丙型肝炎病毒结构蛋白E1在昆虫细胞中的表达及定位

本文在大肠杆菌中表达了与GST融合无跨膜区的丙型肝炎病毒(Hepatitis C Virus,HCV)E1蛋白,并通过免疫兔制备了兔抗E1的抗血清.然后利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统构建了含有HCV结构蛋白E1基因的重组杆状病毒vAcHCVE1.通过Western blot分析,E1蛋白在Sf9细胞中表达分子量大小为30kDa大于预测的20kDa,表明存在翻译后修饰如糖基化等.通过Confocal显微镜观察当感染48h后E1蛋白定位在细胞质和细胞膜上.     

丙型肝炎病毒包膜蛋白E1的分泌表达及性质

为了实现HCV包膜蛋白E1在哺乳动物细胞中的分泌表达,选用分泌表达载体pSecTagB,构建了3种E1羧端不同程度缩短的融合表达质粒,并在E1的上游融合乙型肝炎病毒前表面抗原S1中含肝细胞结合位点的免疫表位preS1(21-47）序列作为标识。在HeLa细胞中进行了暂时表达,并对产物的性质进行了鉴定。去除羧端疏水区有利于E1融合蛋白的分泌,其中以S1E1t325分泌最佳。表达的融合蛋白都能被preS1单抗及HCVE1多抗识别,是具有双重抗原性的糖蛋白,其糖链类型为高甘露糖型。建立了稳定表达S1E1t310、S1E1t325、S1E1t340的CHO细胞株,选择其中CHO／pSecS1E1t325对表达的分泌蛋白作了进一步研究。利用亲和纯化方法可由细胞培养液中富集和纯化分泌表达的HCV E1,为进一步开展E1性质的研究创造了条件。     

HCV结构蛋白在昆虫细胞中的表达及病毒样颗粒的组装

本文利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统构建了含有丙型肝炎病毒(Hepatitis C Virus,HCV)结构蛋白编码基因的重组杆状病毒vAcHCVspl,并获得了HCV结构蛋白在昆虫细胞Sf21中的表达。HCV mRNA转录和蛋白质表达时相分析表明,感染后16h HCV结构蛋白编码基因开始转录,72h达最高峰;蛋白质表达则是在感染后48h开始,72h达到高峰。电镜观察表明vAcHCVspl感染的Sf21细胞96h时在细胞质中可见很多空泡,空泡中可见50nm的球形颗粒,为HCV结构蛋白组装的病毒样颗粒。     

中国株丙型肝炎病毒（HCV）结构区蛋白在昆虫细胞中的表达及加工

利用杆状病毒表达系统在昆虫细胞中表达了完整的中国河北株丙丙型肝炎病毒结构蛋白。免疫印迹实验结果显示,表达产物中有一系列分子量不同、可以与ＨＣＶ抗体阳性病人血清反应的蛋白,表明结构蛋白被宿主细胞蛋白酶切割与加工,相应分别为２０ｋＤ的核心蛋白、３２ｋＤ糖基化的Ｅ１蛋白４０ｋＤ的未糖化的Ｅ２蛋白和７０ｋＤ糖基化的Ｅ２蛋白,另有８０ｋＤ及１００ｋＤ的两组前体蛋白。利用表达产物检测慢性ＨＣＶ感染者血清,发现     

HCV结构蛋白在昆虫细胞中的表达及病毒样颗粒的组装

本文利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统构建了含有丙型肝炎病毒(Hepatitis C Virus,HCV)结构蛋白编码基因的重组杆状病毒vAcHCVsp1,并获得了HCV结构蛋白在昆虫细胞Sf21中的表达.HCV mRNA转录和蛋白质表达时相分析表明,感染后16 h HCV结构蛋白编码基因开始转录,72 h达最高峰;蛋白质表达则是在感染后48h开始,72 h达到高峰.电镜观察表明vAcHCVsp1感染的Sf21细胞96 h时在细胞质中可见很多空泡,空泡中可见50nm的球形颗粒,为HCV结构蛋白组装的病毒样颗粒.     

