具有内含子的大鳞副泥鳅Sox8基因

鱼类在脊椎动物系统进化过程中起着承先启后的作用,其性别决定具有原始性、多样性和可塑性。深入研究鱼类的性别决定和分化具有重大的理论意义。Sox基因家族是九十年代发现的一个新的基因家族,其中的许多成员都与性别决定和分化具有直接的关系。大鳞副泥鳅是一种常见的小型鱼类,属于鲤形目鳅科,是少数具有异形性染色体中的一种。本文根据已发表的Sox蛋白质的序列资料,选择在不同物种中保守程度最高的区段设计兼板,在扩增产物中有三条主带,其大小分别为220bp550 bp和1500bp,另有一条相当弱的带,大小为700bp（Fig.1)。雌雄个体中扩增结果一致。经克隆和DNA序列分析,从550bp扩增带中得到一新的基因片段,长500bp,编码53个氨基酸;其余部分长340bp,可能为一内含子,且符合“GT…AG”规律（Fig．2)。其可能编码的蛋白质氨基酸序列与小鼠的Sox8,9,10,SRY基因的相似性分别为96％,94％,90％和47％;与人类SOX8,9,10,SRY基因的相似性分别为64％,94％,58％和40％（Fig.3)。根据这些特性将命名为PdSox8。Northern杂交结果表明PdSox8在成体脑及肝脏组织中有宏量表达（Fig.4）。     

大鳞副泥鳅中Sox 9基因保守区的序列分析

应用特异于ＨＭＧ－ｂｏｘ区域的兼并引物,扩增了大鳞副泥鳅的Ｓｏｘ基因。在扩增产物中发现３条大小分别为２２０ｂｐ、５５０ｂｐ和１５００ｂｐ的扩增带。经克隆和ＤＮＡ序列分析,从片段５５０ｂｐ扩增带中得到一个新的基因片段,其可能编码的蛋白质氨基酸序列与人、鸡、小鼠的Ｓｏｘ９基因相似性最高,达到９４％;其与ＨＳＯＸ１０、ＭＳｏｘ１０、ＨＳＲＹ、ＭＳｒｙ的相似性分别为８７％、５５％、４０％和４７％。     

两种泥鳅中PdSox8和PdSox9基因的染色体定位

应用染色体原位杂交技术,以地高辛标记的大鳞副泥鳅ＰｄＳｏｘ８和ＰｄＳｏｘ９基因片段为探针,研究了二者在泥鳅和大鳞副泥鳅染色体组中的定位。结果表明,在大鳞副泥鳅中ＰｄＳｏｘ８、ＰｄＳｏｘ９分别于端部着丝粒染色体第４和第２号即１４和１２染色体上,信号位点距着丝粒的相对距离分别为４０．２％和６７．５％,在泥鳅中,则分别位于ｔ９、ｔ６上,信息位点距着丝粒的相对蹁分别为５８．３％和３０．８％。     

PCR扩增泥鳅和大鳞副泥鳅SRY盒基因

以特异扩增人ＳＲＹ基因保守区的一对引物,研究了泥鳅和大鳞副泥鳅基因组中ＳＲＹ盒基因的扩增。结果表明,该引物可以在泥鳅中扩增出四条带,其长度分别为２００,５５０、９４０和１０００ｂｐ。在大鳞副泥鳞中扩增出三条带,大小为２００,５５０和９００ｂｐ。经Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交显示出二者的阳性带为２００和５５０ｂｐ。阳性带在雌雄个体间和两个物种间无差异。     

两种泥鳅芳香化酶基因的克隆与时空表达

鱼类的性别分化易受发育环境的影响。向性成熟的泥鳅和大鳞副泥鳅个体注射绒毛膜促性腺激素,获得卵子和精子进行人工授精。把胚胎分别置于20℃、25℃和30℃条件下,使其发育。经性腺检查发现随着温度的升高两种泥鳅中雄性个体所占的比例明显升高,获得明显的偏雄比率群体。根据已知细胞色素P450芳香化酶CYP19 b基因序列设计嵌套简并引物用巢式PCR扩增并克隆出了两种泥鳅的CYP19 b的DNA片段。MaCYP19 b片段和Pd-CYP19 b片段分别长1337bp和1473bp。在此基础上用各自的特异引物克隆出两种泥鳅CYP19 b的相应cDNA片段。通过基因组DNA和cDNA序列的比较证明两种泥鳅的CYP19 b基因均包含三个内含子和四个外显子,编码的蛋白质序列长145氨基酸残基。以GAPDH基因为对照,分别对两种泥鳅成体组织和不同发育阶段的胚胎的CYP19 b进行了半定量RT-PCR表达分析,结果表明泥鳅CYP19 b基因只在成体泥鳅卵巢、肾以及原肠胚和神经胚中表达。大鳞副泥鳅CYP19 b基因在成体的脑、卵巢和肾以及神经胚和卵黄吸收期表达。这些结果为揭示细胞色素P450芳香化酶基因与环境性别决定机制的关系奠定了基础。       

