与人体β—珠蛋白基因5‘旁侧正调控区（PCR）相结合的调控因子（简报）

Using gel mobility shift assay, three protein factors (Pa, Pb, Pc) binding to the positive control region (PCR) in the 5' flanking sequence of human beta-globin gene were detected in the nuclear extracts from mouse fetal liver at d 18 or d 19 of gestation. Competitive experiment showed that Pb and Pc could bind to GATA-1 motif, therefore could be the members of GATA family. While Pa was a new and developmental stage specific trans-acting factor, we suggested that the factor Pa was related to the activation of beta-globin gene.     

人体β-珠蛋白基因5’旁侧调控元件与不同发育时期调控因子的相互作用

人β-珠蛋白基因主要在成年期的骨髓中表达,在胎儿肝,成年肝和K 562细胞中则处于关闭状态。凝胶电泳阻抑法分析发现,在人胎儿肝,成年肝及K 562细胞的核蛋白抽提物中存在着不同的与β-珠蛋白基因5'旁侧调控元件(-372到-194 bp)相结合的红系组织特异性的调控因子。竟争试验的结果表明,成年肝和K 562细胞中的调控因子与β-珠蛋白基因5'旁侧调控元件相互作用的方式具有一定的相似性,这两种细胞的调控因子既结合于负调控区(NCR 2)也结合于正调控区,说明两种细胞中β-珠蛋白基因的关闭机制可能是相似的。胎儿肝的核蛋白因子只结合于负调控区,推测在胎儿期存在独特的关闭机制。     

与人体ε-珠蛋白基因5''''旁侧正调控元件(ε-PREI)专一结合的调控因子的初步研究

人体ε－珠蛋白基因５′旁侧ＤＮＡ序列对该基因时空表达与调控起着十分重要的作用。本文运用凝胶电泳阻抑法,ＤＮａｓｅＩ足印法和Ｓｏｕｔｈｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ分析法发现在胚胎型红白血病细胞株Ｋ５６２细胞中有一个特异的核蛋白因子（简称ε－ＳＳＰ,其分子量大约为８０ｋＤ）,它能专一地与人体ε－珠蛋白基因５′旁侧一个红细胞专一和发育时期特异的正调控元件（ε－ＰＲＥＩＩ,－４４６ｂｐ到－４１９ｂｐ）相结合。竞争实验表明该因子与ε－ＰＲＥＩＩ的结合能被人体ε－珠蛋白基因启动子区ＤＮＡ片段（－１７７ｂｐ到＋１ｂｐ）所竞争;同时也能被人体β－类珠蛋白基因远侧端调控元件ＬＣＲ中的ＤＮａｓｅＩ超敏感点Ｉ核心区ＤＮＡ片段（－１０９６５ｂｐ到－１０６８１ｂｐ）与超敏感点ＩＩ核心区ＤＮＡ片段（－１４９９３ｂｐ到－１４７１８ｂｐ）所竞争。我们的结果提示了ε－ＳＳＰ不仅是一个与红细胞专一性和发育时期特异性相关的反式调控因子,而且它可能介导远侧端调控元件（ＬＣＲ）与近侧端调控元件启动子之间的相互作用,共同调节ε－珠蛋白基因在胚胎期的表达。     

人体β—珠蛋白基因5‘旁侧调控元件与不同发育时期调控因子的…

人β－珠蛋白基因主要在成年期的骨髓中表达,在胎儿肝,成年肟和Ｋ５６２细胞中则处于关闭状态,凝胶电泳阻抑法分析发现,在人和肝,成年肝及Ｋ５６２细胞的核蛋白抽提物中存在着不同的与β－珠蛋白基因５旁侧调控元件（－３７２到－１９４ｂｐ）相结合的红系组织特生的调控因子。竞争试验的结果表明,成年肝和Ｋ５６２细胞中的调控因子与β－珠蛋白基因５旁侧调控元件相互作用的方式具有一定的相惟性,这两各细胞的调控因子既结合     

与人体ε—珠蛋白基因5‘旁侧正调控元件（ε—PREⅡ）…

人体ε－珠蛋白基因５’旁侧ＤＮＡ序列对该基因时空表达与调控起着十分重要的作用。本文运用交电泳阻抑法,ＤＮａｓｅＩ足印法和Ｓｏｕｔｈｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ分析法发现在胚胎裂红白血病细胞株Ｋ５６２细胞中有一个特异的核蛋白因子,它能专一地与人体ε珠蛋白基因５‘旁侧一个红细胞专一和发育时期特异的正调控元件（ε－ＰＲＥⅡ,－４４６ｂｐ到－４１９ｂｐ）相结合竞争实验表明该因子与ε－ＰＲＥⅡ的结合能被人体ε－     