丙型肝炎病毒核心蛋白在昆虫细胞中表达、加工和细胞定位研究

以杆状病毒-昆虫细胞表达系统Bac-to-Bac为模型,就目前存在较多争论的HCV核心蛋白的加工和细胞定位问题进行探讨.根据核心蛋白的亲水性分析结果,设计了三种长度的基因片段(C173、C191和C215),经过PCR扩增、重组转移载体构建、细菌内转座和昆虫细胞转染,获得三种重组病毒(rvBACC173、rvBACC191和rvBACC215)用于表达分析.SDS-PAGE电泳和免疫印迹试验表明,昆虫细胞能够识别核心蛋白第191和192位氨基酸之间的切点并低效率切割;但不能够识别173～191位之间的切点.间接免疫荧光试验表明,截断型核心蛋白C173定位于细胞核内,而C191和C215则停留在细胞浆中.rvBACC173感染的细胞在核内出现单一的"类晶体样结构",电子显微镜分析证实,这种结构是截断型核心蛋白大量转运并沉积在细胞核内形成的蛋白聚合体.试验结果还表明,第173至191之间的疏水性序列负性调节蛋白的表达,并且影响蛋白在细胞内的分布.间接ELISA实验证实,部分纯化的核心蛋白可用作诊断试剂检测人血清中的特异性抗体.     

钙结合蛋白CIB1在293T细胞中的表达及亚细胞定位研究

分析和比对钙结合蛋白CIB1在人类、大鼠、小鼠中氨基酸序列差异,并研究CIB1蛋白在293T细胞中的表达及亚细胞定位情况。通过Western Blot分析发现293T细胞本身几乎检测不到CIB1的表达。进一步采用CIB1外源性质粒转染,通过免疫荧光分析实验,在激光共聚焦显微镜下观察转染后不同时间293T细胞中CIB1的表达情况及亚细胞定位变化。实验结果表明,随着转染时间的增加,CIB1在293T细胞中的表达有逐渐增强的趋势,并且发生从细胞核向细胞质的转位现象。该实验结果对了解CIB1亚细胞定位变化及功能研究具有重要参考价值。     

在哺乳动物细胞中表达丙型肝炎病毒结构蛋白的研究

应用带有T7启动子的痘苗载体构建了含丙型肝炎病毒 (HCV)结构蛋白基因C ,E1和E2 /NS1的重组痘苗表达克隆 .在重组痘苗病毒vTT7所提供的T7RNA聚合酶存在下 ,在哺乳动物细胞中进行了暂时表达 .以HCV患者血清作Westernblot鉴定 ,分别检测到了核心蛋白C、包膜蛋白E1和E2的成熟表达 ,并且发现表达产物与不同来源的HCV患者血清及克隆本病毒患者不同时期的抗血清反应不同 .比较了C- E1 -E2在 6种不同的哺乳动物细胞中的表达情况 ,其中Vero和HeLa细胞对于这些蛋白的表达最为理想 .为了对表达产物开展进一步的研究 ,已成功地构建了能稳定表达C ,E1和E2的重组痘苗病毒株 .     

庚型肝炎病毒NS3蛋白在昆虫细胞中的表达

庚型肝炎病毒(HGV)/GB病毒C(GBV-C)疑似引起人类庚型肝炎[1～3].HGV和GBV-C为同一病毒的两个不同分离株,本文将其称为GBV-C/HGV.GBV-C/HGV属黄病毒科,为单股正链RNA病毒,全长约9.4kb.基因组中仅含有一个单一开放阅读框,编码E1、E2结构蛋白和NS2、NS3、NS4及NS5非结构蛋白.GBV-C/HGV的NS3蛋白具备丝氨酸蛋白酶活性和解旋酶活性[3],在NS3蛋白中还存在线性抗原表位[4],因此,NS3蛋白是GBV-C/HGV的重要功能蛋白.     

