随机扩增多态性技术联合荧光定量高敏检测三种疱疹病毒方法的建立

目的:建立一种随机扩增多态性技术(RAPD)联合荧光定量聚合酶链式反应(q PCR)高敏定量检测单纯疱疹病毒(HSV)、人类巨细胞病毒(HCMV)、水痘带状疱疹病毒(VZV)的新方法。方法:根据文献筛选出数十条随机引物,分别对三种疱疹病毒进行随机扩增,产物经2%琼脂糖凝胶电泳,选取稳定清晰条带进行分离、纯化及克隆测序,应用blast-nr比对genebank现有病毒序列,选取高于99%匹配度的基因序列作为目的片段,并在其内部用primer3.0设计特异性内引物。经过引物筛选及条件优化后建立RAPD联合q PCR检测新方法,分别检测三种疱疹病毒。结果:经过筛选,确定了HSV、HCMV、VZV扩增灵敏性及特异性最好一组引物,建立的RAPD-q PCR可分别检测出1:10~6 HSV、1:10~5 HCMV和1:10~5 VZVDNA,而单一q PCR仅能检测1:10~3 HSV、1:10~2HCMV和1:103 VZVDNA。RAPD-q PCR相比于单一q PCR灵敏性提高100-1000倍,RAPD-q PCR扩增大于1:10~5病毒DNA得到的CT值均小于22.96±0.81,与10~2 copies/μL的标准线相距远,易于区分阴性和阳性。此外,用乙型肝炎病毒及疱疹病毒互为对照未见非特异扩增,特异性好。结论:随机扩增多态性技术联合荧光定量是一种检测三种病毒高度灵敏及特异的检测方法。     

分析艾滋病卡波济氏肉瘤活检组织中及外周血淋巴细胞样品中人巨噬细胞病毒转化的DNA序列(英文)

美国华盛顿乔治城大学医学中心微生物系LeonardJ.Rosenthal教授,长期从事CMV,HSV,VSV的感染,复制,转化及其DNA序列等分子病毒学的研究。近来他开展AIDS的研究工作,特别是研究CMV,HSV对AIDS的发病关系,在美国颇有声誉。本文是作者通过人的卡波济氏肉瘤(KS)组织活俭及外周血淋巴细胞(PBL)的核酸分子杂交,以研究HCMV在AIDS发病过程中的作用。为了更好地保持作者原意,促进国际学术交流,本文以原文发表。     

利用酵母双杂交系统筛选与人巨细胞病毒皮层蛋白pUL23相互作用的病毒编码蛋白

人巨细胞病毒(HCMV) UL23基因编码病毒皮层蛋白,该基因缺失时,病毒在人包皮成纤维细胞(HFF)中的繁殖速度加快.为进一步阐述HCMV UL23基因编码产物 pUL23的功能及调控机制,采用鸟枪法构建了融合于GAL4活性区域的HCMV Towne株 基因组随机表达文库.利用酵母双杂交技术,以pGBKT7 -UL23为诱饵质粒,从构建 的HCMV基因组表达文库中筛选到与pUL23相互作用的病毒编码蛋白pUL24. GST-pull down实验和免疫共沉淀实验进一步确认两种病毒蛋白之间的相互作用.结果 表明,构建的HCMV基因组表达文库能够用于GAL4酵母双杂交系统筛选与诱饵蛋白相互作用的病毒自身编码蛋白.病毒蛋白pUL23和pUL24之间具有相互作用,这为进一 步阐述pUL23在HCMV感染过程中的功能提供依据.该研究为揭示HCMV病毒感染机制奠定了基础.     

HSV1 ICP22对HCMV主要即刻早期启动子结构的效应分析

人巨细胞病毒 (human cytomegalovirus, HCMV)主要即刻早期(major immediate-early, MIE)启动子具有很强的转录启动能力, 其顺式调控元件在这一区域形成多次重复的特殊结构, 而这些元件及其组合方式在转录启动过程中的生物学意义尚不清楚. 实验发现HSV1即刻早期蛋白ICP22能对多种病毒及细胞启动子及增强子发挥极强的转录抑制作用, 利用CAT(氯霉素乙酰转移酶)报道基因系统检测ICP22对各种不同的HCMV即刻早期基因启动子结构元件及突变体转录活性的影响显示: 尽管各种元件在ICP22存在的情况下表现出了各自独特的转录效应, 但它们组合后形成的不同突变体以及完整的HCMV启动子所表现的转录效率又不是这些元件功能的简单叠加, 并且其特定的组合方式能够拮抗ICP22的作用. 因此, 可以认为, HCMV主要即刻早期基因启动子能以特别的方式与细胞和病毒的转录因子共同调控其下游基因的表达     

