黑曲霉N25植酸酶phyA基因在巴斯德毕赤酵母中高效表达的研究

从黑曲霉N25(A.niger China strain)中提取出染色体DNA,根据已经测定出的植酸酶phyA基因全序列设计了一对引物,采用高保真度的聚合酶Advangage-HF扩增到了去除信号肽和内含子后约1.4kb片段,对该片段进行了克隆及序列测定。将该序列与植酸酶phyA基因全序列进行了比较。以此片段构建成功了pPIC9K-phyA载体(命名为pPNP-1),并转化毕赤巴斯德酵母。经G418抗性筛选、酶活性测定、Southern印迹和Western印迹,获得了高效表达的转化子PP-NP-1(23869.4u/ml)、PP-NP-2(20533.0u/ml)、PP-NP-3(35646.7u/ml),其酶活性分别是出发菌株的酶活(513.4u/ml)的46.46倍、39.99倍和69.46倍,且转化子具有很好的遗传稳定性。     

黑曲霉N25植酸酶phyA基因在巴斯德毕赫酵母中高效表达的研究

从黑曲霉N25（A.niger China strain)中提取出染色体DNA,根据已经测定出的植酸酶phyA基因全序列设计了一对引物,采用高保真度的聚合酶Advangage-HF扩增到了去除信号肽和内含子后约1．4kb片段,对该片段进行了克隆及序列测定。将该序列与植酸酶phyA基因全序列进行了比较。以此片段构建成功了pPIC9K-phyA载体（命名为pPNP-1),并转化毕赤巴斯德酵母,经G418抗性筛选,酶活性测定,Southern 印迹和Western印迹,获得了高效表达的转化子PP－NP－1（23869．4u/ml),PP-NP-2(20533.0u/ml),PP-NP-3(35646.7u/ml),其酶活性分别是出发菌株的酶活（513.4u/ml)的46．46倍,39．99倍和69．46倍,且转化子具有很好的遗传稳定性。     

黑曲霉N14植酸酶基因在巴斯德毕赤酵母中的高效表达

从黑曲霉N14基因组DNA中扩增出植酸酶phyA基因表达片段 ,并将其克隆到pMD18-T载体中。以此片段构建了pPIC9K-phyA重组表达载体 ,目的片段以正确的阅读框架插入到pPIC9K的多克隆位点EcoRⅠ和NotⅠ之间。重组表达载体经XbaⅠ线性化处理 ,电击转化毕赤酵母 ,经G418抗性筛选、酶活性测定、PCR鉴定和SDS-PAGE分析 ,获得了两株产酶活性分别为 14 39583u mL发酵液 (PP N1422 )和14 89083u/mL发酵液 (PP-N1444)的高产工程菌 ,其酶活性分别是出发菌株酶活性 (422u/mL)的 34113倍和 35286倍 ,重组酵母具有很好的遗传稳定性。重组植酸酶在pH值 2.5～3.0和 5.0～5.5时酶活性最高 ,且在pH4.5～6.5之间均有相当高的酶活性 ,最适作用温度为55℃。     

植酸酶phyAm基因结构延伸突变改善酶的热稳定性

将来源于黑曲霉N25的植酸酶基因phyA^m重组于大肠杆菌表达载体pET30b(+),以重组表达载体pET30b-F-phyA^m为模板经PCR扩增获得结构延伸突变植酸酶基因phyA^e（在植酸酶基因C端增加了来源于pET-30b-F-phyA^m载体上13氨基酸残基）。含突变基因的重组表达载体pPIC9k-phyA^e在GS115酵母中表达。纯化的突变酶PP-NP-e与野生型酶PP-NP-m8相比：PP-NPAe的最适反应温度上升了3℃,75℃处理10min,热稳定性提高21%,比活力略有提高。最适反应pH为5.6,有效pH范围pH4.6到pH6.6。比未突变酶扩大了0.4单位。     

来源于Escherichia coli的高比活植酸酶基因的高效表达

高效表达高比活植酸酶是进一步提高植酸酶发酵效价、降低植酸酶生产成本的一个有效途径。对源于Escherichia coli的高比活植酸酶基因appA,按照毕赤酵母（Pichia pastoris）密码子的偏爱进行了密码子优化改造。该改造后的基因appA-m按正确的阅读框架融合到毕赤酵母表达载体pPIC9上的α-因子信号肽编码序列3′端,通过电击转化得到重组转化子。对重组毕赤酵母的Southern blotting分析证实植酸酶基因已整合到酵母基因组中,并确定了整合基因的拷贝数。Northern blotting分析证实植酸酶基因得到了正常转录。SDS-PAGE分析和表达产物的研究表明,植酸酶得到了高效分泌表达,在5L发酵罐中植酸酶蛋白表达量达到2.5mg/mL发酵液, 酶活性(发酵效价)达到7.5×10⁶IU/mL发酵液以上, 大大高于目前报道的各种植酸酶基因工程菌株的发酵效价。     