庚型肝炎病毒包膜糖蛋白E2基因在昆虫细胞中的表达

用ＰＣＲ扩增出ＨＧＶＥ２全基因,克隆进杆状病毒表达载体ｐＦＡＳＴＢＡＣＨＴａ中,构建成重组转座载体ｐＦＡＳＴＢＡＣＥ２,转化ＤＨ１０ＢＡＣ大肠杆菌感受态细胞,筛选阳性菌落,抽提大分子质粒ＤＮＡ,获得含ＨＧＶＥ２基因的重组杆状病毒穿梭载体,转染昆虫草地夜蛾Ｓｆ９细胞,出现细胞病变后,收集含有重组病毒颗粒的培养上清,重新感染草地夜蛾Ｓｆ９单层细胞及甜菜夜蛾幼虫,分别收集Ｓｆ９细胞和甜菜夜蛾幼虫体内的血淋巴细胞,进行１２％ＳＤＳ聚丙烯酰胺凝胶电泳,可见表达的融合蛋白带,经亲和层析进行蛋白纯化,用ＥＬＩＳＡ方法检测各类血清标本,初步研究ＨＧＶＥ２糖蛋白的抗原性     

丙型肝炎病毒C+E1区基因在原核细胞中的克隆与表达

将丙型肝炎病毒Ｃ＋Ｅ１区基因插入到原核高效表达载体ｐＢＶ２２１质粒中,构建了质粒ｐＢＶ２２１ＨＣＶ／Ｃ＋Ｅ１作为表达载体,然后,将含有该质粒的宿主大肠杆菌进行升温诱导表达ＨＣＶ／Ｃ＋Ｅ１区基因,并对表达产物进行了生物活性的检测。结果表明,插入到表达载体ｐＢＶ２２１中的ＨＣＶ／Ｃ＋Ｅ１基因片段能够得到有效的表达,表达产物主要为非融合蛋白形式存在于细胞中,同时这种Ｃ区和Ｅ１区连接共表达的产物保持了良好的抗原活性     

HCV 1a／1b型嵌合体能在HepG2细胞内复制与表达

采用HCV 1a／1b嵌合体cDNA构建表达质粒转染HepG2细胞,以免疫组化和Westem blotting检测HCV蛋白表达,RT-PCR检测HCV正、负链RNA,研究丙型肝炎病毒(HCV) 1a和1b型嵌合体全长cDNA在HepG2细胞中的复制和表达。结果证明,转染细胞中检测到分子量约70kDa的HCV NS3蛋白,转染细胞连续传20代,仍能检测到HCV正、负链RNA。表明该HCV嵌合体可以在细胞中复制和表达,HCV1b型的RNA依赖的RNA聚合酶(RdRp)可以起始含1a型非编码区的病毒复制。HCV5′端非翻译区第11、12、13、34和35位核苷酸改变可不影响其与核糖体结合。3′非翻译区9400,9403和9407位核苷酸改变,9435位缺失“A”,9409,9410位及9495,9496,9497位分别插入“TT”和“AAT”可不影响RdRp的生物活性。本研究对阐明HCV复制和翻译机制有重要意义。     

丙型肝炎病毒ns2基因的克隆及其表达

以p90-HCV为模板,通过PCR分别得到全长和截短(2881-3078bp)ns2基因。将截短ns2基因克隆到pET32a原核表达载体,并在大肠杆菌中获得了Trx-His-NS2C融合蛋白的可溶性高表达。通过His树脂纯化得到融合蛋白,免疫家兔获得高效价高特异性的抗体。同时构建了含有全长ns2基因的重组腺病毒,利用该重组病毒感染HepG2和293细胞成功的表达23.2kDa的NS2蛋白。本文的研究为进一步开展NS2蛋白的结构与功能研究奠定了良好的基础。     