β—珠蛋白基因簇表达调控的反式作用因子

β－珠蛋白基因簇是研究真核基因表达调控的良好模型,其基因表达具有红系组织特异性和不同发育阶段特异性,这些特异性的产生依赖于组织特异性表达和发育阶段特异性表达的反式作用因子与顺式作用元件间的相互作用。     

人体β—类珠蛋白基因时空表达与调控

人体β-类珠蛋白基因簇可以说是真核生物基因组中最具有代表性的一个基因家族,它的表达具有严格红系组织特异性和发育时期专一性,是用以研究真核基因表达与调控以及基因表达与细胞分化关系的理想体系。目前,国内外对人体β-类珠蛋白基因时空表达与调控分子机制的研究,引起了极大的关注。本文就几个方面作一简要概述。     

HMG蛋白质与人ε-珠蛋白基因5′旁侧调控元件DNA相互作用

ＨＭＧ蛋白质是一类在染色质内含量极为丰富的非组蛋白质,它们在染色质的结构与功能中起着重要的作用。本文运用凝胶电泳阻抑法和ＤＮａｓｅＩ足迹法分析了ＨＭＧ蛋白质与人ε－珠蛋白基因５′旁侧调控元件ＤＮＡ之间相互作用的情况。结果表明ＨＭＧ蛋白质（１／２）既能与两个正调控元件（－５３５～－４５３ｂｐ和－４４６～－４１９ｂｐ）ＤＮＡ相结合,也能与启动子（－１７７～＋１ｂｐ）ＤＮＡ相结合;而ＨＭＧ蛋白质（１４／１７）都不能与它们相结合。相反,ＨＭＧ蛋白质（１４／１７）能与一个负调控元件（－３９２～－１７７ｂｐ）ＤＮＡ相结合,而ＨＭＧ蛋白质（１／２）却不能与它相结合。上述的结果提示了ＨＭＧ蛋白质在人ε－珠蛋白基因时空表达过程中起着积极的调控作用。     

人β球蛋白基因5‘旁侧远端新沉墨子区的功能和鉴定

为探讨β珠蛋白基因５‘旁侧远端及／或δ－β基因间序列调控中所起的作用本文重组含不同长度５’旁侧远端上序列的β基因逆病毒载体并转染Ｈｅｌａ细胞,用Ｎｏｒｔｈｅｒｎ凶迹杂交和ＲＴ－ｃｐＣＲ竞争性定量检测β基因在Ｈｅｌａ细胞中的稳定表达水平,发现在β基因上游约１．８ｋｂ处存在一强默子活性区;进而通过竞争性凝胶阻滞分析主要定位于一长为３１０ｂｐ的ＤＮＡ片段中,从中发现众多调控相关序列;用荧光素酶报告基因瞬     

人β-簇珠蛋白基因LCR调控元件中HS3与反式调控因子相互作用的研究

人β-簇珠蛋白基因LCR调控元件位于ε-珠蛋白基因5’上游20Kb内,由四个DNase-Ⅰ超敏感点(HS1-HS4)组成。已有转基因实验表明,HS3可能与发育早期的胚胎型ε-珠蛋白基因表达调控相关。基因调控是通过调控元件与调控因子的相互作用而完成的。为了揭示HS3的调控作用,我们选用了发育不同时期的小鼠胚胎造血组织作为材料,用凝胶电泳阻抑法,分析了调控因子与HS3的结合。我们的实验结果表明,怀孕13天和18天的小鼠胚胎造血组织的核蛋白因子与HS3的结合模式完全不同;同时我们用Southwestern Blot的方法进一步证明了这种差异性的存在。现已知HS3中有GA-TA和CACCC两类转录因子结合的motif,采用竞争实验分析,发现CACCC motif对结合区带没有竞争作用,而GATA有竞争作用;另外还存在没有被竞争的条带,我们推测它们可能是一类新的、发育时期专一性的核蛋白因子。Western Blot的实验结果表明,在基因调控过程中起到重要作用的红系转录因子GATA家族中的GATA-1和GATA-2的表达也具有时期专一性:即怀孕13天的小鼠造血组织中表达GATA-2,不表达GATA-1;而怀孕18天的小鼠造血组织中则表达GATA-1,不表达GA-TA-2。因此,我们推测,HS3很可能参与时期专一性的基因表达调控,其中时期专一性的蛋白因子可能起到了重要作用。     

