基于烟草瞬时表达体系对amiRNA沉默效果快速有效的预验证

amiRNA(artificial microRNA)作为一种诱导基因发生特异性沉默的技术已在多种植物中应用,但设计出的不同amiRNAs在所转化株系中的沉默效率难以预测,因此对amiRNA载体的沉默效率进行预验证是非常必要的。本实验以丹参(Salvia miltiorrhiza)的1个MYB类转录因子基因SmPAP1的mRNA序列为amiRNA作用对象,并挑选2个经在线软件WMD3(Web MicroRNA Designer)设计的amiRNAs,分别命名为amiRNA1-SmPAP1和amiRNA2-SmPAP1,然后通过农杆菌介导将构建的2个amiRNA载体和SmPAP1过表达植物载体在烟草叶片细胞中进行瞬时共表达。结果显示,amiRNA2的表达丰度约是amiRNA1的2倍;amiRNA2对靶标SmPAP1的沉默效率约是amiRNA1的2.5倍;SmPAP1在mRNA和蛋白水平上均与相应amiRNA的表达水平呈显著负相关。因此,amiRNA在烟草细胞中的瞬时表达可快速、有效地对不同amiRNA沉默效果进行预验证,从而为后续的植物遗传转化研究提供重要参考。     

肝细胞靶向性系统表达载体的构建

在肝脏疾病的基因治疗过程中,为把目的基因定向导入靶细胞,构建了具有靶向性的逆转录病毒的包装细胞．即应用RT-PCR方法分别反转录并扩增env,pres2基因,将它们分别克隆至pGEM-T载体上,经测序正确后,将一目的基因亚克隆在pcDNA3．1(-)表达载体上,然后将另一目的片段从T载体上切下,克隆至经同样酶切的重组表达载体中。从而成功地构建了肝细胞靶向性系统的表达载体pcDNA3．1(-)-env-pres2和pcDNA3．1(-)-pres2-env。     

用于鉴定microRNA靶基因的新型双萤光素酶报告基因系统的构建及应用

目的:构建用于鉴定microRNA靶基因的报告基因系统。方法:在pGL3-Basic载体的luc基因上游插入CMV启动子,下游插入用于克隆靶基因3’UTR的多克隆位点,构建报告基因载体pMIR-luciferase;将pMIR-lu-ciferase载体的luc基因替换成Rluc基因,构建内参载体pMIR-control;将补体因子H(CFH)的3’UTR插入pMIR-luciferase载体的多克隆位点处,构建含有CFH 3’UTR的报告基因载体;用pIRES2-EGFP载体构建microRNA146a真核表达载体;将含有CFH 3’UTR的报告基因载体、microRNA146a真核表达载体及内参载体共转染HepG2细胞,进行报告基因的活性检测。结果:构建了报告基因载体、内参载体和microRNA146a真核表达载体,经酶切和测序鉴定正确;microRNA146a真核表达载体转染细胞72 h后,经荧光显微镜观察确认载体转染及表达;用实时定量PCR检测,microRNA146a的表达水平显著上调(P<0.01);用构建的报告基因系统检测,结果表明microRNA146a显著地抑制了含CFH 3’UTR的报告基因的活性(P<0.05)。结论:构建了一种新型的报告基因载体系统,该系统可用于miRNA靶基因的鉴定。     

