哺乳动物细胞中重组蛋白瞬时表达技术（TGE）的研究进展

近年来越来越多的重组蛋白,尤其是单克隆抗体,作为生物药应用于医疗。临床及实验室研究中,经常要求在短时间内生产一定量的候选蛋白供应研究需求。经典的建立稳定细胞系生产重组蛋白过程复杂冗长,而作为替代方法,瞬时基因表达技术在数周内即可生产数十至数百毫克重组蛋白,得到广泛应用。本文将总结近年来工业及学术上,在哺乳动物细胞尤其是人胚胎肾细胞（HEK293）TL中国仓鼠卵巢细胞（CHO）中瞬时表达重组蛋白的一系列研究,概述瞬时表达技术在宿主细胞改造、表达载体最优化设计、瞬时转染条件等方面的研究进展,并展望其未来发展方向。     

哺乳动物细胞中重组蛋白瞬时表达技术(TGE)的研究进展

近年来越来越多的重组蛋白,尤其是单克隆抗体,作为生物药应用于医疗。临床及实验室研究中,经常要求在短时间内生产一定量的候选蛋白供应研究需求。经典的建立稳定细胞系生产重组蛋白过程复杂冗长,而作为替代方法,瞬时基因表达技术在数周内即可生产数十至数百毫克重组蛋白,得到广泛应用。本文将总结近年来工业及学术上,在哺乳动物细胞尤其是人胚胎肾细胞(HEK293)及中国仓鼠卵巢细胞(CHO)中瞬时表达重组蛋白的一系列研究,概述瞬时表达技术在宿主细胞改造、表达载体最优化设计、瞬时转染条件等方面的研究进展,并展望其未来发展方向。     

高等植物叶绿体表达重组蛋白研究进展

近年来,基因工程技术发展迅速,许多重组蛋白得以表达。其中利用植物生物反应器表达特异药物蛋白为人类一些重要疾病的预防和治疗提供了新途径。植物叶绿体遗传转化和表达系统成为目前植物生物反应器的研究热点。因结构和遗传上的特殊性,高等植物叶绿体在重组蛋白表达方面具有独特优势,外源基因表达量高、定点整合,而且叶绿体母系遗传特性保证了生物安全性。很多重要药用蛋白质在植物叶绿体中表达成功。烟草作为高等植物叶绿体转化模式植物,在疫苗抗原、抗体等药物蛋白和其他重要重组蛋白表达方面取得显著进展。高等植物叶绿体遗传转化也为叶绿体基因的表达和调控机制的研究提供新的技术和方法。文中从叶绿体遗传转化原理、载体构建、重组蛋白和重要药物蛋白在叶绿体中的表达以及重组蛋白表达对植物代谢和性状影响等多个角度,对高等植物叶绿体遗传转化体系研究的新进展进行了综述,以期为叶绿体表达平台的开发和重要药用蛋白质的表达提供新思路。     

杆状病毒用于哺乳动物细胞快速高效表达外源基因的研究

现已发现杆状病毒可进入某些培养的哺乳动物细胞,这提示可将杆状病毒作为一种对哺乳动物细胞的新型基因转移载体。对杆状病毒转移载体的改造及对哺乳动物细胞的基因转移方式进行了进一步的研究。以绿色荧光蛋白基因为报告基因,利用Bac-to-Bac系统构建了分别含有正向和反向CMV启动子表达盒的两种重组杆状病毒。可观察到CMV启动子在Sf9细胞中可启动报告基因的表达,但表达效率较低。用重组杆状病毒感染后Sf9细胞的培养上清直接与HepG2细胞作用,以流式细胞术检测基因转移效率及荧光表达强度,发现这两种病毒在相同的感染复数下对HepG2细胞具有相似的基因转移及表达效率。同时,利用流式细胞术进一步研究了直接使用重组杆状病毒感染4d后Sf9细胞的培养上清对哺乳动物细胞进行基因转移的方法。通过对HepG2细胞的实验结果显示,将带毒Sf9细胞培养上清(1.2×10⁷PFU/mL)用哺乳动物细胞培养基1倍稀释后,37℃下孵育靶细胞12h(moi=50),可达到较高的基因转移及表达效率,同时不会对细胞造成明显损伤。将重组杆状病毒与脂质体和逆转录病毒这两种系统对HepG2及CV1细胞的基因转移效率进行了比较,结果发现在同样未经浓缩等特殊处理的条件下重组杆状病毒对这两种细胞的基因转移效率是最高的。因此可以认为,经过适当改造后的Bac-to-Bac重组杆状病毒系统可作为一种对哺乳动物细胞简便高效的基因转移表达载体。     