I型单纯疱疹病毒胸苷激酶真核表达载体的构建及其表达鉴定

为构建单纯疱疹病毒I型胸苷激酶(HSV1TK)的真核表达载体pcDNA3.1-EGFP/HSV1TK,鉴定其在真核细胞中的表达和功能.以pORF-HSV1TK为模板,PCR扩增的目的基因HSV1TK片段与pMD18-T载体相连接构建重组克隆pMD18-T/HSV1TK.再双酶切出HSV1TK片段,插入pcDNA3.1-EGFP多克隆位点,构建pcDNA3.1-EGFP/ HSV1TK真核表达载体并进行酶切、测序鉴定[1].分别用荧光显微镜观察和RT-PCR方法检测脂质体介导pcDNA3.1-EGFP/ HSV1TK在卵巢癌细胞SKOV3的表达;分别用MTT法和光镜检测胸苷激酶/丙氧鸟苷(HSV1TK/GCV)系统对SKOV3体外杀伤作用及旁观者效应.结果表明,重组载体酶切鉴定结果与预期结果一致,基因序列与GenBank上报道的HSV1TK基因序列完全一致.荧光显微镜观察转染后的细胞发出绿色荧光;RT-PCR结果表明HSV1TK基因能在SKOV3内有效表达.MTT和光镜结果显示转染HSV1TK基因的SKOV3细胞,加入前体药物丙氧鸟苷(GCV)处理后对其有明显的杀伤作用和旁观者效应.成功构建的真核表达载体pcDNA3.1-EGFP/ HSV1TK能在SKOV3细胞中稳定表达,且HSV1TK对卵巢癌细胞株SKOV3体外有强大的杀伤作用和旁观者效应.     

HCMV感染对恶性胶质瘤U87细胞增殖及ATF5表达的影响

人巨细胞病毒(HCMV)能够诱导肿瘤细胞的恶性转化,但其分子机制尚有待进一步探索。探讨HCMV是否通过调控转录激活因子5(ATF5)的表达变化促进胶质瘤细胞的增殖。采用HCMV AD169株(MOI=5)感染神经胶质瘤U87细胞株,MTT方法观察HCMV感染0、12、24、48 h后细胞的增殖活性。Real-time PCR及Western-blot检测HCMV感染U87细胞后ATF5基因及蛋白的表达水平变化。以慢病毒为载体的靶向ATF5小干扰RNA构建载体,敲低ATF5表达水平后感染HCMV,MTT检测病毒感染细胞的增殖活性变化。HCMV感染神经胶质瘤U87细胞后,与未感染组比较,增值活性明显升高(P0.05),ATF5表达水平上升,表明HCMV感染使胶质瘤细胞增殖活性提高,细胞抗凋亡能力增强。成功构建沉默ATF5细胞系siATF5 U87,HCMV感染siATF5 U87细胞后使细胞增殖活性减弱,抗凋亡能力下降。以上实验结果表明,HCMV感染上调胶质瘤U87细胞ATF5的表达水平,促进细胞的增殖。因此HCMV感染可能通过调控ATF5信号通路增加细胞恶性性状,为治疗胶质瘤提供一个新的思路。     

人巨细胞病毒感染与乳腺癌关系的研究进展

人巨细胞病毒(human cytomegalovirus,HCMV)是β疱疹病毒家族成员,全世界70%以上人口感染过该病毒。HCMV通常以潜伏感染形式存在于宿主体内,并产生了逃避宿主免疫系统识别和清除等多种能力,可通过表达HCMV基因及蛋白发挥肿瘤调节作用,干扰细胞代谢过程,促进肿瘤的发生和发展。乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一,而HCMV在非肿瘤和乳腺癌患者乳腺上皮细胞中的阳性检出率较高,同时有研究表明晚期暴露于HCMV可引起乳腺癌。近期新型抗HCMV药物对乳腺癌靶向治疗的临床有效性也再次提示,HCMV可能与乳腺癌的发生和发展密切相关。本文主要综述了HCMV的致癌潜能及其与乳腺癌发生和发展的潜在关联。     

人巨细胞病毒pp150抗原区的原核表达及初步应用

人巨细胞病毒(human cytomegalovirus,HCMV)感染人体可引起广泛的临床症状,尤其是孕妇和免疫缺陷病人感染HCMV可产生严重的危害[1].传统的减毒活疫苗使用后可能会造成宿主机会性感染或导致肿瘤,因而限制了它的应用.与亚单位疫苗相比,DNA疫苗具有易于构建和制备、稳定性高等特点.多种HCMV病毒蛋白可刺激机体产生相应的抗体,但应选用免疫原性强、特异性好的蛋白抗原基因制备HCMVDNA疫苗.国内外的研究证实[2-5],HCMV的pp150蛋白具有较强的免疫原性.我们用RT-PCR方法扩增了pp150 420～752氨基酸之间多肽片段的编码基因,克隆至原核表达载体,构建了表达pp150抗原决定簇区的工程菌.     