基于URA3基因快速构建表达载体及其在里氏木霉的应用

【背景】表达载体是基因工程必不可少的工具,对于真菌如里氏木霉(Trichoderma reesei)等,由于缺乏商品化的表达载体,使其基因工程蛋白表达既复杂又费时而难以开展。【目的】建立一种利用URA3序列快速构建表达载体的方法,解决真菌研究中难以简单、高效和快速构建表达载体的难题。【方法】基于URA3基因的序列,利用其启动子上游5′端序列和终止子下游3′端序列构建同源重组臂,通过同源重组臂定向同源重组到宿主基因组上,利用强启动子和终止子替换URA3基因,从而实现外源基因的表达。根据此方法构建pTRUC表达载体,将红色荧光蛋白基因mCherry克隆到该表达载体上,转化里氏木霉中并验证m Cherry的表达。【结果】阳性转化子在荧光显微镜下观察到强的红色荧光信号,在基因组PCR中检测到mCherry,Westernblotting结果表明红色荧光蛋白m Cherry能在里氏木霉中表达,以上结果说明该载体构建成功,使外源基因mCherry在里氏木霉中正确表达。【结论】基于URA3基因的快速构建表达载体及其构建方法切实可行,将成为推动真核表达系统表达异源蛋白的有力工具。     

FLT-1启动子荧光素酶报告基因重组体的构建和鉴定

目的：为探索FLT-1启动子靶向调控活性分析,克隆FLT-1启动子基因序列,构建并鉴定肿-1启动子调控的荧光素酶报告基因重组体pGL3-FLT—Basic—luc。方法：应用聚合酶链式反应（PCR）技术扩增FLT-1启动子序列,定向亚克隆至荧光素酶表达载体pGL3-Basic—luc中,构建含有正确目的基因的报告基因重组体pGL3-FIT—Basic—luc,通过限性内切酶酶切、PCR及测序进行鉴定。结果：通过酶切鉴定及基因测定证明,所克隆的基因产物与预期结果-致,序列无碱基突变。结论：成功构建了含有FLT-1启动子基因序列的荧光素酶报告基因真核表达载体,为下-步分析该启动子活性及血管疾病的基因治疗奠定基础。     

人工miRNA沉默基因的研究

人工miRNA(amiRNA)是一种高效的基因沉默技术,其原理是以植物内源miRNA的前体为基本骨架,将其茎环结构中的miRNA/miRNA*序列替换为amiRNA/amiRNA*序列,使产生的amiRNA作用于目标靶基因,以实现对靶基因表达的抑制。以拟南芥中转录因子基因MYB28为例,介绍了amiRNA的设计基本原理和构建方法。在MYB28基因序列的3'端、5'端和中间部分分别设计了amiRNA,以拟南芥内源的miRNA 319a前体为骨架,以靶向于MYB28的amiRNA序列替代原有的miRNA 319a序列,在拟南芥中过量表达,获得的转基因植株中MYB28表达水平平均降低了86%。根据试验结果对人工miRNA沉默基因技术的特点及应用前景进行了讨论。     

酵母高效克隆表达T载体pYES2-T的构建及应用

为了在酵母中高通量、高效率地对外源基因进行克隆和表达,本研究以酵母表达载体pYES2为基础,构建高效克隆表达T载体。pYES2是酿酒酵母的一种高效表达载体,在其多克隆位点处设计插入XcmⅠ-Intron-XcmⅠ片段,同时将其载体中URA3基因中原有的XcmⅠ酶切位点进行定点突变,构建出pYES2-T酿酒酵母高效表达T载体。利用XcmⅠ酶切载体pYES2-T,使其产生两个突出的T末端,一方面可以通过PCR产物加A的方式直接进行TA克隆;另一方面可在半乳糖诱导启动子的调控下,对TA克隆后的外源基因在酵母中诱导表达。利用该系统高通量地对人工合成耐盐系列基因NLEAs进行筛选,研究结果表明,该系统可以在酿酒酵母中一步式完成片段克隆及耐盐基因的筛选。本研究构建的酵母表达T载体使用方便、效率高、成本低,应用前景广阔。     

人工microRNA抗乙型肝炎病毒效果初探

目的:设计靶向乙型肝炎病毒(HBV)基因保守区的人工microRNA(amiRNA),考察其对HBV基因表达的抑制作用。方法:比对HBV全基因组现有序列,选择保守区设计amiRNA,定向克隆到pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR载体,将amiRNA载体与HBV复制载体pHBV1.31共转染HepG2细胞,72 h后收取细胞上清,ELISA检测HBV表面抗原(HBsAg)及e抗原(HBeAg)的含量,荧光定量PCR检测HBV DNA含量。结果:amiRNA可显著抑制细胞上清HBsAg、HBeAg和HBV DNA的水平。结论:amiRNA作为防治HBV感染的潜在有效手段之一值得进一步深入研究。     