衣藻叶绿体表达重组蛋白及表达优化策略

近年来,转基因技术已日趋成熟,医学、工业上的应用也越来越广泛。以重组蛋白为基础的药物治疗是目前医药生产领域发展最快的一项技术。它们的高特异性和低副作用使得治疗效率十分突出。但是重组蛋白表达的复杂性也给生产带来了一定限制。为了促进重组蛋白的应用,人们对适宜其表达的系统和能促进其表达的策略进行了探索。研究发现,衣藻叶绿体作为重组蛋白的生物反应器,能实现重组蛋白快速、高效、低成本生产。同时,衣藻能在人工培养基和人为控制的条件下生长,降低了受污染的风险,与传统的生产系统比较具有不可比拟的优越性。因此,衣藻叶绿体作为医药重组蛋白生物反应器在未来的生物技术领域将发挥巨大作用。     

利用哺乳动物细胞表达外源蛋白的研究进展

利用哺乳动物细胞表达外源蛋白已广泛应用于生物产品的制备,哺乳动物细胞是表达具有天然活性蛋白的最佳宿主,且具有易被转染,遗传稳定,产物可分泌表达,并易于纯化和大规模生产等方面的优势。本文对选择载体类型,载体元件（包括启动子,增强子,选择标记等）以及在哺乳动物细胞大规模培养过程中培养环境,细胞凋亡的抑制和控制细胞增殖和基因表达的Tet-switch系统等方面的进展作一综述,以探讨提高该系统表达产量的有效方法,更好地应用于生物制品的生产。     

快速筛选高效表达重组蛋白毕赤酵母菌株新方法的建立及评价

毕赤酵母是当前应用最为广泛的重组蛋白表达系统之一,文中建立了一种快速筛选高效表达重组蛋白的毕赤酵母菌株的新方法.首先,对内质网转膜蛋白Sec63融合表达增强型绿色荧光蛋白EGFP的改造菌株GS115-E表达重组蛋白的能力进行检测;之后将携带不同拷贝数的植酸酶phy基因或木聚糖酶xyn基因的质粒转化进入GS115-E中,...     

哺乳动物细胞表达系统及其研究进展

从表达载体、宿主细胞、表达系统的类型及选择等四个方面对哺乳动物细胞系统进行了综述。对相关的研究进展,如高效启动子的发现和改构、新型细胞株的建立及诱导表达调控系统亦作了简要介绍。通过这些阐述,期望能建立一个简洁而清晰的有关该表达系统的框架,对在实验中决定选取何种载体、细胞株或何种表达方式时能够有所提示。     

Comparison of Small- and Large-scale Expression of Selected Pyrococcus furiosus Genes as an Aid to High-throughput Protein Production

As the natural extension of the genomic sequencing projects, the goal of the various world-wide Structural Genomics projects is development of techniques for high throughput (HTP) cloning, protein overexpression, purification and structural determination, with the ultimate goal of determining all possible protein structures. Rapid (small-scale) screening of potential expression clones under different growth conditions is presumed to be possible and a viable way to increase throughput of protein expression. In order to test the utility of screening for soluble, heterologous protein expression, we have compared the production of recombinant proteins on a small scale (1 ml cultures in 96-well plates) in Escherichia coli under two growth conditions [a rich medium and a defined (minimal) medium] using an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) against the affinity tag, with the amount of recombinant protein produced during the large-scale (500 ml) growth of E. coli. The large-scale expression products were examined after a single step affinity purification by visualization on SDS-PAGE gels. Of the open reading frames that were successfully expressed on the 1 ml scale as judged by immunodetection, 80% of them successfully scaled-up to 500 ml in a rich medium and 81% of them scaled-up in a defined medium. This is significantly higher than would be expected by a randomly selected expression condition and validates the use of small-scale expression as a screening tool for more efficient protein production.     

Recombinant Protein Expression for Structural Biology in HEK 293F Suspension Cells: A Novel and Accessible Approach

The expression and purification of large amounts of recombinant protein complexes is an essential requirement for structural biology studies. For over two decades, prokaryotic expression systems such as E. coli have dominated the scientific literature over costly and less efficient eukaryotic cell lines. Despite the clear advantage in terms of yields and costs of expressing recombinant proteins in bacteria, the absence of specific co-factors, chaperones and post-translational modifications may cause loss of function, mis-folding and can disrupt protein-protein interactions of certain eukaryotic multi-subunit complexes, surface receptors and secreted proteins. The use of mammalian cell expression systems can address these drawbacks since they provide a eukaryotic expression environment. However, low protein yields and high costs of such methods have until recently limited their use for structural biology. Here we describe a simple and accessible method for expressing and purifying milligram quantities of protein by performing transient transfections of suspension grown HEK (Human Embryonic Kidney) 293F cells.     

Large-scale Transient Transfection of Mammalian Cells: A Newly Emerging Attractive Option for Recombinant Protein Production

Mammalian expression systems have an undisputed long-standing and very successful history for the generation of recombinant proteins, mainly as biopharmaceuticals. However, for use as ‘tool proteins’ in, e.g. assay development and screening, for structure elucidation and as antigens these expression systems were generally regarded as being cumbersome, tedious and expensive. This bias has largely been overcome with the very recent development of large-scale transient transfection (LST) approaches. Especially the HEK.EBNA expression system described here has contributed significantly to this success. The simplicity and speed of this approach compares well with expression trials using the widely applied Baculovirus/insect cell system. In addition, proteins generated in mammalian cells are usually correctly folded, fully processed and functionally active.     

