脑梗死后海马神经元β-APP及其产物与ApoE的表达

目的:应用常规HE染色和免疫组织化学染色方法,观察人脑梗死后海马CA1区和CA3区神经元中β-APP、Aβ1-40、Aβ1-42及ApoE的表达,探讨它们表达变化的时间规律,以期对临床治疗提供可靠的实验资料。方法:分脑缺血组和对照组,脑缺血组按缺血时间分为缺血2h-6h组、7h-24h组、25h-48 h组、49h-72h组、73h-96h组、97h-144 h组和145h-168 h组。采用HE染色方法观察神经细胞损伤情况;免疫组织化学染色检测β-APP、Aβ1-40、Aβ1-42与ApoE在尸检脑标本海马CA1区、CA3区神经元的表达,在显微镜下对免疫组织化学染色阳性细胞计数,实验结果应用SPSS12.0统计软件进行分析。结果:与对照组相比,Aβ1-40的表达在缺血2h后明显增加,73h-96 h达高峰,以后有所回落,但仍高于对照组;β-APP在缺血2 h-6 h表达呈峰值,49 h-96h呈现第二次高峰,96 h以后下降,但仍高于对照组;于缺血24 h后,β-APP和Aβ1-40的增加呈显著的正相关。缺血2 h后,Aβ1-42表达开始增加,25 h-48 h达高峰;缺血6 h后,ApoE表达开始增加,但97 h-144 h为高峰期。结论:人脑梗死后β-APP、Aβ-40和Aβ1-42表达增加,它们可协同加重脑缺血性损伤;而ApoE脑保护作用可能增强。     

H102对APP转基因小鼠脑内淀粉样蛋白和淀粉样蛋白前体蛋白表达的影响

目的:研究H102对APP695转基因模型小鼠脑内淀粉样蛋白和淀粉样蛋白前体蛋白表达的影响方法:9月龄转基因小鼠随机分为模型组和药物注射组,正常对照组采用月龄和性别与之相匹配的C57BL/6J小鼠。药物注射组给予侧脑室注射H102,每只每次3μl,连续10d;模型组和正常对照组给予等体积NS。应用免疫组织化学结合刚果红组织学染色,普通光学显微镜观察海马和颞叶皮层蛋白表达的变化。免疫印迹法检测小鼠大脑皮层APP蛋白的表达。结果:Aβ和APP免疫组化染色结果显示对照组海马CA1区神经元胞浆着色呈阴性或弱阳性,模型组较对照组阳性细胞增多,表达增强,胞浆着色明显加深。药物注射组同模型组相比,胞浆着色变淡,表达减弱。刚果红染色观察转基因小鼠模型组和H102注射组大脑颞叶皮层和海马的淀粉样斑块,可见H102注射组淀粉样斑块数较模型组明显减少。正常对照组未见阳性淀粉样斑块。免疫印迹检测显示模型组APP蛋白表达明显增加,给药组与模型组相比具有统计学意义。结论:APP695转基因小鼠大脑CA1区Aβ蛋白和APP蛋白表达增加,H102能够明显抑制该转基因小鼠Aβ蛋白和APP蛋白表达。     

小鼠全脑缺血模型的海马区基因Fas-L和Caspase-3表达

目的:使用C57black/6 小鼠制造的全脑缺血模型,观察缺血后海马Fas-L和Caspase-3的表达.方法:夹闭双侧颈总动脉15 min,24 h后取脑组织进行Fas-L和Caspase-3免疫组织化学染色.结果:与对照组比较,缺血组海马CA1区Fas-L阳性细胞和Caspase-3阳性细胞细胞数量多,染色深,统计结果差异均显著(P<0.05).结论:C57black/6小鼠全脑缺血模型的海马CA1区Fas-L和Caspase-3表达显著增加.     