人β—簇珠蛋白基因LCR调控元件中HS3与反式调控因子相互作用的研究

Upstream of the human epsilon-globin gene is the Locus Control Region (LCR) of the human beta-globin cluster, which consists of four DNase-I hypersensitive sites(HS1-HS4). It has been reported in transgenic experiments that HS3 preferentially regulates epsilon-globin gene expression. In order to elucidate the regulatory function of HS3 in the expression of globin gene, nuclear extracts from mouse hematopoietic tissues at several developmental stages were prepared and the binding of the nuclear factors to HS3 was analysed by using electrophoresis mobility shift assay(EMSA). Our results showed that the binding patterns of HS3 with nuclear extracts of mouse hematopoietic tissues at day 13 and day 18 of gestation were completely different; furthermore, by Southwestern Blot, the distinction between both stages was also demonstrated. It has been known that GATA and CACCC binding motifs are contained within HS3 core region. Using competitive gel-retardation assay, we found that no shift bands could be competed by using CACCC motif as a competitor. However one shift band at day 13 and day 18 of gestation could be competed respectively by using GATA motif as a competitor. We suggested that the shift bands, which could not be competed by both motifs, might be novel and stage-specific factors. In addition, by using Western Blot, we demonstrated that the two shift bands at day 13 and day 18 of gestation, competed by GATA motif, were GATA-2 and GATA-1 respectively: GATA-1 was expressed in mouse hematopoietic tissues at day 18 of gestation and not expressed at day 13 of gestation; however, GATA-2 was only expressed in mouse hematopoietic tissues at day 13 of gestation. According to these results, we speculated that HS3 might play an important role in regulation of stage-specific expression of globin genes through interaction between stage-specific nuclear factors and HS3.     

HMG蛋白质与人ε—珠蛋白基因5‘旁侧调控元件DNA相 …

ＨＭＧ蛋白质是一类在染色质内含量极为丰富的非组蛋白质,它们在染色质的结构与功能中起着重要的作用。本文运用凝胶电泳阻抑法和ＤＮａｓｅＩ足迹法分析了ＨＭＧ蛋白质与人ε－珠蛋白基因５＇旁侧调控元件ＤＮＡ之间相互作用的情况。结果表明ＨＭＧ蛋白质（１／２）既能与两个正调控元件（－５３５￣－４５３ｂｐ和－４４６￣－４１９ｂｐ）ＤＮＡ相结合,也能与启动子（－１７７￣＋１ｂｐ）ＤＮＡ相结合;而ＨＭＧ蛋白质（１４／     

β珠蛋白基因5'远端新沉默子克隆及定点诱变

通过凝胶滞留分析和荧光素酶报告基因检测系统,鉴定出人类β珠蛋白基因5'旁侧远端帽位上游-2 132～-1 82 2 bp间存在一个活性沉默子片段(310 bp),将其亚克隆至pUC-T载体中,然后采用人工设计的突变引物,将经DNA足纹分析确定的两个结合位点的核心基序(β珠蛋白基因帽位上游 -2 017～-2 011 bp间的"CTTCCGC"序列和-2 006～-1 997 bp间的"CACTTT ATTT"序列) 分别定点诱变为"CTTAAGC"和"CACTTAAGTT"两个突变序列,从而构建成两种突变型310 bp片段,可用于对活性沉默子位点的结构与功能及β珠蛋白基因表达调控机制的深入研究.     

碱性Krueppel样因子对和珠蛋白基因的转录调控作用

为探索碱性Kruppel样因子（basic Krueppel-like factor,BKLF)对γ-和ε珠蛋白基因的转录调控作用,构建了人类BKLF(hBKLF)基因全长及N端缺失40个氨基酸的真核表达载体,并将其瞬时转染到COS7细胞中做报告实验。结果表明,hBKLF能够抑制γ-和ε-珠蛋白基因启动子的活性,而hBKLF特异的反义核酸则激活这两种基因的启动子。N端缺失40个氨基酸不影响这种转录抑制功能。hBKLF强烈抑制FKLF(embryonic/fetalβ-like globin gene-activating Krueppel-like factor)引起的对γ-和ε-珠蛋白基因的转录激活作用。另外BKLF基因能够与SHP1（SH2-containing protein tyrosine phosphatase1)基因启动子区的CACCC元件结合。这些结果提示γ-和ε-珠蛋白基因可能是BKLF的转录调控对象,为研究BKLF参与血细胞特异表达基因的调控提供了依据。     

鸡α-珠蛋白基因 5'端 MAR调控GFP的表达

目的观察不同细胞密度、不同转染时间MAR对GFP表达的影响.方法采用脂质体法将pcmv/gfp与pgfp/mar两个真核表达载体转染人的神经母细胞瘤细胞系(SH-SY5Y).结果在细胞密度为3.0×10 5cells/ml,转染后72h GFP表达量较其它条件下高,且在相同条件下,pgp/mar比pcmv/gfp表达要高.结论初步证明该MAR能够提高GFP的表达.     

