马铃薯转化酶抑制子St-inh cDNA克隆及在大肠杆菌中的表达和功能测定

用RT-PCR结合5’RACE方法从马铃薯(Solarium tuberosum L．)栽培种JH块茎中克隆了转化酶抑制子St-inh全长cDNA。序列分析表明,St-inh基因编码区全长663bp,编码221个氨基酸。将含St-inh基因cDNA的DNA片段克隆到pET28a( )上,转化大肠杆菌BL21(DE3)后成功实现了表达。基因表达产物与马铃薯栽培品种(系)E1、JH试管块茎以及番茄果实的转化酶提取物共孵育结果显示,转化酶活性分别下降了34．3％、21％和33．8％,说明St-inh的翻译产物具有转化酶抑制子功能。BLAST基因序列分析表明,St-inh与Kunitz-type C类基因序列同源性达95％以上,T-COFFEE氨基酸序列对比分析显示,该基因编码的蛋白质具有典型的Kunitz-type结构域[L,I,V,M]-X-D-X-[E,D,N,T,Y]-[D,G]-[R,K,H,D,E,N,Q]-X-[L,I,V,M]-X(5)-Y-X-[L,I,V,M],因此,St-inh基因可能为Kunitz-type家族成员。     

天花粉蛋白基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

天花粉蛋白 (Trichosanthin ,TCS)全长基因通过PCR从 pCDNA3 1中获得 ,克隆至表达载体中。双向测序表明获得的天花粉蛋白全长基因序列正确。建立大肠杆菌原核表达系统 ,表达并纯化His TCS活性融合蛋白 ,鉴定出其具有RNAN 糖苷酶活性和与TCS特异性单克隆抗体TE1 (IgE)结合的抗原活性     

桑蚕金属硫蛋白基因在大肠杆菌中的克隆和表达

用\%Bam\%HⅠ和\%Sac\%Ⅰ双酶切质粒pCM1\|1,获得酵母的MTI基因片段,用非放射性地高辛标记作为探针。提取桑蚕肥苏蚕卵的总DNA,分别用\%Eco\%RⅠ、\%Bam\%HⅠ和\%Hin\%dⅢ酶切,与MTI探针进行Southern杂交,出现较强的杂交信号。然后用\%Eco\%RⅠ完全酶切桑吞的总DNA,电洗脱法回收1～6kb的染色体片断,与\%Eco\%RⅠ酶切的M13-载体以3∶1比例连接,转化受体菌DH5α。筛选到4 000多个白色转化子,与探针MTI进行Southern杂交筛选阳性转化子,选择到有强杂交信号的三个转化子［编号为T1(pZHC\|1)\,T5(pZHC\|5)\,T7(pZHC\|7)\]。用12种限制性内切酶对pZHC\|5重组质粒进行酶切分析表明插入片段约12kb,在基因内有一个\%Hin\%dⅢ位点。抗性测定表明受体菌DH5α在含有50mmol/L CuSO\-4的培养基上生长,在含有52mmol/L CuSO\-4的培养基上不生长,而转化子确能在含有52mmol/L CuSO\-4以上的培养基上生长。上述研究结果表明12kb左右的插入片段含有桑吞的金属硫蛋白基因。     

抗菌肽-X基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

用PCR技术获得抗菌肽—X基因、TNFα基因,与温度诱导的表达载体pRC连接成为重组表达载体,导入大肠杆菌TG1,通过温度诱导表达重组蛋白。将重组质粒转入不同的表达菌中进行表达,经SDS—PAGE选出E.coil BL21(DE3)为最佳表达的宿主菌。培养后,离心得菌体,经超声破碎离心得包涵体,溶解后用CNBr切割并透析,最后经CM52纤维素柱分离纯化得到有活性高纯度的抗菌肽—X。     