宫颈癌研究新进展

宫颈癌是威胁女性健康的最常见的主要恶性肿瘤之一,据统计全世界每年新发现有数万女性患有宫颈癌这种癌症,越来越多的妇女死于宫颈癌。宫颈癌也是一种预防的肿瘤,其致病因素多种多样,包括初次性生活的年龄、吸烟、HPV、HSV、HCMV、EBV等因素。目前的检测方法有巴氏涂片法、薄层液基细胞学涂片法、宫颈组织活检及宫颈管刮术、HPV-DNA检测、计算机辅助细胞学检测系统等方法可以诊断宫颈癌。早期诊断、早期检查对宫颈癌的预防和治疗具有积极作用,同时降低宫颈癌的死亡率。     

HSV-IgM人-鼠嵌合抗体制备及稳定细胞株构建工艺开发

为实现体外大规模制备单纯疱疹病毒HSV-IgM(HSV1,HSV2)人鼠嵌合抗体,本研究通过RNA连接酶介导的cDNA末端快速扩增(RNA ligase-mediated rapid amplification of cDNA ends,RLM-RACE)技术获取其对应杂交瘤细胞基因序列,构建嵌合抗体至真核表达载体,在CHO-S细胞中稳定表达所需目的蛋白。同时优化稳定细胞株筛选工艺,对细胞池构建阶段和单克隆筛选阶段的加压条件进行摸索与探究,最后目的抗体采用蛋白L亲和纯化法进行纯化并进行生物活性检测;最终成功制备899 kDa和909 kDa的稳定高表达重组IgM抗体(HSV1,HSV2)细胞株。结果表明,最适筛选压力为20P200M(一轮加压)和50P1000M(二轮加压);使用加压培养基进行单克隆筛选抗体表达量较高,HSV1-IgM和HSV2-IgM单克隆最终表达量分别为1620 mg/L和623 mg/L。本研究为HSV1和HSV2的IgM系列重组抗体质控品开发以及体外高表达分泌IgM亚型抗体提供理论与实践基础。     

控制人巨细胞病毒感染的策略

人巨细胞病毒（HCMV）感染对免疫受损人群危害极大,本综述了目前控制HCMV感染的策略,其中包括药物控制和免疫控制。阐述了使用药物控制HCMV感染的效果,疫苗在控制HCMV感染及引发疾病方面的作用及通过被动免疫控制HCMV感染的现状与进展。对这些策略的了解对控制HCMV感染具有重要意义。     

单纯疱疹病毒基因组的限制性核酸内切酶分析

为了获得单纯疱疹病毒(HSV)基因组的限制性核酸内切酶(RE)分析资料和选择合适的RE去研究HSV感染,用11种常用的RE对HSV两个型别的实验室标准毒株的基因组分别作了分析。比较研究的结果表明,BamHI、HpaI和PstI等RE较适于HSV的研究和分型。本研究所采用的小量提取HSV DNA的方法具有快速、简便和实用的特点,值得在HSV感染的诊断、分型和HSV分子流行病学诸研究中推广使用。     

BST-2参与HCMV感染诱导的恶性胶质瘤细胞增殖和迁移

为探讨BST-2蛋白是否参与人巨细胞病毒(HCMV)感染导致的恶性胶质瘤细胞增殖和迁移,以HCMV AD169株感染U251细胞,通过细胞划痕愈合实验检测HCMV感染对U251迁移的影响;通过Western-blot方法检测HCMV感染对BST-2蛋白表达的影响;通过CCK-8、细胞划痕愈合和transwell方法检测HCMV感染后下调BST-2对U251细胞增殖和迁移能力的影响。结果显示,HCMV感染可促进U251细胞迁移并高表达BST-2,沉默BST-2后可抑制由HCMV感染诱导的细胞增殖和迁移。结果证实HCMV感染可促进胶质瘤细胞U251增殖迁移,BST-2参与了HCMV感染导致的恶性胶质瘤细胞增殖和迁移。     

疱疹病毒糖蛋白介导的与宿主细胞膜融合的分子机制

疱疹病毒是一种由双链DNA病毒组成的大家族,包括α-、β-和γ-三个亚科,其糖蛋白gB、gH和gL形成细胞融合的"核心融合机制"。有些疱疹病毒还需要其他糖蛋白(HSV的gD、EBV的gp42和HCMV的gO、UL128-131)的调节作用,促进细胞融合。而糖蛋白gM或gM/gN却对细胞融合具有抑制作用。本文对疱疹病毒糖蛋白介导的细胞融合机制进行阐述,为进一步研究病毒致病机理提供一定的理论依据。     

