其主要致病原因是金黄色葡萄球菌等革兰氏阴性菌感染．脂多糖(LPS)是革兰氏阴性细菌细胞壁的重要成分,用LPS在体外刺激骨组织相关细胞在一定程度上可以模拟骨髓炎患者的病理特征．实时荧光定量PCR和Western blot等试验结果表明,在骨髓炎患者的骨组织和LPS刺激的成骨细胞中,几丁质酶家族成员CHI3L1的表达均有明显升高．核因子κB (NF-κB) 萤光素酶报告载体检测结果显示,LPS能诱导细胞的NF-κB活化,NF-κB活化抑制剂Bay11-7082能抑制LPS诱导的CHI3L1表达升高．用抗肿瘤坏死因子α(TNF-α)的抗体预处理细胞,或采用siRNA干扰的方法抑制TNF-α受体的表达,都能明显抑制LPS诱导的CHI3L1表达上调．同时,NF-κB活化抑制剂Bay11-7082预处理细胞能抑制LPS对TNF-α表达的诱导作用．结果提示,LPS通过激活NF-κB诱导TNF-α分泌上调,刺激CHI3L1表达．提出骨髓炎及脂多糖刺激条件下CHI3L1表达上调,并在细胞水平上初步探讨了脂多糖诱导CHI3L1表达的分子机制．     

低氧对巨噬细胞分泌TNF-α和IL-6的影响及其机制

目的:观察低氧对巨噬细胞(Mφ)前炎症因子TNF-α和IL-6分泌的影响及其机制.方法:收集分离小鼠腹腔Mφ,建立Mφ的低氧(1% O2,5%CO2)培养模型,并用非特异性酯酶染色法进行鉴定;ELISA法检测上清液中TNF-α和IL-6的含量;RT-PCR法检测TNF-α和IL-6的转录物水平;用Western blot法检测Mφ核内NF-κB的激活量;通过在培养液中加入氢化可的松(5 mg/L),观察低氧时TNF-α和IL-6分泌量的变化.结果:TNF-α和IL-6分泌量在低氧12 h时明显增加(P＜0.01);低氧6 h时,TNF-α mRNA和IL-6 mRNA表达量明显高于对照组(P＜0.01);M中核内NF-κB的激活量在低氧2 h时明显增高(P＜0.05),低氧5 h内持续存在;而当培养液中加入氢化可的松抑制NF-κB活性后,TNF-α和IL-6的分泌水平无明显变化.结论:低氧可通过核转录因子NF-κB途径促进细胞因子TNF-α和IL-6基因的表达和分泌.     

银杏叶提取物对内毒素诱导巨噬细胞核因子-κB活化及炎性细胞因子表达的调节

探讨银杏叶提取物（EGb761）对内毒素（LPS）诱导RAW264．7细胞核因子-κB（NF-κB）活化及炎性细胞因子基因表达的调节,为银杏叶提取物的临床运用提供理论依据．分别用LPS或EGb761＋LPS处理体外培养的小鼠巨噬细胞系RAW264．7细胞,采用蛋白质印迹分析检测细胞中NF-κB活性,用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）和酶联免疫吸附法（ELISA）检测细胞中TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA和蛋白的表达．研究结果表明LPS组NF-κB活性和TNF-α、IL-1β、IL-6含量在刺激后2～12h明显高于正常对照组,而EGb761＋LPS组NF-κB活性和TNF-α、IL-1β、IL-6含量均显著低于LPS组．结果提示LPS可诱导RAW264．7细胞NF-κB活化,导致TNF-α、IL-1β、IL-6基因表达增强,而EGb761能抑制NF-κB活化而调节TNF-α、IL-1β、IL-6基因的表达．     