针对乙肝病毒的串联序列amiRNA表达载体的构建

目的为优化RNA干扰研究方法,构建了针对乙肝病毒的串联序列amiRNA(artificial microRNA)质粒表达载体。方法设计针对乙型肝炎病毒S区的靶干扰序列,构建单一序列amiRNA质粒表达载体;将其中干扰效率好的两个序列串联起来,构建串联序列amiRNA质粒表达载体。结果经酶切及测序鉴定,插入序列与靶序列一致,载体构建正确。结论成功构建了新型针对乙肝病毒的串联序列amiRNA质粒表达载体,为进一步体外及体内实验奠定了基础。     

食品级乳酸乳球菌pNZ8149-luc质粒的构建及表达

目的:构建能够稳定表达萤火虫荧光素酶报告基因(luc)的乳酸乳球菌(Lactococcus lactis, L.lactis)食品级表达系统,以便后续研究对目的基因进行示踪。方法:从pGL4.10质粒中PCR扩增萤火虫荧光素酶报告基因,测序,克隆至载体pNZ8149,构建pNZ8149-luc表达质粒;电击转化宿主乳酸乳球菌NZ3900,采用乳糖筛选法获得重组的乳酸乳球菌,Nisin诱导,采用微孔板发光检测仪检测荧光素酶的存在,Western Blot检测目标蛋白luc的表达。结果:PCR扩增的荧光素酶报告基因成功克隆至pNZ8149质粒,并电击转化宿主乳酸乳球菌NZ3900,得到乳酸乳球菌表达系统NZ3900/pNZ8149-luc。Nisin诱导后,检测到荧光素酶随诱导时间的延长活性逐渐增强,时间超过24 h之后荧光素酶活性逐渐下降。Western Blot检测到目标蛋白luc在胞内表达。结论:成功构建了p NZ8149-luc表达载体,并能够在乳酸乳球菌体内稳定表达。     

建立携带左旋天门冬酰胺酶的红细胞特异性表达系统

目的:建立基因修饰红细胞输送左旋天门冬酰胺酶(L-ASNase)的体系。方法:采用2A联体技术将L-ASNase和红色单体荧光蛋白基因分别置于红细胞特异性基因调控元件或非组织特异性短延长因子1α启动子控制下,构建慢病毒载体,分别包装成组织特异性重组慢病毒或非组织特异性重组慢病毒,测定病毒滴度,并分别感染靶细胞,用六氧苄基鸟嘌呤/卡莫司汀联合筛选以富集感染的小鼠红白血病阳性细胞;用六亚甲基二乙酰胺诱导富集的阳性细胞向红细胞分化,流式细胞术检测红色单体荧光蛋白报告基因的表达,荧光显微术观察基因表达产物在细胞中的定位,免疫印迹分析L-ASNase的表达水平,评估在红细胞分化过程中组织特异性重组慢病毒的表达优势。结果:经限制性内切酶谱分析和序列测定,构建的重组慢病毒载体结构正确;免疫荧光结果显示在非组织特异性慢病毒感染的HeLa细胞中,L-ASNase主要表达在细胞质,单体红色荧光蛋白主要表达在细胞核内,提示2A序列通过自裂解使同一读框中的2个基因获得了表达;用50μmol/L六氧苄基鸟嘌呤-50μmol/L卡莫司汀联合筛选,可有效富集感染的小鼠红白血病阳性细胞;经六亚甲基二乙酰胺诱导,第7 d的MEL细胞中表达的重组L-ASNase浓度达0.3 U/mg总蛋白。结论:红细胞特异性慢病毒载体可以在小鼠红白血病细胞向红细胞分化过程中使携带基因的表达逐步增高,优于非组织特异性慢病毒载体。本研究为基因修饰造血干细胞、并通过体外细胞分化的方法大量产生携带L-ASNase的红细胞治疗恶性血液病奠定了临床前的实验基础。     

