microRNA-122与丙型肝炎病毒复制和肝细胞癌的相关研究进展

microRNA-122(miR-122)是一种肝脏特异性微小RNA,与丙型肝炎病毒(HCV)的复制和感染及肝细胞癌(HCC)的发生密切相关。近年来,科研人员关于miR-122的研究已取得了较大进展。在此,我们就miR-122与HCV复制和HCC的相关关系等方面的研究进展做简要综述。     

MIR-122 慢病毒表达载体构建及稳定转染HepG2 细胞系

目的:构建人mir-122慢病毒表达载体,感染肝癌细胞HepG2,建立稳定表达mir-122的HepG2细胞系。方法:以人has-mir-122成熟序列,设计并合成引物,采用PCR的方法扩增目的基因,并连接到慢病毒表达质粒pGCSIL-GFP(含绿色荧光蛋白GFP基因)中。对重组质粒进行双酶切鉴定后,进行mir-122基因慢病毒(pGCSIL-GFP-miR-122)的包装及病毒滴度测定,用构建好的慢病毒表达载体感染HepG2细胞,qPCR检测感染后细胞中MIR-122的变化。通过流式细胞仪检测荧光蛋白GFP,westernblot检测mir-122靶分子CAT-1,验证pGCSIL-GFP-miR-122在HepG2细胞中的表达效果。结果:pGCSIL-GFP-miR-122经双酶切分析及测序,插入序列正确。qPCR检测显示转入病毒后mir-122在细胞中的表达显著提高。表明mir-122慢病毒表达载体构建成功。流式细胞仪根据GFP荧光筛选纯化感染后细胞,感染率达90%以上。Western blot显示mir-122明显抑制其靶分子表达。进一步验证pGCSIL-GFP-miR-122在细胞中的稳定表达。结论:成功构建mir-122慢病毒表达载体,并建立稳定表达的细胞系,为研究mir-122在人体所起的作用及功能机制打下基础。     

MIR-122 慢病毒表达载体构建及稳定转染HepG2 细胞系

目的:构建人mir-122慢病毒表达载体,感染肝癌细胞HepG2,建立稳定表达mir-122的HepG2细胞系。方法:以人has-mir-122成熟序列,设计并合成引物,采用PCR的方法扩增目的基因,并连接到慢病毒表达质粒pGCSIL-GFP(含绿色荧光蛋白GFP基因)中。对重组质粒进行双酶切鉴定后,进行mir-122基因慢病毒(pGCSIL-GFP-miR-122)的包装及病毒滴度测定,用构建好的慢病毒表达载体感染HepG2细胞,qPCR检测感染后细胞中MIR-122的变化。通过流式细胞仪检测荧光蛋白GFP,westernblot检测mir-122靶分子CAT-1,验证pGCSIL-GFP-miR-122在HepG2细胞中的表达效果。结果:pGCSIL-GFP-miR-122经双酶切分析及测序,插入序列正确。qPCR检测显示转入病毒后mir-122在细胞中的表达显著提高。表明mir-122慢病毒表达载体构建成功。流式细胞仪根据GFP荧光筛选纯化感染后细胞,感染率达90%以上。Western blot显示mir-122明显抑制其靶分子表达。进一步验证pGCSIL-GFP-miR-122在细胞中的稳定表达。结论:成功构建mir-122慢病毒表达载体,并建立稳定表达的细胞系,为研究mir-122在人体所起的作用及功能机制打下基础。     

与HBV感染可能有关的microR-122的筛选及其作用的靶点预测

应用基因芯片技术筛选到与HBV感染可能有关的microRNA——miR-122,利用计算机软件分析预测microR-122作用HBV的可能靶点。分析结果认为miR-122与HBV的感染可能有关,并且作用靶点可能为HBV1689-1711nt。     