转谷氨酰胺酶基因在大肠杆菌中的克隆表达

从轮枝链霉菌Streptoverticilliummobaraense细胞中获得其基因组DNA ,用一对特异性的引物通过PCR的方法扩增出转谷氨酰胺酶 (transglutaminase,TGase)全长基因 ,回收片段并将其连接到表达载体pET30a中 ,转化大肠杆菌DH5α。双向测序表明获得的转谷氨酰胺酶全长基因序列正确。纯化重组质粒转化大肠杆菌BL2 1 (DE3) ,以 1mmol/LIPTG诱导 5h收集菌体进行SDS-PAGE电泳分析 ,与阴性对照相比 ,明显多出了一条蛋白条带 ,紫外扫描显示此带约占总蛋白量的1 7% ,Westernblotting证实此带能够特异性地与兔抗MTG(味之素公司 )的抗体发生反应。测得纯化后得到的TGase蛋白的酶活可以达到 15.1U/mg蛋白。     

水稻花粉[肌动蛋白]抑制蛋白基因的克隆和表达分析

[肌动蛋白]抑制蛋白（profilin）是一种低分子量、与肌动蛋白结构的蛋白质。通过筛选水稻成熟花粉的cDNA文库,获得了两个全长cDNA片段,序列分析结果表明,两个cDNA片段长度分别为821bp和805bp;共同拥有一个由131个氨基酸组成的开放密码框、5′末端翻译区和一个带有poly(A)的3′区域。[肌动蛋白]抑制蛋白与玉米、C.dactylon、H.brasiliensis、P.pratense中的该蛋白质的同源性分别为89％、87％、83％、89％。Southern杂交分析显示,在基因组至少有两个基因存在。Northern杂交和RT-PCR结果显示它在花粉和花粉中特异表达。     

编码人生长激素的DNA序列在大肠杆菌中的直接表达

编码人生长激素的DNA通过用化学合成的DNA与酶促制备的CDNA连接而建立。这一“杂化物”基因在乳糖操纵子控制下在大肠杆菌中表达,产生的肽在大小和免疫学性质上具有成熟的人的生长激素的特性。 人生长激素(HGH)是垂体前叶合成的具有191个氨基酸的蛋白质。垂体机能减退 的侏儒因HGH缺陷而身材矮小,在儿童期使用人生长激素可以治疗这一缺陷症。另外,HGH在治疗各种创伤疾病如骨折、皮肤烧伤、溃疡等被证实是有效的。由于生长激素具种属专一性,人的尸体成为HGH的唯一来源。 生长激素mRNA的初级翻译产物是一个蛋白前体,含有与生长激素N末端相接的一段信号肽。这种信号或“前”序列是分泌蛋白的特征。对于大鼠生长激素(RGH),已经鉴定了由RGH mRNA制备的CDNA序列中前序列的26个氨基酸残基。由人生长激素cDNA序列获得的信息,我们设计并建立了一个细菌质粒,它可以在微生物细胞中指导合成大量的成熟HGH。     

人毒素源性大肠杆菌热敏感肠毒素基因的克隆和表达

用限制酶Pst I完全消化毒素源性大肠杆菌H10407的热敏感肠毒素(LT)质粒DNA,酶切片段经电泳分离后,用southern分子杂交技术定位LT基因。回收5．3kb的LT DNA片段并将它与Pst I完全酶解的pUC8DNA混合,体外连接后用于转化感受态E．Coil JM83细胞。筛选后获得了一株能有效表达LT的重组子。免疫学及生物学测定表明,此克隆株所产生的LT与亲本株H10407所产生者具有相同的免疫原性和生物活性,且其产最为亲本株的16倍。     