大肠杆菌Na+/H+反向运输体A基因的克隆及序列分析*

为研究细菌的耐盐机理 ,根据细菌中存在的Na⁺/H⁺反向运输体 (nhaA)的基因序列 ,采用PCR扩增的方法 ,从大肠杆菌 (Escherichiacoli)DH5α中克隆获得了11kb的DNA片段 ,经过核酸序列分析 ,发现基因片段包含了nhaA基因完整的读码框架。采用序列同源性分析方法 ,结果显示nhaA基因在多种细菌中均存在 ,表明nhaA基因是细菌中普遍存在的一种能够反向运输Na^{+相似文献}   

来源于Pyrococcus furiosus的耐高温α-淀粉酶基因在衣藻叶绿体中的表达

来源于Pyrococcus furiosus的耐高温α-淀粉酶是一种重要的酒精工业用酶,在植物中表达耐高温α-淀粉酶可以大大降低用植物秸秆生产酒精的成本。选择衣藻叶绿体基因组同源片段clpP-trnL-petB-chlL-rpl23-rpl2和壮观霉素抗性基因,构建了来源于Pyrococcus furiosus的耐高温α-淀粉酶基因的衣藻叶绿体表达载体P64a。通过基因枪将其导入衣藻叶绿体中,经壮观霉素抗性(100mg/L)筛选,获得了9 个抗性衣藻转化子。转化子经过抗性继代筛选后,经PCR、Southern blot 检测分析及暗培养,证实耐高温α-淀粉酶基因已整合到衣藻叶绿体基因组中并得到表达。酶活性检测表明,转基因衣藻表达产物具有耐高温α-淀粉酶活性,每克鲜重衣藻最高达77.5u。 实验结果证明在植物叶绿体中表达工业酶制剂是可行的。     

牙龈卟啉菌牙龈蛋白酶K的基因克隆和序列分析

利用PCR方法 ,分别扩增牙龈卟啉菌牙龈蛋白酶K (KGP)的催化结构域 (KGPcd)和凝集素结构域 (KGP-hag)的基因片段 ,将基因片段插入pGEM-T easyVector,通过限制性酶切和核苷酸序列分析鉴定, KGPcd和KGP hag的序列与国外文献报道一致。克隆到牙龈卟啉菌KGP的KGPcd和KGP hag基因 ,为体外表达其活性蛋白奠定了基础。     

口蹄疫病毒China/99基因组RNA序列测定及比较分析

测定了1999年我国口蹄疫流行毒株(China/99, Tibet)基因组全序列, China/99基因组RNA全长8173个核苷酸(nt), 开放阅读框含盖6999 nt, 编码2332个氨基酸的聚合蛋白. 5′和3′非翻译区(UTR)分别长1081和93 nt. China/99与12株参考株基因组序列比较发现: China/99与英国2001年流行毒、海南和西藏1999年流行毒1d基因的序列同源性高达97%以上, 均属泛亚毒株; 在牛和猪FMDV的功能未知区、p2和p3区存在较为显著的核苷酸序列差异, 3a基因最为显著; l, 1a, 1b, 2a, 2c, 3b和3d基因没有核苷酸缺失或插入现象, 属于病毒必需基因; 口蹄疫病毒S片段、功能未知区和内部核糖体进入位点(IRES)二级结构均可分为3种类型. S片段和3′UTR折叠成一个三叶草类似结构.     