血浆microRNA与HIV感染及治疗关系的研究

本次研究分析了Ⅰ型艾滋病病毒(HIV-1)感染者血浆中miRNA表达特点,探讨了血浆miRNA作为HIV-1感染及治疗监测生物学标志物的潜在可行性。选取2017年7月-2018年7月期间在昆明市第三人民医院就诊的HIV-1感染未经抗病毒治疗患者50例作为未治疗组,HIV-1感染经抗病毒治疗患者50例作为治疗组,选取同期本院健康体检者50例作为对照组,应用qPCR技术检测三组对象血浆miR-29a、miR-122,miR-155的相对表达量。结果显示,与健康对照组相比HIV-1感染未经抗病毒治疗组血浆miR-29a、miR-155、miR-122表达均升高,差异有统计学意义(P<0.05);未治疗组与治疗组相比较血浆miR-29a、miR-155和miR-122表达均升高,差异有统计学意义(P<0.05)。对未治疗组的研究显示,血浆miR-29a、miR-155表达水平与HIV-1RNA病毒载量呈正相关(P<0.05),miR-122与HIV-1RNA病毒载量无显著相关(P>0.05),miR-29a、miR-155表达水平与CD4;T细胞计数呈负相关(P<0.05)。本研究提示HIV-1感染后血浆miRNA有变化,血浆miR-29a、miR-122,miR-155与HIV-1感染相关,可能是HIV-1感染的潜在生物学标志物。而抗病毒治疗可以诱导miR-29a、miR-155和miR-122表达降低,这些miRNA可能具有成为监测HIV-1感染抗病毒治疗效果观察指标的潜在价值。未治疗组血浆miR-29a、miR-155与HIV-1RNA呈正相关,表明其与HIV-1病毒复制相关。     

复方黄柏液联合制霉菌素外用治疗念珠菌性龟头炎的临床疗效观察CSCD

包皮龟头炎是由多种因素引起的男性包皮和龟头炎症性皮肤疾病,念珠菌是常见的感染因素之一。当机体抵抗力下降或某些因素导致局部菌群失调时,原本是条件致病菌的念珠菌会大量繁殖引起念珠菌性龟头炎。近年来由于广谱抗生素及皮质激素的广泛应用,包皮龟头炎的发病率持续升高[1],我们选取了上海市皮肤病医院2018年6月—2019年5月门诊的念珠菌性龟头炎122人,给予复方黄柏液联合制霉菌素片外用治疗,收到了良好的效果,现汇报如下。     

结核分枝杆菌持续感染相关基因及其调控网络分析

结核分枝杆菌是结核病的致病菌, 也是迄今最成功的人类致病菌之一. 结核分枝杆菌能逃避宿主免疫攻击, 在人体内持续感染或呈休眠状态. 当人体免疫功能低下时, 持续感染或休眠的致病菌可能被重新激活. 结核分枝杆菌的持续感染是制约结核病控制计划成功的主要障碍之一. 揭示结核分枝杆菌持续感染的分子机制、寻找其中薄弱环节、发现适当的药物靶标并开发全新药物及免疫干预措施, 被认为是遏制结核病蔓延的关键. 结核分枝杆菌持续感染和再激活是众多基因协同的系统适应过程. 本文在全面分析全球结核分枝杆菌持续感染相关基因研究文献的基础上, 通过文本挖掘, 综合本实验室前期研究结果, 提出了结核分枝杆菌持续感染相关基因的调控网络, 为揭示结核分枝杆菌持续感染的机制, 筛选控制结核病的新靶标和免疫干预节点提供研究基础.     