血红素加氧酶-1对急性重症胰腺炎相关肺损伤TLR4/NF-κB通路的影响

目的:探讨血红素加氧酶-1(HO-1)对急性重症胰腺炎相关肺损伤(PALI)Toll样受体-4(TLR4)/核因子-κB(NF-κB)信号传导通路的影响。方法:32只SD大鼠随机分为Sham组、PALI组、HO-1促进剂组、HO-1抑制剂组,每组8只。PALI组经胆胰管注入牛磺胆酸钠制备急性重症胰腺炎(ANP)动物模型。Sham组胆胰管内不注入牛磺胆酸钠,其余操作同PALI组。HO-1促进剂组于造模后30 min经腹腔注射牛血晶素75μg/kg;HO-1抑制剂组于造模后30 min经腹腔注射锌-原卟啉20μmol/kg。PALI组和Sham组均于造模后30 min经腹腔注射等量生理盐水。各组大鼠术后24 h,进行肺损伤学评分,统计肺湿/干重比值。检测大鼠术后24 h血清淀粉酶、TNF-α、IL-6、NGAL水平。检测大鼠术后24 h肺组织中TLR4、NF-κB p65蛋白表达。结果:PALI组肺损伤学评分、肺湿/干重比值、淀粉酶、TNF-α、IL-6、NGAL、TLR4、NF-κB p65明显高于Sham组;HO-1促进剂组肺损伤学评分、肺湿/干重比值、淀粉酶、TNF-α、IL-6、NGAL、TLR4、NF-κB p65明显低于PALI组;HO-1抑制剂组肺损伤学评分、肺湿/干重比值、淀粉酶、TNF-α、IL-6、NGAL、TLR4、NF-κBp65明显高于PALI组;差异均有统计学意义(P<0.05)。结论:HO-1能够通过抑制TLR4/NF-κB信号通路的激活,下调TNF-α、IL-6、NGAL等炎症因子的释放,从而发挥减轻急性重症胰腺炎相关肺损伤的作用。     

过表达MicroRNA-199a促进TNFα诱导的脂肪细胞凋亡

旨为探明micro RNA-199a(mi R-199a)对脂肪细胞凋亡的影响及核转录因子κB(nuclear factorκB,NF-κB)在其中的作用。培养3T3-L1脂肪细胞,使用肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factorα,TNFα)诱导细胞凋亡。在此基础上分别使用NF-κB阻断剂PDTC和mi R-199a mimic处理细胞,判断过表达mi R-199a对TNFα诱导的脂肪细胞凋亡的影响及NF-κB在其中的作用。使用流式细胞仪分析细胞凋亡率,试剂盒检测Caspase3/7酶活,双荧光素酶报告系统检测NF-κB活性,q RT-PCR检测mi R-199a的表达水平,Western blotting检测NF-κB相关蛋白变化。结果显示,TNFα可以诱导分化的脂肪细胞凋亡并同时激活NF-κB,激活的NF-κB在TNFα诱导的脂肪细胞凋亡中发挥负调控作用。在脂肪细胞过表达mi R-199a明显抑制NF-κB的激活进而显著促进TNFα诱导的凋亡。mi R-199a通过调控NF-κB活性参与TNFα诱导的脂肪细胞凋亡。     

姜黄素干预油酸诱导的ALI/ARDS大鼠模型对NF-κB、TNF-α和IL-6的影响

急性肺损伤(acute lung injury,ALI)/急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS)发病机制的大量研究表明核因子κB(nuclear factor kappa B,NF-κB)激活是其发生、发展的中心环节.姜黄素作为治疗ALI/ARDS的可能潜在性药物的作用和机制尚不明晰.该研究将大鼠随机分为正常组(C组)、模型组(M组)、二甲基亚砜(D组)和姜黄素治疗组(T组),通过大鼠ALI/ARDS模型,利用光镜H.E.染色观察肺部组织形态学变化,比较肺湿/干重(W/D),酶联免疫吸附法(ELISA)测定支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolarlavage fluid,BALF)中肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)和白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)含量动态变化,以及间接免疫荧光染色和免疫印记(Western blot)检测肺组织NF-κB蛋白水平变化,分析姜黄素对ALI的保护作用以及NF-κB、TNF-α和IL-6水平的影响.研究发现造模后4 h,M组BALF中TNF-α、IL-6升高并达高峰(P<0.05);姜黄素干预后,T组肺组织病理学改变减轻,BALF中蛋白渗出、TNF-α和IL-6明显减少(P<0.05).间接免疫荧光检测和Western blot结果显示C组大鼠肺组织蛋白抽提物中存在少量NF-κB蛋白,而M组明显升高,在4 h时达高峰,这一峰值出现时间与造模后肺内炎性损伤因子TNF-α、IL-6释放的高峰时间相吻合.姜黄素治疗后T组肺组织提取物NF-κB水平显著低于M组,且在12 h达高峰(P<0.05).D组与M组各检测指标未见差异(P>0.05).结果表明姜黄素能明显抑制ALI/ARDS后的NF-κB的表达,抑制炎性反应,对ARDS可能具有潜在治疗价值.     