增加植酸酶基因appA-m的拷贝提高其在巴斯德毕赤酵母的表达量

为了进一步提高植酸酶的发酵效价,降低植酸酶生产成本,对毕赤酵母表达载体pGAPZα-A进行了改造。将表达载体pPIC9的AOX1启动子序列引入pGAPZα-A,使之成为甲醇可诱导型表达载体pAOXZα, 插入植酸酶基因appA-m后得到重组载体pAOXZα-appA-m 。以染色体上带有一个拷贝的appA-m基因、发酵效价可达到7.5×10⁶IU/mL发酵液的重组酵母菌株74#为受体菌进行转化,在该重组菌株的染色体上的另一位点整合含有植酸酶基因的表达盒,经筛选到高表达植酸酶的重组子。通过PCR进行验证,植酸酶基因被整合到重组酵母的染色体上,且受体菌中原有的植酸酶基因结构未改变。重组菌在5L发酵罐经甲醇诱导120h植酸酶蛋白表达量达到4mg/mL发酵液, 酶活性(发酵效价)达到1.2×10⁷IU/mL发酵液以上, 较含单拷贝植酸酶基因的受体菌株表达量有较大程度提高。PCR检测及表达量分析证明改良的菌株具有很好的遗传稳定性和表达稳定性。     

近平滑假丝酵母(R)-专一性羰基还原酶基因的克隆与表达*

根据纯化得到的?-专一性羰基还原酶(rCR)蛋白质测序结果推导出的核苷酸序列设计引物,以筛选得到的近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)CCTCC M203011基因组为模板,通过PCR扩增目的片段,克隆后测序。核苷酸序列测定结果表明rcr基因全长1011bp,共编码336个氨基酸,分子量为35·9kD。将序列递交NCBI比对,与醇脱氢酶超家族成员序列同源性达99%。在大肠杆菌(Escherichia coli)JM109中表达rcr基因,重组     

来源于Bacillus subtilis的中性植酸酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

通过PCR的方法从Bacillus subtilis基因组中克隆了中性植酸酶基因nphy,DNA全序列分析表明其结构基因全长1152个核苷酸(编码383个氨基酸),5′端有一编码26个氨基酸的信号肽序列。去除信号肽编码序列的nphy克隆到大肠杆菌IPTG诱导表达载体pTYB40上,在大肠杆菌中得到了高效表达,表达量达到大肠杆菌可溶性蛋白的40%以上,表达产物具有生物学活性,证实了克隆到的中性植酸酶的编码基因有正常的生物学功能。     

植酸酶基因在家蚕－杆状病毒表达系统中的表达及其酶学特性

将从黑曲霉菌株Aspergillus niger 963克隆并经改造后的植酸酶基因在昆虫－杆状病毒表达系统中表达,SDSPAGE电泳检测蚕体和蛹的表达量分别达到1.43 g/L血淋巴液和1.90 g/L血淋巴液。酶活性测定结果表明,在蚕体和蛹的表达活性分别为4.67×10⁸u/L血淋巴液和5.99×10⁸u/L血淋巴液。该酶活性的最适温度范围为50～60 ℃,最适pH值为5.5～5.0和2.5。研究表明杆状病毒系统表达的植酸酶具有耐酸性和抗高温的特性,可以用于生产饲用植酸酶。     

人工合成的黑曲霉NRRL3135菌株植酸酶基因在毕赤酵母系统中的高效表达

本文以黑曲霉(Aspergillus niger)NRRL3135菌株植酸酶基因为对象,通过基因人工合成的方法去除了该基因的内含子与信号肽编码序列,换用在毕赤酵母(Pichia pastoris)中使用频率较高的密码子以优化其表达。该人工合成植酸酶基因(PhyA-as)以N端融合的方式正确插入到毕赤酵母表达载体pPICZαA。通过电击将重组表达载体整合入酵母染色体DNA中得到重组转化子。SDSPAGE结果与表达产物酶学性质研究表明植酸酶得到分泌表达,且与天然产物性质基本一致。筛选得若干株高产基因工程菌,其中SPANⅢ菌株达到了在摇床培养条件下,每毫升发酵液产生165000u植酸酶的水平,基本满足工业化生产的要求。     

携多拷贝glaA的重组黑曲霉过量合成糖化酶的研究

以工业生产菌株黑曲霉CICIM F0410基因组DNA为模板,扩增出糖化酶glaA基因,测序并进行表达研究。GlaA基因的核苷酸序列长为2167 bp,包含4个内含子。氨基酸序列比对表明此黑曲霉糖化酶与其他曲霉属来源的糖化酶有很高的同源性。将glaA基因克隆到pBC-Hygro载体中,构建重组质粒pBC-Hygro-glaA并转化A. nigerF0410。携多拷贝glaA的转化子用150μg/mL潮霉素抗性筛选并通过荧光实时定量PCR鉴定。结果表明,在染色体整合2～3倍糖化酶基因对糖化酶的过量合成是适宜的,有助于提高糖化酶活力。对转化子进行摇瓶发酵研究,发酵终止时转化子GB0506的糖化酶活力比出发菌株F0410提高了17.5%。因此,增加黑曲霉染色体糖化酶基因的拷贝数可以显著提高糖化酶活力。     