淀粉样β蛋白和自由基对扑赡卵母细胞表达的大鼠脑谷氨酸受体功能的影响

目的探讨淀粉样β蛋白(Aβ1-40)和自由基对爪蟾卵母细胞表达的大鼠脑谷氨酸受体(GluR)功能的影响.方法采用Promega试剂盒提取3月龄大鼠脑组织总RNA和mRNA,并将50nl(50ng)的mRNA显微注射到每个爪蟾卵母细胞.注射后的卵母细胞在(19±1)℃条件下以改良的巴氏液孵育进行受体表达.这些表达的受体的激活电流采用双电极电压钳位技术记录.超氧阴离子自由基(SAFRs)和Aβ1-40于记录前12h、24h、96h分别加入孵育液.结果爪赡卵母细胞可以表达出M型ACh、谷氨酸、多巴胺、GABA和5-羟色胺受体.Aβ-40对表达的GluR有抑制效应,其程度依作用时间和浓度而异.20nmol/LAβ1-40作用24h对表达的GluR功能无影响.与SAFRs共同孵育时,20nmol/LAβ1-40作用12h即对表达的GluR功能有明显影响,60nmol/LAβ1-40作用12h即对表达的GluR有明显抑制效应(降低21%,P＜0.05),而60nmol/LAβ-40作用24h下降达52%.维生素E对这些效应有拮抗作用.结论自由基和Aβ对GluR具有抑制效应,该效应能被维生素E拮抗.Aβ可能通过抑制受体功能在AD病理生理学中起作用.     

人参皂甙Rb1对阿尔茨海默病大鼠海马结构β-淀粉样蛋白表达的影响

目的观察人参皂甙Rb1对阿尔茨海默病（AD）模型大鼠学习记忆能力及海马结构β-淀粉样蛋白表达的影响。方法动物分3组：对照组、模型组及治疗组,用D半乳糖联合三氯化铝建立AD大鼠模型,治疗组在造模后给予人参皂甙Rb1腹腔注射4周;采用Morris水迷宫测试大鼠的空间学习记忆能力,用免疫组织化学方法观察海马结构β-淀粉样蛋白的表达。结果与对照组相比,模型组大鼠各时间段的逃避潜伏期均显著延长（P〈0．01）,海马CA1、CA3区及齿状回β-淀粉样蛋白表达的阳性细胞数明显增多（P〈0．01）;治疗组大鼠的逃避潜伏期较模型组明显缩短（P〈0．01）,海马CA1、CA3区及齿状回的β-淀粉样蛋白阳性细胞数显著减少（P〈0．01）。结论人参皂甙Rb1对AD模型大鼠学习记忆损害具有明显改善作用,其机制可能与人参皂甙Rb1减少海马结构β-淀粉样蛋白的表达有关。     

大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤中iNOS在大脑皮层和海马的表达

目的研究局灶性脑缺血再灌注损伤中iNOS在不同脑区的表达.方法用改良的血管内栓线技术制造大鼠局灶性脑缺血与再灌注模型,应用免疫组织化学技术检测脑组织中的iNOS的表达.结果 (1)脑缺血再灌注损伤24h后,缺血组缺血侧大脑皮层、海马CA1区、CA3区神经元iNOS的表达显著增强,与正常对照组比较有显著性差异(P<0.05);(2)脑缺血再灌注损伤24h后,缺血组对照侧大脑皮层、海马CA1区、CA3区神经元iNOS的表达也明显增强,与正常对照组比较有显著性差异(P<0.05);(3) 与对照侧比较,脑缺血再灌注大鼠缺血侧皮质的iNOS表达显著增强(P<0.05),而海马CA1区、CA3区缺血侧的iNOS表达与对照侧相比无显著性差异(P>0.05).结论局灶性脑缺血再灌注损伤后,缺血侧皮层和海马iNOS表达显著升高,未缺血脑区(对照侧)iNOS反应性也较对照组者升高.     