结构域Ⅰ缺失的丙型肝炎病毒5＇NCR调控荧光素酶基因的表达

目的：分析丙型肝炎病毒（HCV）5＇端非编码区（NCR）的结构域Ⅰ序列在其翻译启动活性中的作用.方法：以质粒pCMVNCRluc为模板,PCR扩增分别得到缺失5＇端20nt和43nt的HCV 5＇NCR片段,并分别替换pCMVNCRluc中的完整HCV 5NCR,构建结构域Ⅰ缺失的HCV 5＇NCR调控萤火虫荧光素酶（luc）基因表达的真核表达质粒（pCNl-d1、pCNl-d2）.以脂质体方法转染人肝癌细胞株HepG2,用双荧光素酶报告基因检测系统检测荧光素酶相对于内参考的海肾荧光素酶表达活性,同时采用RT-PCR方法检测转染后细胞中萤火虫荧光素酶基因的相对表达水平.结果：酶切和测序结果表明,各重组质粒构建成功.各重组质粒转染细胞后luc mRNA的相对表达水平与pCMVNCRluc相比差异无显著性（P＞0.05）;pCNl-d1、pCNl-d2表达的荧光素酶活性与pCMVNCRluc差异无显著性（P＞0.05）.结论：HCV 5NCR的5＇端20nt和43nt序列缺失不影响它的翻译启动活性.     

β-萘黄酮能抑制荧光素酶活性

目的：研究β-萘黄酮对荧光索酶活性的影响。方法：利用人GCLC基因调控序列驱动的GCLC．PGL3．enhancer-Luciferase报道载体（PL45）转染人肺腺癌细胞A549,人肝癌细胞HepG2,人子宫颈癌细胞HeLa,人乳腺癌细胞MCF-7,人肝癌细胞Bel-7402,人支气管上皮细胞16HBE,β-萘黄酮刺激后,双荧光素酶报告基因检测系统分析其对GCLC基因表达的影响。westerblot检测β-NF刺激16HBE细胞后GCLC蛋白水平的变化。β-萘黄酮刺激转染了表达Luciferase的真核表达载体pRC／CMV2．1uc＋的A549和HepG2细胞后,双荧光素酶报告基因检测系统分析其对Luciferase基因表达的影响。PIA5转染A549和HepG2细胞,裂解细胞后用p-NF刺激,双荧光素酶报告基因检测系统分析其对Luciferase基因的影响。结果：在各种细胞中,转染PL45报道载体后,β-NF处理组荧光素酶相对活性值与DMSO对照组相比均明显下降（p〈0．01）。westerblot结果显示β-NF处理组GCLC蛋白的表达较DMsO对照蛆明显升高。在A549和HepG2细胞中,转染pRC／CMV2．1uc＋载体后,β-NF处理组荧光素酶相对活性值与DMSO对照组相比均明显下降（P〈0．01）。PIA5转染A549和HepG2细胞,裂解细胞后用β-NF刺激,β-NF处理组荧光素酶相对活性值与DMSO对照组相比均明显下降（P〈0．01）。结论：β-萘黄酮直接抑制了荧光素酶的活性     