沙眼衣原体基因CT703在HeLa细胞中的表达

本文旨在探讨沙眼衣原体( Chlamydia trachomatis, Ct) L2 血清型感染HeLa细胞后, 在急性感染和持续感染状态下基因CT703 mRNA 表达水平的变化。透射电子显微镜下确定Ct 急性感染和持续感染模型的建立; 吉姆萨染色显示, 细胞内包涵体体积增大且出现异常增大的网状体, 反转录-聚合酶链反应( RT-PCR) 检测显示, 持续感染状态下Ct 基因CT703 mRNA表达水平显著低于急性感染状态, 推测这可能是Ct 在细胞内持续感染的形成机制之一。     

微小RNA-122对丙型肝炎病毒复制及感染治疗影响的研究进展

丙型肝炎病毒(HCV)感染后易演变为慢性肝炎,甚至进展为肝硬化、肝癌。目前尚无有效的预防疫苗,抗病毒药物的疗效也较局限。因此,直接靶向抗病毒且无毒副作用的治疗方法是目前研究的重点。微小RNA(miRNA)是一类小分子非编码RNA,主要通过下调宿主基因表达而发挥生物学功能。miRNA-122(miR-122)在HCV感染中的作用受到关注,探讨其影响HCV复制的具体分子机制对将其作为抗病毒治疗的一个靶目标、研发新型靶向抗HCV治疗药物有重要意义。本文主要就miR-122对HCV复制的影响及其成为潜在治疗靶点的研究现状作一综述。     

肝癌患者血清乙肝病毒特异性miRNAs水平指标检测与术后肿瘤复发的相关性研究

目的:HBV感染患者血清中HBV相关miRNAS的表达水平会出现变化,分析乙肝病毒特异性miRNAs在乙肝肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)患者血清中的表达水平与术后肿瘤复发的关系.方法:采用实时荧光定量RT-PCR (Real-time RT-PCR)检测38例乙肝肝癌患者手术前后血清乙肝病毒特异性miRNAs(miR-122和miR-22)的表达.分析血清乙肝病毒特异性miRNAs的袁达水平与肝癌切除术后的预后与复发的关系.结果:乙肝肝癌患者血清miR-122和miR-22明显高于良性肝病和正常对照组(P＜0.01).手术前后血清miR-122和miR-22的表达差异显著(P＜0.01).乙肝肝癌患者血清miR-122和miR-22表达的高低与HBVDNA、肝硬化、AFP、肿瘤大小、病理分化、TNM分级有关(P＜0.05).血清miR-122和miR-22低表达组的复发转移率显著低于高表达组(P＜0.01).结论:miR-122和miR-22在乙肝肝癌患者血清中表达上调与肝癌复发转移率高和预后差密切相关,提示其可能是一个潜在的HCC预后分子标志物.     

广西巴马小型猪miR-122慢病毒表达载体的构建及胚胎水平表达

本实验的目的在于构建PLV-miR-122慢病毒载体并在293T细胞和猪胚胎细胞中进行验证。以广西巴马小型猪基因组DNA为模板,克隆miR-122前体及部分侧翼序列,利用T4连接酶将其连入PLV-CMV-MCS-EF1载体,构建PLV-miR-122慢病毒载体。在293T细胞中过表达PLV-miR-122,通过胞质注射生产转PLV-miR-122的猪胚胎。双酶切和测序结果证明成功构建了PLV-miR-122重组载体,将重组载体转染293T细胞,经胞质注射后观察到其在猪胚胎早期和囊胚期均有绿色荧光表达。本实验成功构建了猪miR-122慢病毒表达载体,在293T细胞中过表达同时生产出转miR-122的阳性胚胎,为后续研究miR-122的功能奠定基础。     

人肝脏特异性miR-122表达载体的构建及鉴定

人肝脏特异性miRNA-122是肝脏中表达丰度最高的miRNA。为研究该miR-122的生物学功能,从HepG2细胞基因组中用PCR的方法扩增了miR-122的前体,构建了miR-122的表达载体pLMP-miR-122。pLMP-miR-122质粒转染人正常肝细胞系L-O2和肝癌细胞系HepG2后,细胞内成熟miRNA-122的表达量显著增加。该质粒与HBV1.3共转染HepG2细胞72h后,HBV的HBs和HBe蛋白水平的表达量均下降,说明miRNA-122参与了HBV基因的复制和表达的调控,为进一步研究miRNA-122的功能和其他一些肝病如HCC的调控机制打下基础。     