大蒜素对全脑缺血再灌注大鼠脑保护机制的研究

目的：通过大蒜素预处理,观察全脑缺血再灌注大鼠海马区ICAM-1 的表达,从而探讨大蒜素的脑保护机制。方法：雄性 Wistar 大鼠30 只,随机分为5 组：假手术组、缺血再灌注组、缺血再灌注+ 大蒜素10、20、30 mg/kg 组。采用四血管闭塞法制备大 鼠全脑缺血再灌注模型,于再灌注24 h 取出海马,硫堇染色观察海马组织的形态学改变,免疫组织化学染色测定海马CA1 区 ICAM-1 免疫反应阳性细胞面积和积分光密度值。结果：通过给予大鼠全脑缺血8 min 再灌注24 h处理,海马CA1 区组织形态学 改变显著,神经元密度明显降低;ICAM-1的表达显著增加。静脉给予大蒜素可使缺血再灌注海马组织形态学改变明显改善,存活 神经元数目增加,ICAM-1 表达显著较少。结论：大蒜素可以通过减少ICAM-1 的表达抑制全脑缺血再灌注后的炎症损失从而发 挥脑保护作用。     

β淀粉样蛋白1-42对BV-2细胞产生一氧化氮功能的刺激作用

目的应用β淀粉样蛋白1-42(β-Amyloid,Aβ1-42)作用于小胶质细胞(microglia,MG),对MG产生一氧化氮(nitric oxide,NO)的作用进行研究.方法应用高度纯化的BV-2小胶质细胞作为体外小胶质细胞模型,测定加入Aβ1-42后细胞上清NO含量及细胞iNOS酶活力;Western blot法测定Aβ对BV-2细胞iNOS蛋白表达的影响,免疫细胞化学方法对iNOS蛋白的表达情况进行观察.结果 Aβ1-42可以刺激BV-2细胞产生NO、提高细胞iNOS酶活性、增加iNOS蛋白质表达,以上作用均具有时间及浓度依赖性.结论 Aβ1-42在体外可通过提高细胞iNOS酶活性、增加iNOS蛋白质表达而增加NO的分泌,为NO发挥神经元毒性作用创造了条件.     

大肠杆菌表达GST-Aβ_(42)融合蛋白的纯化条件及鉴定

目的:为了提高β-淀粉样蛋白(β-amyloid peptide,Aβ_(42))基因在大肠杆菌中的表达,为深入研究Aβ的作用机制及其疫苗研究奠定基础。方法:大肠杆菌在37℃培养4 h后,以终浓度为1 mmol/L的IPTG在25℃下继续诱导培养2 h,促进GST-Aβ42融合蛋白的可溶性表达。表达产物以SDS-PAGE、Western bloting鉴定。结果:SDS-PAGE表明融合蛋白分子量约为32kD,与预计的一致;Western Blotting进一步分析表明它能与抗Aβ42和抗GST抗体特异反应。结论:GST-Aβ_(42)基因的优化表达为研究Aβ42的作用机理打下了基础,同时也为Aβ42疫苗的研究提供了充分的实验条件。     

大肠杆菌表达GST-Aβ42融合蛋白的纯化条件及鉴定

目的：为了提高β-淀粉样蛋白（β-amyloid peptide,Aβ42基因在大肠杆菌中的表达,为深入研究Aβ的作用机制及其疫苗研究奠定基础。方法：大肠杆菌在37℃培养4 h后,以终浓度为1 mmol/L的IPTG在25℃下继续诱导培养2 h,促进GST-Aβ42融合蛋白的可溶性表达。表达产物以SDS-PAGE、Western bloting鉴定。结果：SDS-PAGE表明融合蛋白分子量约为32kD,与预计的一致;Western Blotting进一步分析表明它能与抗Aβ42和抗GST抗体特异反应。结论：GST-Aβ42基因的优化表达为研究Aβ42的作用机理打下了基础,同时也为Aβ42疫苗的研究提供了充分的实验条件。     