人端粒酶催化亚基基因启动子调控的肿瘤细胞特异表达载体

为获得端粒酶阳性肿瘤细胞特异表达载体用于癌症的基因治疗 ,克隆并构建了人端粒酶催化亚基 (hTERT)基因启动子调控的萤光素酶报告载体 .用脂质体转染法将其分别转染肿瘤细胞和正常细胞 ,检测其在肿瘤细胞和正常细胞中的转录活性 .hTERT启动子在所检测的 4种端粒酶阳性的肿瘤细胞中具有明显的转录活性 ,平均为阳性对照的 4 4 3% ;而在端粒酶阴性的正常人胚肺成纤维细胞中则无明显的转录活性 .提示hTRET启动子的转录活性在端粒酶阳性的肿瘤细胞中明显上调 ,由hTERT启动子构建的载体可能是一种新颖和有前景的肿瘤细胞特异性表达的基因治疗载体     

p21RNAi的pSUPER载体的构建及功能鉴定

目的：构建抑制p21基因表达的pSUPERRNAi载体（pSUPER—p21）并鉴定其功能。方法：化学合成一对编码短发夹RNA序列的、靶向大鼠p21基因的寡核苷酸链,各60个碱基,退火,克隆到经BglⅡ、HindⅢ酶切的pSUPER质粒上,构建重组RNAi质粒（pSUPER-p21）。通过双酶切鉴定及测序分析验证构建效果。将正确构建的质粒转染大鼠原代培养皮质神经元,western blotting检测经红藻氨酸处理的神经元中p21蛋白表达。结果：pSUPER-p21载体经双酶切鉴定及测序分析,结果表明60个碱基成功插入到预计位点,并且序列完全一致。Western blotting结果证实pSUPER-p21载体可特异性抑制红藻氨酸诱导的原代培养皮质神经元中p21蛋白表达的上调。结论：靶向p21的pSUPERRNAi载体构建成功,该载体可特异性抑制p21基因表达。     

FXYD6 shRNA表达载体的构建及其在体外对胰腺癌细胞增殖的影响

目的：构建FXYD6短发夹RNA（shRNA）表达载体,体外评价其对胰腺癌细胞sw1990的增殖与FXYD6蛋白表达的抑制效果。方法：基于microRNA mir-30天然结构,设计表达4对FXYD6 shRNA的互补DNA序列,克隆入pCGM30质粒载体,连接产物转化感受态大肠杆菌DH5α,PCR法筛选阳性克隆,经酶切和基因测序鉴定;利用LipofectAMINE2000将pCGM30-FXYD6shRNA转染至胰腺癌细胞sw1990,MTT法检测转染后胰腺癌细胞增殖的变化,Western blot检测胰腺癌细胞中FXYD6蛋白表达水平的变化。结果：设计合成了4对表达FXYD6 shRNA的互补DNA序列,构建了4个表达FXYD6 shRNA的重组质粒;基因测序证实shRNA编码序列与设计的片段完全一致,酶切鉴定证实载体构建成功;体外实验表明,转染胰腺癌细胞sw1990的增殖能力和FXYD6蛋白表达水平明显降低（P〈0．05）,FXYD6蛋白表达水平随时间延长逐渐降低（P〈O．01）,但细胞增殖能力无明显变化（P〉0．05）。结论：构建了4个表达FXYD6 shRNA的重组质粒载体,可有效抑制FXYD6的表达;抑制胰腺癌细胞sw1990中FXYD6的表达可以抑制细胞的增殖,提示FXYD6可能是一个具有潜在临床应用价值的基因治疗靶点。     

RNA干扰抑制Snail表达对于胃癌细胞上皮间充质转化以及体外侵袭的影响

目的用RNA干扰(RNAinterference,RNAi)技术抑制转录因子Snail表达,观察其对人胃腺癌SGC-7901细胞上皮-间充质转化表型和体外侵袭能力的影响。方法构建能表达针对Snail的小干扰RNA(Small interferingRNA,si RNA)的RNA干扰载体(Snail si RNAvector)和表达不针对任何已知mRNA的si RNA的阴性对照RNA干扰载体(control si RNAvector),分别转染SGC-7901细胞,筛选得到Snail表达受抑制的SGC-7901-siSnail细胞和Snail表达未受影响的SGC-7901-siControl细胞。分别采用RT-PCR和Western blot技术检测非转染组、SGC-7901-siSnail、SGC-7901-siControl三组细胞Snail、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和E-cadherin表达,用Boyden chamber模型检测细胞侵袭能力。结果 SGC-7901-siSnail组与SGC-7901-nontransfection组相比,Snail和α-SMA表达显著减弱(P0.01),E-cadherin表达显著增强(P0.01),Boyden chamber穿膜细胞数显著减少(P0.01);SGC-7901-siControl组中Snail、α-SMA、E-cadherin表达、Boyden chamber穿膜细胞数分别和SGC-7901-nontransfection组比较无显著差异(P0.05)。结论通过RNA干扰阻滞Snail表达能有效地抑制SGC-7901细胞上皮-间充质转化及体外侵袭能力。Snail可能在胃腺癌上皮-间充质转化及侵袭过程中扮演重要角色,抑制Snail表达可能成胃腺癌治疗的可行策略。     