宫颈HPV16持续感染阶段宫颈P16和Ki67的表达及其与宫颈癌变的关系

目的:探讨宫颈人乳头状瘤病毒(HPV)16持续感染阶段宫颈P16和Ki67的表达及其与宫颈癌变的相关性。方法:采用P16/Ki67免疫组化双染法检测102例HPV16持续感染者、136例非持续感染者宫颈组织P16、Ki67蛋白的表达,并根据免疫组化结果分组为双染阳性组、双染阴性组。所有患者随访观察2年,比较两组患者的结局及宫颈癌前病变的发生率。结果:P16、Ki67及P16/Ki67双染的阳性率分别为40.3%、44.5%及34.0%,HPV16持续感染患者P16、Ki67及P16/Ki67双染的阳性率均显著高于非持续感染患者(P0.05)。HPV16持续感染患者的P16、Ki67蛋白表达呈显著正相关(P0.05)。HPV16持续感染患者中,双染阳性组的病情持续和进展比例明显高于双染阴性组,也明显高于HPV16非持续感染(双染阴性组、双染阳性组)患者(P0.05)。HPV16持续感染患者中,双染阳性组进展为HSIL及以上病变发生率为32.5%(13/40),显著高于双染阴性组6.5%(P0.05)。结论:P16,Ki67双染阳性在HPV16持续感染阶段与宫颈上皮内病变疾病进展成正相关,对HPV16持续感染进展为宫颈高度病变有预警价值,可作为HPV16阳性早期治疗的敏感指标。     

铜绿假单胞菌新基因PA0058插入失活对氨基糖苷类抗生素耐药性的影响

【目的】铜绿假单胞菌是一种重要的条件致病菌,临床上常引起难治性和顽固性感染,随着各种抗生素的广泛使用,该菌对多种抗生素呈现耐药性,研究其耐药性机理有着重要意义。【方法】以一株临床分离株Pseudomonas aeruginosa PA68作为出发菌株,应用人工Mu转座技术构建突变文库并从中筛选得到一株对链霉素抗性明显增强的菌株M122,并对突变株M122进行测序分析及表型检测。通过Southern杂交实验证实转座子是否为单拷贝插入,对突变株M122的基因表达谱与野生型PA68菌株进行对比分析。【结果】确定了Mu转座子在M122基因组上为单拷贝插入,插入位点为基因PA0058的第214 bp处。对M122进行表型检测,发现其对多种氨基糖苷类抗生素的耐药性均得到增强,通过转入携带完整基因PA0058的表达质粒可以使突变株M122的耐药性有所降低,利用同源重组的方法,在模式菌株P.aeruginosa PAK中进行PA0058基因敲除,得到的敲除株具有链霉素耐药性升高的表型。基因PA0058的缺失引起多种基因表达水平改变,尤其是katB、ahpC、ahpF等抗氧化酶基因转录表达显著增高。【结论】首次发现铜绿假单胞菌PA0058基因的插入失活提高了细菌对氨基糖苷类抗生素的耐药性,且导致突变株M122中抗氧化酶基因转录表达水平的上调。     

合成乙型肝炎表面抗原肽段的结构与抗原性

本文对合成的乙型肝炎表面抗原肽段的结构与抗原性进行了研究。通过对三种亚型共9个合成肽段的抗原性测定和结构分析,我们证实了在乙型肝炎表面抗原(HBsAg)氨基酸顺序的122-137区域存在着共同决定簇“a”,且半胱氨酸残基对抗原性有很大的影响。合成的16肽P_(122-137)的两个半胱氨酸残基用叔丁基保护时,其抗原性几乎检测不到,一旦去掉保护基并氧化成分子内S—S键后,抗原性明显增加。比较各种亚型肽段的抗原性测定结果,我们发现亚型决定簇d(或y)的位置可能在122—132之间。另外我们发现P_(adw)122—132的抗原性要比P_(adr)122-137的抗原性强,结构分析结果表明adw型中的Asn_(132)可能对此有较大的贡献。     