核糖核酸酶抑制蛋白变体RIv在大肠杆菌和家蚕细胞中的表达

人源的核糖核酸酶抑制蛋白 (ribonucleaseinhibitor,RI)是一种富含亮氨酸和半胱氨酸残基的酸性蛋白质 ,分子量为 5 0kD。从人胚胎肝cDNA文库中克隆到一个核糖核酸酶抑制蛋白RI基因的变体 (ribonucleaseinhibitorvari ant,RIv)。序列分析表明 ,与RI相比较 ,RIv序列中仅有Arg359Ala和Leu36 5Pro两个氨基酸突变 ,而核苷酸同源性较低 ,为 78%。将RIv克隆于pET2 8a( ) ,并转化大肠杆菌BL2 1(DE3) ,IPTG诱导表达 ,利用 6×His亲和层析柱纯化得到了His RIv重组蛋白。将RIv克隆于转移载体pBacPAK8,利用家蚕核型多角体病毒 (BmNPV)表达系统表达得到重组RIv。体外活性测定实验表明 ,重组RIv具有抑制牛胰RNaseA酶解 2 8S和 18SrRNA的作用。     

霍乱弧菌zot基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

从霍乱疫苗菌中抽提基因组DNA,用PCR的方法扩增zot基因。序列分析表明,zot基因编码399个氨基酸,其中4个氨基酸与文献报道有差异。将zot基因插入含T7启动子的质粒pET28(a+)构建表达质粒pET-ZOT,转化大肠杆菌BL21(DE3)筛选表达菌株BLZOT。表达菌株经1mmol/L IPTG诱导表达3～5h后,表达大量ZOT蛋白,并形成包涵体。经SDS-PAGE分析重组ZOT蛋白分子量约为47kD,凝胶自动扫描分析表明,重组ZOT约占菌体可溶性蛋白量的15%以上。本工作为进一步研究蛋白多肽类药物的口服奠定了良好的基础。     

mel基因在酿酒酵母菌中的克隆和表达*

构建了含mel基因的重组质粒pAJM,并转化到酿酒酵母菌中,获得了在平板上产生黑色表型的转化重组子,为酵母菌的遗传操作提供了一种新的选择标记。由于mel基因经酪氨酸产生的黑色素无毒、无害,安全稳定,无需另外加显色化合物或使用特殊的仪器设备,直接在平板上观察结果。因此,是一种便捷、价廉、无污染的新型报告基因。此外,实验中还发现含mel基因的酵母菌生长迅速,这不仅作为报告基因更能显示其优势,而且也为进一步研究其在酵母菌中的功能提出了新的内容。     

人白细胞介素26的基因克隆及其在大肠杆菌中的表达

克隆人白细胞介素-26(human interleukin-26,hIL-26)基因,构建高效稳定的大肠杆菌表达菌株。对GenBank上报道的hIL-26基因进行序列分析后设计合成引物,利用RT-PCR技术从人外周血单个核细胞(PBMC)总RNA中反转录并扩增得到人成熟肽IL-26基因。将得到的基因克隆到pMD18-T载体中,菌落PCR筛选、酶切鉴定并进行DNA序列分析。用BamHI和EcoRⅠ将目的片段切下,插入表达载体pBV220相应的位点。42℃热诱导表达目的蛋白,SDS-PAGE分析显示表达蛋白约占菌体总蛋白的20%,Western印迹法证实重组蛋白为特异性蛋白,分子筛纯化后纯度达90%以上。表达的重组蛋白经谷胱甘肽复性缓冲液复性,用RT-PCR检测复性的重组蛋白能促进PBMC合成IFN-γ。     

嵌合蛋白sTNFR II-IgG Fc的克隆、表达与活性分析

肿瘤坏死因子是一种重要的炎性细胞因子,目前已知许多免疫疾病与之相关,为了抑制TNF的生物学活性,将可溶性TNFR Ⅱ(sTNFR Ⅱ）和人IgG Fc分子通过柔性短肽相连,构建成一个嵌合蛋白,在大肠杆菌中进行表达,并获得了纯化蛋白。实验证明该嵌合蛋白能够自发形成聚合体,识别并结合TNF蛋白,同单体sTNFR Ⅱ相比,对TNF的中和活性得到了较大的提高。     

酿酒酵母rav2基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

RAVE(regulator of the H+-ATPase of the vacuolar and endosomal membranes)复合物由Ravl p,Rav2p和Skplp 3个亚基组成.将酿酒酵母中的rav2基因克隆到表达载体pETDuet-1中,构建重组质粒pETDuet-R2,并转化入大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达.通过IPTG诱导,SDS-PAGE分析重组菌在诱导后表达出目的蛋白.目的蛋白经Ni-NTA凝胶纯化后再经质谱进一步验证确定为酿酒酵母的Rav2p蛋白.目前国际上还没有有关Rav2p的结构和性质以及RAVE亚基之间相互关系的研究.重组质粒pETDuet-R2的成功构建以及Rav2p的可溶性表达为研究RAVE亚基之间的相互作用以及V-ATP酶的活性调节机理打下基础.     