Periostin表达上调对去势大鼠骨髓间充质干细胞生物学行为的作用

目的:探究Periostin(骨膜蛋白)表达上调对雌性去势大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)成骨分化、细胞增殖与凋亡特性的作用。方法:通过去势手术建立雌性大鼠骨质疏松模型,待建模成功后分离培养并鉴定BMSCs,利用含有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)和大鼠Periostin基因的重组慢病毒转染P3代BMSCs,成骨诱导后鉴定其成骨分化能力改变,流式细胞仪检测其细胞周期以及细胞凋亡率的变化。结果:成功建立骨质疏松模型;荧光显微镜下观察到绿色荧光提示慢病毒载体实现转染并表达目的蛋白;慢病毒转染组BMSCs成骨诱导后ALP及茜素红染色较去势组BMSCs染色加深;慢病毒转染组BMSCs的S期细胞比例为(17.07±0.56)%,显著高于去势组BMSCs的S期细胞比例(8.42±0.02)%,差异具有统计学意义(P0.05);慢病毒转染组BMSCs的细胞凋亡率为(7.3±0.1)%,显著低于去势组BMSCs的凋亡率(12.05±0.55)%,其差异具有统计学意义(P0.05)。结论:Periostin表达上调可提高去势骨髓间充质干细胞的成骨分化及细胞增殖能力,并对其凋亡有抑制作用。     

七氟烷对培养的小鼠小胶质细胞炎症因子表达的影响（英文）

目的:探讨七氟烷对培养的小鼠小胶质细胞中炎症因子表达的影响。方法:取新生(2~3天)C57BL/6小鼠,分离小胶质细胞,将其随机分为4组(n=10):对照组(Control);七氟烷组(Sevoflurane);NF-κB抑制剂组(PDTC);NF-κB抑制剂+七氟烷组(PDTC+Sevoflurane)。用Drager麻醉机向Sevoflurane组PDTC+Sevoflurane组培养的小胶质细胞盒内释放21%O2,5%CO2,4.1%七氟烷的气体,用气体分析仪持续监测各组的浓度。应用Iba-1的免疫荧光染色法对小鼠小胶质细胞进行纯度鉴定。分别在于给七氟烷后2 h、4 h和6 h时采用免疫印迹分析技术检测两组小胶质细胞IL-6和TNF-α的表达水平和NF-κB的活性。PDTC+Sevoflurane组在给七氟烷前一小时给予PDTC,采用ELISA技术和免疫印迹分析技术检测各组小胶质细胞IL-6和TNF-α的浓度和NF-κB的表达。结果:免疫印迹显示七氟烷组细胞中IL-6、TNF-α水平和NF-κB的激活水平升高;PDTC降低了七氟烷作用后核内NF-κB的表达,减弱了IL-6和TNF-α水平的升高作用。结论:七氟烷可通过激活NF-κB信号通路,进一步激活培养的小鼠小胶质细胞中炎症因子的表达。     

大鼠低氧诱导因子-1α基因转染骨髓间充质干细胞的实验研究

目的:将大鼠低氧诱导因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)基因转染到骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs),为后续基因修饰的BMSCs移植治疗脊髓缺血再灌注损伤提供必要的理论依据.方法:采用直接贴壁法分离,传代培养出纯化的大鼠BMSCs;用电穿孔的方法将构建好的大鼠HIF-1α基因表达栽体转染入BMSCs中;通过免疫细胞化学法,鉴定HIF-1α能否成功转染进入BMSCs;RT-PCR检测转染前后HIF-1α在细胞中的表达效果.结果:直接贴壁法能有效分离、纯化大鼠BMSCs;免疫细胞化学法显示转染后BMSCs内充满蓝紫色深染颗粒;RT-PCR结果显示,转染后细胞内HIF-1α基因表达量明显增高.结论:大鼠HIF-1α基因通过电穿孔方法可成功转染到符合试验标准的BMSCs中,并且稳定表达,为进一步研究修饰后HIF-1α基因对BMSCs增殖带来的影响以及治疗相关疾病等方面奠定基础.     