猪瘟病毒野毒株持续感染细胞模型的建立

采用猪瘟病毒野毒珠（ＣＳＦＶ３９）感染猪肾传代细胞系ＰＫ－１５,经连续传７９代,建立了稳定的病毒持续感染细胞模型,获得ＣＳＦＶ３９－ＰＫ１５细胞株。用免疫荧光、ＲＴ－ＰＣＲ检测、透射电镜跟踪观察了ＣＳＦＶ３９－ＰＫ１５细胞株连续传代中病毒在细胞内的存在情况。结果表明第９,２９,７９代细胞仍有猪瘟病毒存在,表现出病毒持续感染的基本特征。这为深入研究猪瘟病毒持续感染机理奠定了基础。     

沙眼衣原体感染活化NOD1信号通路的研究

目的:探索沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis,Ct)持续感染状态下,NOD1、IL-6及STAT3分子的表达情况和相互关系。方法:利用HeLa229细胞或STAT3基因沉默的HeLa229细胞,分别建立沙眼衣原体的急性感染和持续感染模型;应用Western Blot及ELISA等方法检测不同感染状态下STAT3及NOD1蛋白表达水平以及细胞因子IL-6的分泌水平。结果:HeLa229细胞在Ct感染状态下,STAT3和NOD1以及IL-6表达水平均升高,且于持续感染状态下的升高较急性感染状态下的升高更明显;沉默STAT3基因后,Ct感染的细胞NOD1及IL-6的表达水平下降明显。结论:HeLa229细胞在Ct持续感染状态下,STAT3能上调NOD1及IL-6表达水平,上述分子间存在NOD1-IL-6-STAT3正反馈信号通路。     

杆状病毒在昆虫中的持续感染

杆状病毒（Baculovirus）是一类特异性感染节肢动物的环状双链DNA病毒,是野外控制害虫种群的重要生物因子,并已被开发为一种生物杀虫剂加以应用。杆状病毒感染昆虫宿主并不一定导致昆虫死亡,其持续感染（persistentinfection）在昆虫种群中普遍存在,且在某些刺激条件下,持续感染可被激活为增殖性感染并引发病毒流行病爆发。因此,杆状病毒持续感染对昆虫种群动力学以及病毒流行病学的研究具有重要意义。     

棉铃虫单粒包埋核型多角体病毒在细胞系中持续感染的建立和特性栽

棉铃虫单粒包埋核型多角体病毒(Helicoverpa armigera single nucleocapsid nucleopolyhedrovirus,HaSNPV)能够在棉铃虫蛹卵巢细胞素SFE-HA-8212中有效复制,引起细胞解体死亡.通过培养HaSNPV感染后残存的细胞,建立了一株持续感染的细胞.该细胞在传代培养的6个月时间内(约25次传代),持续地释放有感染力的病毒粒子,培养液中病毒的效价多在104 TCID50/ml上下,同时有一小部分细胞(1%左右)中形成多角体,释放病毒的细胞占总细胞数的1.0%～3.8%.持续感染细胞的生长特性与原细胞系相比有一定的变化,对HaSNPV感染的敏感性有所降低.另一方面,持续感染细胞所释放的病毒对SFE-HA-8212及棉铃虫幼虫的感染力也有所降低.讨论了持续感染的可能机制.     

猪瘟病毒野毒株持续感染细胞模型的建立

采用猪瘟病毒野毒珠(CSFV39)感染猪肾传代细胞系PK-15,经连续传79代,建立了稳定的病毒持续感染细胞模型,获得CSFV39-PK15细胞株.用免疫荧光、RT-PCR检测、透射电镜跟踪观察了CSFV39-PK15细胞株连续传代中病毒在细胞内的存在情况.结果表明第9,29,79代细胞仍有猪瘟病毒存在,表现出病毒持续感染的基本特征.这为深入研究猪瘟病毒持续感染机理奠定了基础.