糜酶转基因小鼠心脏组织中基质金属蛋白酶9的活化

为研究糜酶在心脏中的功能 ,用明胶酶谱法和放免法检测了糜酶转基因小鼠心脏组织中基质金属蛋白酶及糜酶的活力 .糜酶转基因小鼠心脏组织中糜酶样活力较转基因阴性小鼠升高了约80 % ;而其心脏匀浆液凝胶酶谱分析结果显示在 92 k D处明胶酶活力也升高约 30 % ;经 Western印迹鉴定为基质金属蛋白酶 9,而在蛋白水平上与转基因阴性小鼠无显著差异 .结果提示 ,糜酶转基因小鼠心脏组织中糜酶活力的升高可活化基质金属蛋白酶 9,从而影响心脏胶原代谢 .     

MLC_2-糜酶融合基因克隆及转基因小鼠的产生

为研究糜酶基因在体内的结构与功能以及与心肌肥厚的关系,并提高糜酶基因在小鼠心脏中的表达,构建肌球蛋白轻链－２启动子（ｍｙｏｓｉｎｌｉｇｈｔｃｈａｉｎ－２ｐｒｏｍｏｔｅｒ,ＭＬＣ２）－糜酶融合基因并产生转基因小鼠．通过删除糜酶基因启动子序列,构建结构基因克隆,然后与大鼠心脏肌球蛋白轻链－２启动子序列相拼接,构建ＭＬＣ２－糜酶融合基因克隆,回收并纯化融合基因片段,显微注射入小鼠受精卵产生转基因小鼠,经ＰＣＲ扩增、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹杂交和ＰＣＲ扩增产物的测序,筛选和确定转基因鼠．在新出生的４６只小鼠中有２只为转基因阳性鼠,且外源基因能稳定遗传给后代,从而获得了可用于研究糜酶基因在体内的结构与功能以及与心肌肥厚的关系的转基因小鼠模型．     

竞争性PCR检测MLC_2-糜酶融合基因在转基因小鼠中的组织特异性表达

 用竞争性 Ｐ Ｃ Ｒ 方法定量检测了大鼠肌球蛋白轻链 ２ 启动子（ｍ ｙｏｓｉｎ ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ ２ ｐｒｏｍ ｏｔ ｅｒ, Ｍ Ｌ Ｃ２） 糜酶（ｃｈｙｍ ａｓｅ）融合基因在转基因小鼠不同组织中的表达情况,发现 Ｍ Ｌ Ｃ２ ｃｈｙｍ ａｓｅ融合基因在转基因小鼠的心脏中有较高水平的表达,在骨骼肌中表达水平较低,在肾脏中有微弱表达;而在肝脏和肺中未检测到．表明 Ｍ Ｌ Ｃ２ ｃｈｙｍ ａｓｅ 融合基因改变了野生型 ｃｈｙｍ ａｓｅ 在生物体内的表达特性,不仅提高了表达效率,而且赋予了一定的心脏组织特异性,为进一步研究 ｃｈｙｍ ａｓｅ 基因在心脏中的功能奠定了基础．     

WIF-1心脏特异表达转基因小鼠心脏功能分析

目的建立心脏特异表达WIF-1转基因小鼠,研究该基因在心脏中表达对小鼠心脏发育,形态和功能维持中的作用。方法RT-PCR法克隆人WIF-1基因,把WIF-1基因插入α-MHC启动子下游,构建转基因表达载体,通过显微注射法建立转WIF-1C57BL/6J小鼠。并利用特异引物PCR法鉴定转基因小鼠的基因表型,RT-PCR和Westernblot检测基因表达水平,超声检测不同月龄WIF-1转基因小鼠心脏结构及功能变化。结果建立了2个系的心脏特异表达WIF-1转基因小鼠。心脏超声检查证实,WIF-1转基因小鼠与对照小鼠比较,左心室重量减小,舒张期左室内径和容积变小,每搏输出量和心输出量减小。结论WIF-1基因是心脏功能的负调控因子。     

Meox1在心脏过表达引起转基因小鼠扩张性心肌病

目的建立心脏特异表达Meox1转基因小鼠,研究Meox1对心脏发育及心肌病的调节作用。方法利用心脏特异启动子α-MHC构建转基因表达载体,显微注射法建立Meox1转基因小鼠,PCR鉴定转基因小鼠的基因型,Western blot检测Meox1在心脏组织中的表达,心脏超声检测转基因小鼠及野生小鼠的心脏结构和功能。结果在生理状态下,Meox1基因只在幼鼠心脏中表达,在病理状态下,Meox1基因在成年心肌病小鼠的心脏组织表达升高。通过显微注射,建立了两个Meox1基因在心脏组织的表达水平明显高于同龄对照小鼠的转基因小鼠品系。与野生型小鼠相比,两个Meox1转基因小鼠品系收缩期左室内径分别增加7.2%、12.8%（P〈0.01,n=16）,舒张期左室内径分别增加15.6%、24.2%（P〈0.01,n=16）,收缩期容积分别增加36.8%、65.7%（P〈0.01,n=16）,舒张期容积分别增加18.2%、33.8%（P〈0.01,n=16）。射血分数分别减小6.6%、9.3%（P〈0.05,n=16）,短轴内径缩短率分别减小9.4%、12.3%（P〈0.05,n=16）。结论Meox1在心肌病心脏中表达,其在心脏高表达引起心脏左室内径增加,收缩期容积和舒张期容积显著增大,射血分数及短轴缩短率减少等扩张性心肌病表型,是参与心肌病病理发生的基因之一。     