银杏叶提取物对β-淀粉样蛋白致阿尔茨海默病模型大鼠学习记忆的影响及其作用机制研究

目的:研究银杏叶提取物(EGB)对β-淀粉样蛋白(β-amyloid protein,Aβ)致阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD)模型大鼠学习记忆能力的影响及其作用机制。方法:用Y迷宫测定Aβ致AD大鼠学习记忆能力,苏木素-伊红(HE)染色,TUNEL法和免疫组化染色法分别检测其海马CA1区细胞形态学变化,神经元凋亡,Caspase-3P20的表达及Aβ的沉积,并观察EGB的保护作用。结果:Aβ致AD大鼠学习尝试次数明显增加,记忆正确次数明显减少;海马CA1区锥体细胞层损伤严重,可见到较多TUNEL和Caspase-3P20阳性神经元及Aβ阳性物质沉积。而银杏叶各剂量组均有不同程度的改善。结论:Aβ可引起β-淀粉样蛋白致AD大鼠海马CA1区神经元的凋亡,Caspase-3的激活参与了这一过程,而EGb有保护作用并能改善其学习记忆障碍。     

MK801对大鼠脑缺血再灌注后海马CA1区c-fos基因表达及神经元凋亡的影响

目的:研究MK801对大鼠脑缺血再灌注后海马CA1区c-fos基因表达及神经元凋亡的影响。方法:将大鼠随机分为正常对照组、脑缺血再灌注模型组和脑缺血用药后再灌注组,用药组在再灌注前经腹腔注射MK801(0.5mg/kg);分别于再灌注后2、6、24和48 h,采用免疫组化法和Western印迹观察海马CA1区c-fos基因的表达情况。结果:c-fos基因的表达在脑缺血再灌注后2 h即开始增强,至再灌注后6 h达到高峰,24 h表达降低,至48 h又至高峰,但较再灌注6 h后较低。用药组海马CA1区c-fos基因的表达均较模型组的相应时间段降低,具有显著性差异(P<0.01)。结论:海马CA1区c-fos基因在脑缺血再灌注后表达升高,MK801可降低脑缺血再灌注后c-fos基因的表达,对缺血再灌注后的脑组织具有保护作用。     

Aβ25-35诱导大鼠记忆力障碍与海马细胞色素氧化酶活性及线粒体超微结构的变化

目的探讨Aβ诱导模拟人类Alzheimer's病(AD)大鼠模型中海马CA1区细胞色素氧化酶的表达和神经元线粒体超微结构的变化及其与老年性记忆力减退的关系,揭示Aβ对神经元的毒性机制.方法通过将Aβ25-35注射入海马建立阿尔茨海默病动物模型,使用Y形迷宫试验检测大鼠的学习记忆能力,运用酶组织化学方法测定大鼠海马CA1区细胞色素氧化酶活性,应用电镜观察大鼠海马CA1区神经细胞线粒体超微结构的变化.结果与对照组比较,接受Aβ注射的大鼠学习记忆能力降低(P<0.05),线粒体数量及形态发生了明显的变化,海马CA1区脑组织细胞的细胞色素氧化酶活性相对于对照组也有显著的下降(P<0.05).结论 Aβ在神经退行性变中的作用可能与细胞色素氧化酶表达下降及神经元线粒体超微结构的改变导致的细胞能量代谢障碍有关.     

大鼠脑缺血再灌注后海马神经细胞NOS表达与细胞凋亡及复方丹参的保护作用

目的探讨大鼠局灶性脑缺血再灌注后海马神经细胞一氧化氮合酶(NOS)的表达与神经细胞凋亡的关系及中药复方丹参的保护作用。方法采用大脑中动脉内栓线阻断法(MCAO)造成局灶性脑缺血再灌注模型。用原位细胞凋亡检测方法观察海马神经细胞凋亡;用免疫组织化学方法检测大鼠海马神经细胞(nNOS、iNOS)的表达并做图像分析。结果与假手术对照组比较,脑缺血再灌注2h后缺血侧海马CA1、CA3区神经细胞nNOS、iNOS表达升高,并出现神经细胞凋亡,随着再灌注时间的延长,神经细胞iNOS的表达明显增强,凋亡神经细胞数逐渐增多,至24h达高峰,但神经细胞nNOS的表达并未见明显增强。复方丹参保护组神经细胞nNOS、iNOS的表达和凋亡神经细胞数明显低于缺血再灌组(P<0.01)。结论脑缺血再灌注后缺血侧海马CA1、CA3区神经细胞nNOS的表达增强,iNOS的表达显著升高,使NO的形成增加,这可能是介导脑缺血再灌注后神经细胞凋亡的机制之一。复方丹参具有下调神经细胞nNOS、iNOS的表达,减少NO的生成,抑制细胞凋亡,减轻缺血再灌注对大鼠海马损伤的作用。     