苏云金芽胞杆菌杀线虫伴胞晶体蛋白基因cry6Aa的克隆与表达

通过对晶体蛋白N-末端氨基酸测序,设计简并探针,从对根结线虫高毒力苏云金芽胞杆菌YBT-1518菌株中克隆到1个含有杀线虫晶体蛋白基因的片段。序列测定表明该序列含有两个ORF(orf1和orf2),其中orf1与基因cry6Aa1同源性为98%,已在GenBank上登录(Acc.NO.AF499736),并被命名为cry6Aa2。将克隆的该片段克隆到穿梭载体pHT304上,并转化苏云金芽胞杆菌无晶体突变株BMB171,重组菌株可形成米粒状伴胞晶体。生物测定表明,表达的毒素蛋白对北方根结线虫的LC₅₀为9.47μg/mL,毒力与出发菌株(10.74μg/mL)相当。     

利用degQ基因提高枯草芽孢杆菌纤溶酶表达*

从枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)中通过PCR扩增得到degQ基因,将其克隆到含有枯草杆菌纤溶酶基因的蔗糖诱导表达载体pUBS中,并转化至B.subtillisDB403受体菌,得到基因工程菌DB403(pUBSD)。通过发酵表达证实degQ基因能增强枯草杆菌纤溶酶的表达,酶活提高了2.2倍。同时还对不同种类的糖、不同浓度蔗糖、不同诱导时间等发酵条件进行优化和比较研究。     

利用枯草芽孢杆菌ytkA和ywoF基因启动子与信号肽重组分泌表达mpd基因

用大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭载体pNW33N和去除了信号肽编码序列的成熟mpd基因构建了穿梭启动子探针pNW33N-mpd。用该探针从质粒pMPDP3和pMPDP29上克隆来自于枯草芽孢杆菌ytkA和ywoF基因上游的启动子功能片段,构建了穿梭表达载体pNYTM和pNYWM。将表达载体pNYTM和pNYWM转入枯草芽孢杆菌1A751获得表达菌株1A751(pNYTM)和1A751(pNYTM),mpd基因在ytkA和ywoF基因的启动子和信号肽的带动下实现了分泌表达且具有天然活性,结果表明ytkA基因的启动子强度强于ywoF基因的启动子。利用ytkA基因的强启动子和nprB基因的分泌型信号肽编码序列构建了新的穿梭分泌表达载体pYNMK,并使mpd基因在枯草芽孢杆菌WB800中得到了更高水平的分泌表达,表达菌株WB800(pYNMK)在培养到第84 h时甲基对硫磷水解酶酶活达到最高值为10.40 u/mL,是出发菌株邻单胞菌M6表达量的10.8倍,重组表达产物有91.4%分泌在培养基中。     

黄孢原毛平革菌基因启动子的分离与鉴定

利用启动子探针型载体pSUPV8直接在大肠杆菌(Escherichia coli)中分离黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)基因启动子片段,获得6个潮霉素抗性(Hyg-r)重组子。对重组子CH2、CH6进行序列分析,结果发现它们都存在真核生物基因启动子的保守序列;用原生质体转化法将其转化黄孢原毛平革菌,仅pCH6获得了潮霉素抗性转化子;PCR和斑点杂交分析表明,pCH6已成功导入黄孢原毛平革菌,并启动潮霉素抗性基因的表达。     

降解2,4-二氯酚微生物的分离及其2,4-二氯酚羟化酶基因的克隆和表达

从土壤中分离到一株降解2,4-二氯酚能力较强的细菌菌株GT241-1,经鉴定该菌株属于假单胞菌属。菌株GT241-1在最适条件下能在48h内将90mg/L的2,4-DCP降解91%,能利用2,4-二氯酚、2,4-二氯苯氧乙酸、苯甲酸和儿茶酚为唯一碳源生长。采用Southern杂交对2,4-二氯酚羟化酶基因（dcpA）定位后构建基因组文库,再用斑点杂交筛选目的转化子,克隆了该菌株的dcpA。序列测定得知含dcpA的亚克隆片段全长2389bp,其中dcpA基因编码区1797bp。核苷酸和氨基酸序列分析表明,dcpA与已在GenBank登记的相关基因有一定的差异。dcpA基因能够在大肠杆菌转化子中成功地表达有生物活性的酶。