心脏特异表达Calponin 1转基因小鼠的心脏功能分析

目的建立心脏特异表达Calponin 1转基因小鼠,研究Calponin 1对心脏发育及心肌病的调节作用。方法利用心脏特异启动子α-MHC构建转基因表达载体,显微注射法建立Calponin 1转基因小鼠,PCR法鉴定转基因小鼠的基因型,Western Blot检测Calponin 1在心脏组织中的表达,心脏超声检测转基因小鼠的心脏结构和功能,HE染色和Masson染色检测转基因小鼠心脏的病理改变。结果 Calponin 1在野生型小鼠心脏中有表达,在扩张型心肌病小鼠的心脏组织表达降低。通过显微注射法,建立了2个心脏组织Calponin 1基因高表达的转基因小鼠系。与野生型小鼠相比,Calponin 1转基因小鼠收缩期左室内径（LVID,systolic）增加28%（P〈0.01,n=12）,舒张期左室内径（LVID,diastolic）增加16.2%（P〈0.01,n=12）,收缩期左室后壁厚度（LVPW,systolic）减小15.7%（P〈0.01,n=12）,舒张期左室后壁厚度（LVPW,diastolic）减小21%（P〈0.01,n=12）,射血分数（ejection fraction,EF）降低11.5%（P〈0.01,n=12）,短轴内径缩短率（fraction shortening,FS）降低14.6%（P〈0.05,n=12）。转基因小鼠心脏组织病理H＆E染色和Masson染色显示,转基因小鼠心室扩张,心肌细胞不均匀肥大,细胞间隙变大,心肌间质纤维增多。结论 Calponin 1在心脏特异过表达引起转基因小鼠心脏左室内径增加,收缩期容积和舒张期容积显著增大,心室壁变薄,射血分数及短轴缩短率降低等扩张性心肌病表型,推测Calponin 1是参与心肌病病理发生的基因之一。     

心脏特异表达Dhcr24转基因小鼠的建立和表型分析

目的建立心脏特异表达小鼠24-脱氢胆固醇还原酶基因（Dhcr24）转基因小鼠,研究该基因在心脏中表达对小鼠心脏发育,形态和功能维持中的作用。方法RT-PCR法克隆小鼠24-脱氢胆固醇还原酶基因,把Dhcr24基因插入-αMHC启动子下游,构建转基因表达载体,通过显微注射法建立Dhcr24 C57BL/6J转基因小鼠。并利用特异引物PCR法鉴定转基因小鼠的基因型,RT-PCR和Western Blotting检测基因表达水平,光学显微镜和超声检测不同月龄Dhcr24转基因小鼠心脏的组织结构改变。结果建立了2个品系的心脏特异表达Dhcr24转基因小鼠。转入的Dhcr24基因在心脏组织的表达水平超过内源性Dhcr24的3倍。心脏组织学和超声检查证实：Dhcr24转基因小鼠的心室壁变厚,心腔变小,但心脏功能保持正常。结论成功建立了心脏特异表达Dhcr24转基因小鼠,Dhcr24基因在心脏组织的过度表达对小鼠心脏发育和功能维持中的作用需要进一步探讨。     

心脏特异表达NOL3转基因小鼠的建立

目的建立心脏特异表达NOL3转基因小鼠,用于研究该基因在心肌病发病中的作用。方法Western blot检测小鼠NOL3表达谱。构建aMHC-NOL3表达载体,显微注射法建立NOL3转基因小鼠。PCR鉴定转基因鼠的基因型,心脏超声检测转基因及野生型小鼠心脏功能及几何构型。结果NOL3在1月龄野生型鼠心脏、脑、骨骼肌中的高表达,在心脏中的表达不随年龄而改变。通过转基因小鼠的筛选,得到了3个NOL3转基因品系,其中1个品系心脏NOL3蛋白表达量与野生型鼠相比明显增加。单转NOL3基因的小鼠心脏功能及几何构型与野生型小鼠相比无显著变化。结论成功建立了心脏特异表达NOL3转基因小鼠,为进一步和心肌病小鼠模型杂交,研究该基因在心肌病发病中的作用提供了工具。     