HCV核心蛋白诱导Cos—7细胞凋亡

将丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白(Core)基因的全长序列插入到真核表达载体pCDNA3 CMV启动子下游,构建真核表达载体pCDNA3—Core,用脂质体LipoVec^TM转染Cos—7细胞系进行瞬时表达;DNA转染24h后用免疫斑点试验检测在细胞中表达的Core蛋白;转染72h后用Hoechst染色和DNA Ladder检测Cos—7细胞的凋亡情况;荧光染色观察到了细胞凋亡核碎裂,琼脂糖凝胶电泳也呈现出180—200bp整数倍的梯形带,呈现典型的细胞凋亡特征。这些结果表明HCV Core蛋白的表达能引起Cos—7细胞凋亡,Core蛋白的这种功能可能在HCV的持续感染过程中起着一定的作用。     

丙型肝炎病毒中国株非结构蛋白2~3部分基因cDNA克隆序列分析及表达

丙型肝炎病毒 (ＨｅｐａｔｉｔｉｓＣｖｉｒｕｓ,ＨＣＶ)是输血后和许多社区获得性非甲非乙肝炎的主要致病因子。ＨＣＶ为单股正链ＲＮＡ病毒 ,其基因组长约 9.5Ｋｂ ,编码区含一个大开放读码框架 ,编码 30 1 0 30 33氨基酸残基的多蛋白前体 ,经宿主蛋白酶和病毒蛋白酶加工成具有生物学功能的成熟蛋白。ＨＣＶ各区域的分布顺序是 :Ｃ Ｅ1 Ｅ2 ｐ7 ＮＳ2 ＮＳ3 ＮＳ4Ａ ＮＳ4Ｂ ＮＳ5Ａ ＮＳ5Ｂ[1] 。本文我们应用ＲＴ ＰＣＲ方法从ＨＣＶ患者血清中扩增编码病毒蛋白酶的非结构蛋白 (ＮＳ2 ＮＳ3)部分基因 ,对其核苷酸序列进行了分析 ,…     

HCV核心蛋白诱导Cos-7细胞凋亡

将丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白(Core)基因的全长序列插入到真核表达载体pCDNA3 CMV启动子下游,构建真核表达载体pCDNA3-Core,用脂质体LipoVecTM转染Cos-7细胞系进行瞬时表达;DNA转染24h后用免疫斑点试验检测在细胞中表达的Core蛋白;转染72h后用Hoechst染色和DNA Ladder检测Cos-7细胞的凋亡情况;荧光染色观察到了细胞凋亡核碎裂,琼脂糖凝胶电泳也呈现出180-200bp整数倍的梯形带,呈现典型的细胞凋亡特征.这些结果表明HCV Core蛋白的表达能引起Cos-7细胞凋亡,Core蛋白的这种功能可能在HCV的持续感染过程中起着一定的作用.     

HCV E2蛋白诱导的体液免疫及CTL应答研究

应用PCR方法扩增出HCVE2基因编码417a．a-750a．a的DNA片段,克隆到原核表达载体pQE30 LacZ启动子下游,转化JM109菌株。在JM109菌株中诱导表达出N端含6个组氨酸的E2融合蛋白,用Ni-NTA-Superflow亲和层析柱纯化作为抗原免疫实验兔和BALB／c鼠。定期取兔血,采用间接ELISA方法检测兔子体内针对E2的抗体水平和维持规律。结果显示,距初次免疫14d兔子体内已有抗体产生,直至免疫第55d抗体水平持续上升,之后抗体水平保持稳定,抗体滴度达到1：3200。六周后,取鼠脾脏制各淋巴细胞,定向刺激扩增后与经过重组真核表达质粒pCE2转染的P815细胞作用,利用LDH释放试验检测作用效果。在E：T＝200：1的情况下,杀伤率超过30％。这些结果表明工程菌株表达的HCVE2蛋白具有良好的免疫原性,可以诱发免疫实验动物机体产生较高滴度的抗体及特异性CTL应答。由此我们认为E2蛋白是发展HCV预防工程蛋白疫苗的合适候选者。