哺乳动物细胞表达系统研究进展

目前,哺乳动物细胞已成为生产多种生物药物的首选宿主细胞。哺乳动物细胞表达系统可进行翻译后修饰,表达的重组蛋白接近人源构象,因此被大量用于治疗性重组蛋白的生产,如何建立高效的哺乳动物细胞表达系统也受到研究者们的重视。随着基因组学、转录组学、蛋白质组学以及代谢组学研究不断深入,近几年来在优化哺乳动物表达系统方面取得了长足的进步。从高效表达载体构建、宿主细胞改造、高通量筛选、培养基优化等方面阐述哺乳动物细胞表达系统的研究进展,以期为研究者们提供一定的帮助。     

Efficient Mammalian Cell Expression and Single-step Purification of Extracellular Glycoproteins for Crystallization

Production of secreted mammalian proteins for structural and biophysical studies can be challenging, time intensive, and costly. Here described is a time and cost efficient protocol for secreted protein expression in mammalian cells and one step purification using nickel affinity chromatography. The system is based on large scale transient transfection of mammalian cells in suspension, which greatly decreases the time to produce protein, as it eliminates steps, such as developing expression viruses or generating stable expressing cell lines. This protocol utilizes cheap transfection agents, which can be easily made by simple chemical modification, or moderately priced transfection agents, which increase yield through increased transfection efficiency and decreased cytotoxicity. Careful monitoring and maintaining of media glucose levels increases protein yield. Controlling the maturation of native glycans at the expression step increases the final yield of properly folded and functional mammalian proteins, which are ideal properties to pursue X-ray crystallography. In some cases, single step purification produces protein of sufficient purity for crystallization, which is demonstrated here as an example case.     

转基因植物表达重组蛋白的研究进展

植物表达系统的一些潜在优点 ,如重组蛋白的高积累水平 ,糖基化 ,细胞内的定位和自然储藏的稳定性是目前植物生产重组蛋白系统研究成为热点的主要原因 .在研究和选择转基因植物表达系统的过程中 ,转化 ,转化后 ,翻译 ,翻译后等环节都会影响到最终产物的数量和质量 ,因此应该了解基因表达的规律 ,以制定植物生产重组蛋白合适的策略 ,重组蛋白积累水平是关键 ,但其它因素如植物的选择 ,转基因植物的处理 ,下游加工等同样重要 .某些情形下 ,仅下游加工的成本一项就影响到特定植物表达系统的实际应用价值 .     

哺乳类细胞基因表达系统

通过适当的设计,可以构建在哺乳类细胞中表达的质粒,将其导入哺乳类细胞后,可以有效地表达外源基因．文章主要就这类质粒的特征、分类及其研究进展等方面予以综述．     

重组土拉弗朗西斯菌外膜蛋白FopA的融合表达及抗原性分析

目的:探索一种大量表达功能性土拉弗朗西斯菌外膜蛋白FopA的方法。方法:采用SignalP 3.0 Server进行信号肽预测,将土拉弗朗西斯菌外膜蛋白FopA信号肽的基因序列(75bp)去除,将1107bp的核心序列克隆至原核表达载体pET32a,并在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达。结果:构建了pET32a-fopA载体,重组蛋白FopA表达量约占菌体总蛋白量60%,Western blot分析显示重组FopA蛋白有较好的抗原性。结论:获得了高效表达FopA的pET32a-fopA表达载体,为下一步土拉弗朗西斯菌外膜蛋白FopA应用研究奠定了基础。     

杆状病毒介导的哺乳动物细胞基因转移及其影响因素

杆状病毒作为优良的哺乳动物细胞基因转移载体已在基因治疗、疫苗开发、药物筛选以及基因调控研究等方面发挥巨大作用。但杆状病毒对哺乳动物细胞的嗜性不够广泛、转导效率和转基因表达水平偏低,以及表达持续时间短暂等问题制约其进一步发展,因此如何突破这个制约的瓶颈成为学者们新的关注焦点。针对以上问题,围绕杆状病毒介导哺乳动物细胞基因转移的各种影响因素进行综述。     

重组蛋白表达系统的研究进展

利用基因重组表达外源蛋白在现代生物学技术的发展与应用中起着重要的作用。根据外源基因表达宿主不同,可以将表达系统大致分为两类:原核和真核表达系统。该文比较了常见的几种表达系统的优缺点,并探讨了在选择适合的表达系统时所需要考虑的因素如目标蛋白的产量、生物学活性、用途及其物理化学性质以及表达系统本身的成本、便利性及其安全性等,以便于选择适合的表达系统,优化提高重组蛋白产量等,进而更好地服务于科学研究。