氧化应激对腺病毒E1A蛋白活化NF-κB转录活性的影响及其机制研究

目的:探讨腺病毒E1A蛋白对细胞内抗氧化物质谷胱甘肽(GSH)水平的影响及氧化应激对腺病毒E1A蛋白介导的核因子-κB(NF-κB)转录活化的影响。方法:构建稳定表达E1A蛋白的大鼠肺泡上皮细胞(E1A组)及对照质粒转染细胞(对照组),每组5×105个细胞,试验重复3次。采用H2O2刺激细胞,检测细胞内GSH水平。脂多糖(LPS)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)进行刺激,丁胱亚磺酰亚胺(BSO)进行干预,Western blot法检测NF-κB和AP-1蛋白的表达。结果:E1A+细胞内GSH基础水平与E1A-比较无显著差异,但在H2O2作用后没有诱导出GSH含量的上升,表现为下降而低平的趋势,去除氧化剂后,仍低于正常水平。E1A-细胞在氧化剂的作用后呈明显的上升趋势,去除氧化剂后仍高于基础水平。细胞内NF-κB蛋白表达(积分吸光度值):刺激前E1A+细胞分别为79.3±4.6和80.3±3.8,在LPS和TNF-α刺激后分别为81.8±3.9～89.9±1.6和94.1±1.9～99.8±1.6,均明显高于对照组(刺激前分别为68.3±3.8和69.4±4.3,刺激后分别为70.1±2.8～80.8±3.6和73.4±4.9～83.2±6.7)。给予BSO预处理后再用LPS和TNF-α刺激,E1A-细胞NF-κB蛋白表达的积分吸光度值(1.22±0.16和1.75±0.13)与LPS或TNF-α单独作用组(1.25±0.18和1.69±0.19)无明显差别;E1A+细胞NF-κB蛋白表达的积分吸光度值(1.75±0.10和2.26±0.21)明显高于LPS或TNF-α单独作用组(1.35±0.12和1.80±0.14)。结论:腺病毒潜伏感染持续表达E1A蛋白可以影响细胞GSH,降低细胞对氧化应激的耐受性,并可能通过此机制造成NF-κB异常转录活化,而GSH的降低又进一步放大了E1A介导的NF-κB转录活化作用。     

齐墩果酸抑制肿瘤坏死因子-α诱导的成纤维细胞样滑膜细胞炎症因子表达及其机制研究

探讨齐墩果酸(Oleanolic acid,OA)对肿瘤坏死因子-α(TNF-α)诱导成纤维细胞样滑膜细胞的炎症因子表达的影响及其机制。首先复苏培养人成纤维细胞样滑膜细胞(FLS),通过RT-PCR检测细胞IL-6及IL-1βmRNA表达,采用Western blot方法检测p38MAPK及NF-κB蛋白表达变化,通过ELISA法检测细胞上清液中IL-6及IL-1β浓度。与对照组比较,TNF-α明显诱导FLS细胞IL-6及IL-1βmRNA的表达及上清液中IL-6及IL-1β的分泌(P0.05),同时磷酸化p38蛋白和核NF-κB明显增加(P0.05),且p38MAPK阻断剂SB203580能抑制TNF-α诱导的核NF-κB增加。OA呈浓度依赖性抑制TNF-α诱导的FLS细胞p38蛋白磷酸化和核NF-κB增加(P0.05)。且OA、p38MAPK通路抑制剂SB203580或NF-κB阻断剂BAY 11-7082均能抑制TNF-α诱导的IL-6及IL-1β分泌增加(P0.05)。综上所述,OA能抑制TNF-α诱导的FLS细胞炎症因子IL-6及IL-1β的产生,其机制可能与抑制p38MAPK/NF-κB信号通路有关。