里氏木霉纤维二糖酶bg1Ⅱ基因的cDNA克隆及其在大肠杆菌中的表达

将里氏木霉总RNA反转录得到cDNA第一链，并以之为模板进行RT－PCR合成约1．4kb的纤维二糖酶基因cDNA,将所得的cDNA经测序后克隆到温度敏感型载体pJW2中，经PCR和双酶切鉴定筛出阳性重组子，温度诱导后，经酶活测定，bg1Ⅱ基因在大肠杆菌中得到了表达，酶活为0．75IU／mL。     

人白细胞介素-10在大肠杆菌中的克隆与表达

目的:构建人IL-10原核表达载体,并对表达产物进行鉴定。方法:应用RT-PCR技术从ConA诱导的单核细胞中扩增出IL-10成熟肽cDNA片段,将其克隆到PGEM-T后载体测序,双酶切回收目的片段构建IL-10原核表达载体PET28a-IL10。PET28a-IL10转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达后对其表达产物进行SDS-Page和Western Blot分析。结果:SDS-Page电泳显示IL-10在大肠杆菌中得到了表达,分子量为21000,Western Blot分析显示表达产物可于IL-10多抗特异反应。结论:IL-10在大肠杆菌中成功表达,具有免疫原性。为其进一步生物学研究奠定了基础。     

人Leptin的基因克隆及其在大肠杆菌中的表达

用 RT- PCR自脂肪细胞 RNA扩增人瘦素 (leptin)基因的 c DNA片段 (约 50 0 bp)并克隆至克隆载体 p SK(+) ,获得重组质粒 p SK- OB,DNA序列分析显示获得的 Leptin基因和文献报道一致 .用限制酶 Eco R 和 Bam H 从 p SK- OB切下并插入原核表达载体 p BV2 2 0的相应限制酶位点 ,转化大肠杆菌 DH5α.转化菌株经 42℃诱导 ,SDS- PAGE检测和 Western印迹鉴定 ,获得高水平重组人瘦素的表达菌株 ,其表达量达菌体总蛋白的 30 %以上 .     

费氏中华根瘤菌与耐盐有关基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

费氏中华根瘤菌（Sinorhizobium fredii）RT19与耐盐有关的4.4kb DNA片段含有3个相间的开放阅读框,经亚克隆及功能检测,证实其中的ORF2与耐盐有关,将ORF2分别克隆到表达载体pTHioHisA、B和C上,得到3个重组质粒pGA、pGB和pGC,转化大肠杆菌（escherichia coli）5α。经IPTG诱导后和作SDS－PAGE分析,发现只有pGC编码的融合蛋白获得了表达,其分子量为53kDa。恰好是trxA基因编码的硫氧还蛋白与推测的蛋白质分子量之和。Westerm印迹证实,表达的蛋白质是trxA基因和目的基因编码的。     

絮凝基因的克隆和在工业啤酒酵母菌株中表达

The partial genomic library of Saccharomyce cerevisiae FL189 possessing strong flocculation ability was constructed using Yeast-E.coli shuttle plasmid YCp50 as vector.Recombinant plasmid containing flocculation gene was obtained by screening the growth of transformants on the selective medium and measurement flocculation,designated as pCF1.pCF1 was introduced into industrial yeast strain PJ208-5-15.Six transformants PJ208-5-15-1(pCF1)～PJ208-5-15-6(pCF1)possessing strong flocculation ability were obtained.Th…