基因座控制区元件HS2、HS3对β-珠蛋白基因表达的调控

用增强型绿色荧光蛋白(EGFP)为报道基因,通过构建不同的真核表达载体,并用脂质体转染法将其转染到K562及MEL细胞中,经流式细胞仪检测、半定量RT-PCR及荧光倒置显微镜下观察荧光表达情况,以研究HS2、HS3、HS2-HS3及近侧元件在瞬时表达中对β-珠蛋白基因启动子驱动下的EGFP表达调控情况.结果显示,3.2kb的HS2元件在K562及MEL细胞中均可增强β-启动子活性,而3kb的HS3仅在MEL细胞中有增强作用,且两者在两种细胞中均无明显协同作用.     

中国人β－珠蛋白基因－530基序的变异性研究

应用双链ＤＮＡ循环测序法,对中国人群中２０例血液学正常个体,７７例β－珠蛋白合成异常患者（４３例）及其部分亲属（３４例）的β珠蛋白基因上游－５３０基序进行了序列分析。结果表明,中国人－５３０基序存在（ＡＴ）＿８Ｔ＿５、（ＡＴ）７＿Ｔ＿７和（ＡＴ）９＿Ｔ＿５三种主要的重排类型,以及一种未见报道的稀有重排类型（ＡＴ）＿（１０）Ｔ＿３。进一步经家系连锁分析,获得由β珠蛋白结构基因与－５３０基序重排组成的单体型,结果显示ＩＶＳ－ＩＩ－６５４（Ｃ→Ｔ）,ＣＤ４１－４２（－４ｂｐ）和ＨｂＥ等类型的β珠蛋白突变基因分别与（ＡＴ）＿８Ｔ＿５、（ＡＴ）＿７Ｔ＿７和（ＡＴ）＿９Ｔ＿５重排存在着连锁不平衡现象。     

羟基脲(Hydroxyurea)对细胞周期与珠蛋白基因表达的影响(简报)

已有许多证据表明羟基脲能增加镰状细胞贫血及β-地贫病人的胎儿型血红蛋白(HbF)的合成。最近,有人报道羟基脲也能使一些患有β-地贫病人的β-珠蛋白基因表达增加。K562细胞是人红白血病细胞株,它只能表达胚胎型(ε-)与胎儿型(γ-)珠蛋白基因,而不能表达成年型(β-)珠蛋白基因。因此,K562     

羟基脲诱导前后HEL细胞内GATA转录因子与人β—类珠蛋白基因调控元件的结合模式分析

HEL细胞是一株人红白血病细胞株,其中成年型β-珠蛋白基因不能表达。我们以往的试验证明,羟基脲诱导以后,能使HEL细胞内成年型β-珠蛋白基因表达。本文以此为模型,探索了β-珠蛋白基因在HEL细胞内诱导表达的分子机制。结果表明,羟基脲诱导之后,与人β-珠蛋白基因5’远侧端DNaseⅠ超敏感点2核心DNA序列以及近侧端启动子DNA序列相结合的GATA-1蛋白因子量明显增多,而GATA-2蛋白因子量明显减少。结果显示,GATA蛋白家族各成员在HEL细胞分化及珠蛋白基因表达的过程中扮演着不同的角色。推测GATA-1可能有促进β-珠蛋白基因的表达,使HEL细胞趋向终末分化的作用,GATA-2则可能与胚胎型珠蛋白基因表达有关,并有抑制红细胞向终末分化的功能。     

人胎儿γ-珠蛋白基因的再活化及在β血红蛋白病治疗中的

在个体发育过程中,人β类珠蛋白基因的表达存在从胎儿（γ）到成人（β）珠蛋白基因的表达转换（或称开关）.β-地中海贫血和镰刀型贫血症是两种最为常见的严重危害人类健康的单基因遗传病,通过诱导胎儿期血红蛋白（HbF,α2γ2）在成人期表达对该病的治疗是一种有效的策略.一些活化γ珠蛋白基因表达的转录因子和辅助因子已经被鉴定,一些可以增加胎儿血红蛋白在成人红细胞中表达的药物也已被鉴别和实验,它们的作用机制被部分揭示,这些研究为发展通过活化γ-珠蛋白基因治疗镰刀形细胞贫血和重型β-地中海贫血的方法提供了重要线索和实验依据.