丁基苯酞预处理对大鼠脑组织缺血/再灌注后HSP70表达的影响

目的:探讨丁基苯酞预处理对缺血/再灌注大鼠海马迟发性神经元死亡以及热休克蛋白70表达的影响。方法:126只大鼠分为实验对照组(36只)、脑缺血组(36只)、丁基苯酞组(6只)、丁基苯酞+脑缺血组(36只)、槲皮素+丁基苯酞+脑缺血组(6只)、DMSO+丁基苯酞+脑缺血组(6只)。建立大鼠全脑缺血/再灌注模型后。实验对照组、脑缺血组、丁基苯酞+脑缺血组下另加设5个亚组,为手术后6 h、12 h、1 d、3 d、5 d组。用硫堇以及免疫组织化学染色的方法观察丁基苯酞对缺血/再灌注大鼠海马神经元迟发性死亡以及HSP70表达的影响。结果:丁基苯酞预处理可以减轻大鼠全脑缺血/再灌注损伤引起的海马CA1区锥体神经元迟发性死亡,明显增加CA1区HSP70的阳性表达,且持续时间较长(6 h-5 d);应用HSP70抑制剂可以阻断丁基苯酞预处理诱导的大鼠脑缺血耐受。结论:丁基苯酞可能参与脑缺血/再灌注损伤的神经元保护作用,这一作用可能是通过上调HSP70的表达完成的。     

Zn~(2+)对Aβ_(1-40)诱导PC12细胞损伤的保护作用

阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是一种进行性中枢神经系统退行性疾病,也是最常见的老年痴呆症.锌是人体必不可少的微量元素,在大脑海马中含量丰富,若海马中锌含量不足,会出现记忆力减退等症状并最终导致AD.通过MTT法探索不同浓度锌离子作用于Aβ1-40损伤PC12细胞模型的最适浓度,并将实验分为对照组、Aβ损伤组、Aβ损伤前补锌组、Aβ损伤后补锌组、Aβ损伤前同时补锌和锌离子螯合剂TPEN组,通过Hoechst33342荧光染色和Caspase-3活性检测实验分析细胞凋亡情况;通过检测LDH含量分析细胞损伤程度并运用Western blotting方法检测相关蛋白表达量,结果表明锌离子具有保护PC12细胞免受Aβ1-40损伤的作用,并且这种保护作用发生在Aβ损伤作用之前,在Aβ损伤后补充锌作用不明显.这一结论为进一步研究锌离子在AD发生发展中的作用提供了实验依据.     

金属硫蛋白-ⅢmRNA表达与神经元缺血性损伤的关系

目的：探讨大鼠前脑缺血／再灌注后海马结构MT-ⅢmRNA表达变化规律及其与神经元缺血性损伤之间的关系。方法：建立前脑缺血／再灌注模型,用原住杂交法检测海马结构MT-ⅢmRNA表达,并观察缺血后各时相点海马神经元的病理变化。结果：①前脑缺血／再灌注后72h海马CAl区开始出现神经元变性,96h更为明显,7d时CAl区神经元多已坏死;②前脑缺血／再灌注后海马CAl区锥体细胞和齿状回颗粒细胞内MT-ⅢmRNA表达逐渐增加,96h达高峰,7d又降低至缺血前水平。结论：前脑缺血／再灌注后,海马神经元MT—ⅢmRNA表达增加,可能对神经元缺血性损伤产生影响。     