A novel approach for the construction of plant amiRNA expression vectors

Artificial microRNA (amiRNA) technology has been applied in Arabidopsis thaliana and other plants to efficiently silence target genes of interest. Here we described a novel approach to construct plant amiRNA expression vectors with seamless enzyme-free cloning (SEFC) and mating-assisted genetically integrated cloning (MAGIC). Two pairs of primers were designed when the loop of amiRNA precursor was longer than 60 bp while three oligonucleotides were used to amplify the linearized vector containing the amiRNA precursor whose loop was smaller than 60 bp. The PCR products were transformed into Escherichia coli to generate the donor plasmid containing the amiRNA expression cassette through homologous recombination in vivo. The amiRNA expression cassette was then transferred to the recipient plasmid via MAGIC and an amiRNA expression plasmid was created. More than 200 amiRNA expression vectors were generated with this approach, three of which have been transformed into A. thaliana and successfully silence the target genes. Given its low-cost and simplicity, this novel approach of plant amiRNA expression vectors construction will benefit the study of individual gene function and establishment of plant amiRNA libraries.     

人工 microRNA 技术研究进展

RNA干扰（RNAi）是由双链RNA触发的在mRNA水平进行的特异靶序列的基因沉默现象,广泛存在于动物、植物和病毒中,主要包括小干扰RNA（siRNA）及微小RNA（miRNA）两种作用途径。人工miRNA（amiRNA）是将天然miRNA的成熟序列替换成人工设计的靶向其他感兴趣基因的反义序列,通过天然miRNA的生成和作用途径达到RNAi的效果,具有干扰效果明显、作用迅速、毒性低等优点,拥有广阔的应用前景。我们对基于amiRNA的基因沉默技术进行了较为系统的介绍和总结,梳理了该技术的优缺点和适用范围,并展望了其进一步发展的方向和应用前景。     

绿色荧光蛋白标记的TGF-β1shRNA真核表达载体的构建及鉴定

目的：构建小鼠转化生长因子β1（TGF-β1）短发夹RNA（shRNA）真核表达载体,探讨TGF-β1在血管发育中的调控作用。方法：根据GenBank小鼠TGF-β1mRNA序列,设计合成三对短链寡核苷酸,退火后形成双链DNA并克隆至入门载体DEN_mH1c。将插入目的基因片段的入门载体与带有绿色荧光蛋白（GFP）标签的shRNA真核表达载体pDS_hpEy进行LR重组反应,完成三个TGF-β1shRNA表达载体的构建,分别命名为pDS_Ta,pDS_Tb和pDS_Tc。经测序确认后,转染小鼠成纤维细胞（NIH／3T3）,筛选稳定表达的细胞克隆,以RT-PCR及Westem blot方法检测转染后TGF-β1mRNA和蛋白表达。结果：RT-PCR和Western blot显示pDS_Tc可明显下调NIH／313细胞TGF-β1的mRNA和蛋白表达,mRNA下调约为70％,蛋白表达减少约65％。结论：GFP标签TGF-β1shRNA表达载体能够阻断TGF-β1基因表达,可作为研究TGF-β1调控血管发育机制的一个工具,为阐明TGF-β1信号传导通路奠定基础。