GS介导RNase P对人巨细胞病毒ul54基因mRNA的切割作用

引导序列(Guide Sequences,GSs)是与mRNA靶序列互补并引导RNase P切割的小RNA片段。设计与人巨细胞病毒HCMV(Human Cytomegalovirus,HCMV)ul54基因D片段mRNA序列互补的GS,将其共价结合到大肠杆菌来源RNase P催化核心M1 RNA,构建成T7-M1GS核酶。通过对ul54基因D片段转录产物体外切割实验和将T7-M1GS构建在含有U6启动子的逆转录病毒载体,与构建在真核载体pEGFP-N1的ul54基因D片段共转染人宫颈癌细胞系HeLa的体内切割实验,证实该核酶具备对ul54基因D片段mRNA的特异切割能力,为利用核酶治疗HCMV感染提供实验基础。     

HSV-tk基因逆转录病毒重组体的构建与DNA序列分析

目的　构建含有单纯疱疹病毒Ⅰ型胸苷激酶 (HSV1 tk)基因的逆转录病毒重组载体pLXSN TK。方法设计一对寡核苷酸引物 ,用PCR方法从质粒pHSV10 6中特异扩增HSV tk基因片段 ( 1168bp) ,分别用BamHI和Eco RI酶切后 ,定向连接到质粒pLXSN中 ,转化宿主菌TG1,分别用上述内切酶 ,PCR和DNA测序鉴定重组质粒。结果　酶切鉴定所切下的片段和PCR扩增的片段大小均与预计相符 ,测序结果与文献报道序列及预计结果一致 ,证实符合表达框架。结论　成功构建了HSV tk嵌合重组质粒pLXSN TK。     

人巨细胞病毒与肿瘤研究进展

人巨细胞病毒（HCMV）是目前已知最大的β疱疹病毒。HCMV感染具有持续性和潜在性,感染率在全世界范围内都很高,并随着年龄的增长而升高,女性感染率高于男性,其主要的传播途径有垂直传播和性传播等。近年来的研究显示在人类胶质瘤、结直肠癌、乳腺癌和前列腺癌及小细胞型肝癌等多种类型的肿瘤组织中都存在HCMV感染和病毒基因表达,并与肿瘤的恶性程度有相关性,这提示HCMV可能在人类某些类型肿瘤的形成和发展过程中扮演重要角色,有可能成为一种新的人类肿瘤相关病毒。HCMV基因产物可通过多种细胞信号通路抑制细胞凋亡、促进细胞增殖、侵袭、转移和血管生成,并形成独特的免疫逃避机制对抗机体免疫反应。深入研究HCMV与肿瘤的病因学关系及其作用机制,可为肿瘤的临床防治提供新思路。     

单纯疱疹病毒

<正>单纯疱疹病毒(HSV)是引起急性疱疹性齿龈口炎、口唇疱疹、咽扁桃腺炎、皮炎、生殖器疱疹、角膜结膜炎、脑炎、脑脊膜炎和新生儿疱疹等疾病的病原体,分为1型(HSV—1)和2型(HSV—2)。由于近年来出现了与初感染年龄上升相伴的重度初感染者增加的倾向,并开发了可用于治疗的acyclovir等抗病毒制剂,所以对HSV感染症早期诊断的重要性提高了。 在HSV感染症中,像口唇疱疹,典型生殖器疱疹等具特征性症状时,仅由临床所见便可确诊。但在皮疹中,HSV感染症需与水痘、带状疱疹病毒感染症等鉴别诊断,对脑炎、脑脊膜炎等由外表不能观察的病变也要进行实验室诊断。 在对HSV感染症迅速而简便的实验室诊断法中,有利用单抗的直接萤光抗体法。但在检样少或检样中蛋白等杂质多时往往难以检测到病毒抗原。     

人巨细胞病毒相关肿瘤调节作用的研究新进展

人巨细胞病毒(HCMV)可感染肿瘤细胞,并增加肿瘤恶性程度.最近一些研究者对恶性胶质瘤患者的临床研究发现,HCMV感染的肿瘤细胞数量与肿瘤的恶性程度有关.HCMV通过影响细胞周期进展、阻断受感染细胞凋亡、影响肿瘤细胞恶性行为等发挥肿瘤调节作用.探讨HCMV肿瘤调节作用的具体机制,对将HCMV作为肿瘤治疗的一个靶目标,拓...