远志皂苷对脑定位注射Aβ1-40拟AD大鼠脑内神经形态病理学变化的影响

目的：建立阿尔茨海默病（AD）的大鼠模型,并观察远志皂苷对AD模型大鼠β-淀粉样蛋白（Aβ）沉积及其神经细胞毒性的影响。方法：在大鼠右侧基底核区定向注射凝聚态Aβ1-40和鹅膏草氨酸建立AD模型,20只AD大鼠分为模型组和远志皂苷组,相同部位注射生理盐水作为假手术组。30天后,采用HE、Nissl、透射电子显微镜和免疫组化染色等方法观察海马区神经细胞形态和基底核Aβ沉积变化。结果：脑内Aβ注射后,模型大鼠海马区神经元数目明显比假手术组减少,基底核Meynert细胞区可见棕黄色斑块沉积。电镜下可见神经元内脂褐质含量增加,线粒体等细胞器出现明显变性改变。结论：凝聚态Aβ1-40基底核定位注射具有明显的在体神经毒性作用,可较好地模拟AD病理表现,远志皂苷对Aβ引起的神经细胞凋亡有明显的保护作用。     

肢体缺血预处理对大鼠海马CA3区和齿状回区p38 MAPK和HSP 70表达的影响

目的:观察肢体缺血预处理(LIP)后大鼠海马CA3区和齿状回区(DG)p38MAPK和HSP70的表达,以进一步探讨CA3区和DG区的缺血耐受机制。方法:96只Wistar大鼠随机分为sham组和LIP组,LIP组进一步分为LIP6 h、LIP 12h、LIP1 d、LIP2d、LIP3 d、LIP4d和LIP5 d亚组。方法:应用免疫组织化学和Western blot方法观察大鼠海马CA3区及DG区p38MAPK和HSP70的表达。结果:免疫组化及Western blot结果显示,与sham组相比,LIP后大鼠海马CA3区及DG区p-p38MAPK及HSP70的表达呈现出动态的变化,其中p-p38MAPK的表达于LIP后1 d明显增加、3 d达到高峰,LIP后4 d逐渐下降;HSP 70的表达则于LIP后2 d明显增加、3 d达到高峰,LIP后4 d逐渐下降。结论:LIP上调了大鼠海马CA3区和DG区p38MAPK和HSP70的表达。     

永久性局灶性中动脉阻断脑缺血（pMCAO）模型大鼠脑内突触相关蛋白表达的免疫组织化学观察

目的观察永久性局灶性中动脉阻断脑缺血（pMCAO）模型大鼠脑缺血发作后2 d、7 d脑内突触相关蛋白表达的变化。方法制作大鼠永久性局灶性中动脉阻断脑缺血（pMCAO）模型。缺血动物术后随机分为缺血2 d组、缺血7 d组,另设假手术组。在术后2 d、7 d 2个时间点采用HE染色观察动物神经病理学改变,同时采用免疫组织化学法观察动物的缺血侧脑组织突触素-I（synapsin-I）、突触后致密蛋白95（PSD-95）、α-突触核蛋白（α-synuclein）表达情况。结果与假手术组相比,缺血后,模型动物神经元大量变性坏死,数目减少,排列散乱。缺血后2 d,synapsin-I在CA1区、CA3区、皮层表达显著减少（P〈0.05或P〈0.01）,PSD-95在CA1区、皮层表达显著减少（P〈0.05或P〈0.01）,α-synuclein在CA1区神经元产生显著积聚（P〈0.01）;缺血后7 d,synapsin-I在CA1区、皮层表达仍显著降低（P〈0.01）,PSD-95在CA1区、皮层表达显著减少（P〈0.05或P〈0.01）,α-synuclein在CA1、CA3、皮层表达显著增加（P〈0.05或P〈0.01）。结论 pMCAO模型大鼠在脑缺血发生后,神经突触有关蛋白的表达显著改变,并随缺血后不同时间点表达情况不同,这可能与神经元突触重塑有关。突触相关蛋白的表达与缺血损伤程度密切相关。