转基因小鼠中外源基因部分内含子序列的缺失及其对转录的影响

利用PCR扩增及PCR测序在显微注射法产生的转基因小鼠中发现,整合在小鼠染色体上的肌球蛋白轻链2启动子(myosinlightchain2promoter,MLC2)-糜酶(chymase)外源融合基因存在两种形式,一种为全长的融合基因,另一种在糜酶结构基因的第一内含子中缺失了213bp的序列。RT-PCR结果表明,缺失了部分内含子序列的外源融合基因不能在转基因小鼠心脏中表达.而全长的外源融合基因则能较高水平地表达,竞争性PCR定量实验表明在200ng心脏总RNA反转录产物中约含5.05(±1.38)×106个糜酶cDNA分子。上述结果表明,糜酶结构基因的第一内含子可能对MLC2-糜酶基因的表达具有调控作用。     

microRNA转基因小鼠在心脏发育研究中的应用

microRNA（miRNA）参与调控胚胎心脏的发育,在心脏形态发生、心肌细胞生长及分化过程中发挥着极其重要的作用。通过转基因技术可以实现特异miRNA在心肌组织的过表达与敲除,据此建立的心肌特异性miRNA转基因小鼠模型可以在整体水平揭示miRNA心脏方面的功能。近年,以miRNA为研究对象的心肌特异性转基因小鼠模型数量不断增加。     

糜酶基因在转染的乳鼠心脏组织细胞中的表达

糜酶基因在转染的乳鼠心脏组织细胞中的表达何泉陈兰英（中国医学科学院、中国协和医科大学,心血管病研究所、阜外心血管病医院,北京１０００３７）ＴｈｅＨｕｍａｎＨｅａｒｔＣｈｙｍａｓｅＧｅｎｅＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎＣｕｌｔｕｒｅｄＮｅｏｎａｔａｌＲａｔＨ...     

Dkk3心脏特异表达转基因小鼠心脏功能分析

目的建立心脏特异表达Dkk3转基因模型小鼠,研究Dkk3对心脏发育及和心肌病的调节作用。方法把Dkk3基因插入心肌特异启动子-αMHC下游,构建转基因表达载体,显微注射法建立C57BL/6J Dkk3转基因小鼠,PCR鉴定转基因小鼠基因型,采用Northern blot检测Dkk3在心脏组织中的表达,HE染色和超声检查转基因小鼠心脏结构和功能。结果建立了3个不同表达水平的Dkk3转基因小鼠品系。转入的Dkk3基因在心脏组织的表达水平均高于同龄对照小鼠。组织学分析显示Dkk3小鼠室壁变厚,心腔减小,心肌细胞排列轻度紊乱。超声检查显示心室壁变厚,收缩期容积和舒张期容积显著减小,射血分数,短轴缩短率增加。结论Dkk3过表达导致转基因小鼠室壁变厚,心腔减小,心肌细胞排列轻度紊乱,心肌舒张功能轻度失调。     

造血干细胞全标记红色和绿色荧光转基因小鼠的筛选

目的对五种荧光转基因小鼠造血干细胞中的荧光标记细胞进行分析,筛选造血干细胞全标记红色和绿色荧光转基因小鼠,为造血干细胞分化机制体内示踪研究提供理想的动物模型。方法采用活体荧光影像系统对两种红色荧光转基因小鼠品系C57BL/6J-TgN（CAG-DsRed-1和CAG-DsRed-2）ZLFILAS和三种绿色荧光转基因小鼠品系C57BL/6J-TgN（CAG-EGFP-1、CAG-EGFP-2和CAG-EGFP-3）ZLFILAS的荧光标记进行比较;采用流式细胞术检测各转基因小鼠的骨髓lin（-）c-kit（＋）Sca-1＋（LSK）造血干细胞荧光标记细胞比率,根据标记比率筛选造血干细胞全标记红色和绿色荧光转基因小鼠。结果活体荧光影像分析表明转基因小鼠均系统性表达红色或绿色荧光。流式细胞术检测表明LSK造血干细胞中高度表达红色和绿色荧光,其中,C57BL/6J-TgN（CAG-DsRed-1）ZLFILAS和C57BL/6J-TgN（CAG-EGFP-1）ZLFILAS的造血干细胞全部为荧光标记细胞。结论筛选获得在造血干细胞中全标记的红色和绿色荧光转基因小鼠,可为造血干细胞体内研究提供有效示踪工具。     

人参皂甙Rb1抑制扩张型心肌病发生中的HB-EGF表达和纤维化

目的HB-EGF过表达可促进心肌纤维化及心肌细胞凋亡,本文研究人参皂甙Rb1对cTnT^R141W转基因扩张型心肌病小鼠发病过程中的HB-EGF表达和心肌纤维化的影响。方法将cTnT^R141W转基因小鼠随机分为模型组和人参皂甙Rb1组（70 mg/kg/d）,连续给药7个月,取野生型小鼠作为对照组。用Kaplan-Meier法进行生存分析。心脏超声检测心功能及心脏几何构型。计算心重指数。光镜观察心肌细胞及间质变化。Western blot检测心脏HB-EGF,pSTAT3表达水平。结果Rb1长期给药能显著改善该模型的心功能和心脏几何构型,将死亡率降低50%。Rb1治疗组心重指数降低11.3%（P〈0.05）,光镜观察显示Rb1能减轻心肌细胞排列紊乱以及间质纤维化。Western blot结果显示Rb1能够显著降低模型中的HB-EGF及pSTAT3的表达。结论Rb1抑制心肌病发生中的HB-EGF表达及抑制下游信号pSTAT的激活,并改善扩张型心肌病模型的心功能及心脏重构。