两种泥鳅不同群体遗传变异的RAPD分析

应用RAPD技术,分析了采自于我国黄河、长江和珠江三大水系中游的大鳞副泥鳅和泥鳅不同群体间的遗传变异。结果表明：种内不同群体间带纹相似度在0．730－0．938之间;遗传距离为0．089－0．245;种间不同群体间的带纹相似度为0．392－0．505,遗传距离为0．620－0．800。两种泥鳞采自武汉的群体,其不同个体间的相似度较之其它群体为低,表明其群体内遗传变异程度较高。     

两种蛇Sox基因的PCR-SSCP分析 *

采用PCR技术,以特异扩增人SRY基因HMG-box保守区的一对引物,扩增了乌梢蛇和赤链蛇的Sox基因。结果 两种蛇雌雄个体与人一样,均能扩增出大小为220bp左右的基因片段。对扩增产物进行的SSCP分析发现两种蛇之间以及种内雌雄个体间单链迁移率略有差异,而与人有较大差异。本文为研究蛇类的性别决定机制及Sox基因的演化提供了分子生物学资料。     

两种泥鳅RAPD标记遗传稳定性分析

用从20个随机引物中筛选出的7个引物对泥鳅（Misgurnus anguillicaudatus）和大鳞副泥鳅（Paramisgurnus dabryanus）及其自交与杂交子代进行了RAPD遗传稳定性分析。结果表明,RAPD谱带主要呈孟德尔式遗传,该类带纹明亮稳定,在泥鳅子代中占99．11％;在大鳞副泥鳅子代中占100％;在杂交子代中占99．36％。也存在非孟德尔式遗传谱带,该类带纹较暗、稳定性差,在泥鳅子代中为0．89％;在杂交子代中为0．64％;在大鳞副泥鳅中未见此类带纹。实验结果说明RAPD谱带具有很高的遗传稳定性。     

赤链蛇Sox基因的克隆及序列分析

参照人SRY基因HMG-box保守区的序列,设计一对兼并引物,采用PCR技术扩增了赤链蛇的Sox基因,并对扩增产物进行了克隆和测序,结果在雌雄个体中共筛选出三个Sox基因,其中有一个为雌雄共有,显示出性别差异性;三个Sox基因编码的氨基酸序列与人相应SOX3,SOX4,SOX22基因的相似性分别为96%,98%,96%。显示出Sox基因在进化上的高度保守性,本文为赤链蛇的性别决定机制研究提供了分子资料。     

大鳞副泥鳅雄核发育单倍体胚胎发育的研究

雄核发育（ａｎｄｒｏｇｅｎｅｓｉｓ）系指卵子只依靠雄性原核进行发育的生殖方式。尽管已有川鲽（Ｐｌａｔｉｃｈｔｈｙｓｆｌｅｓｕｓ）（Ｐｕｒｄｏｍ,１９６９）、马苏大麻哈鱼（Ｏｎｃｏｈｙｃｈｕｓｍａｓｏｕ）（Ａｒａｉ等,１９７９）、虹鳟（Ｓａｌｍｏｇａ...     

虎纹蛙四个Sox基因的克隆及序列分析

参照人SRY基因HMG－box保守区的序列,设计一对兼并引物,扩增了虎纹蛙的Sox基因,并对扩增产物进行了克隆和测序。结果在雌雄个体中共筛选出四个不同的Sox基因,其序列与人相应SOX基因的相似性分别为92％、94％、985和98％。本研究为探索虎纹蛙的性别决定机制提供了分子资料。     

两种泥鳅不同核质关系下LDH同工酶基因表达的研究

采用聚丙烯酰胺不连续系统凝胶电泳方法分析了泥鳅和大鳞副泥鳅不同杂交组合不同核质关系下胚发育阶段（0－145h）中乳酸脱氢酶（LDH）同工酶的分化表达谱式,ＬＤＨ同工酶的基因表达随细胞质、细胞核不同及胚胎发育各个时期具有不同的个体发育谱式,以泥鳅卵子为细胞质的Ⅰ、Ⅱ两组,杂交组（Ⅱ）ＬＤＨ同工酶基因在受精后３min至原肠中期雄核基因参与表达与调控,部分基因位点比本交组（Ⅰ）启动与表达的时间要早,两组的管家酶主要来自细胞质。以大鳞副泥鳅为细胞质的Ⅲ、Ⅳ两组,各酶均以细胞质调控为主,其管家酶与泥鳅有很大不同。并具体分析和讨论了不同核质关系ＬＤＨ同工酶基因的表达和调控的时空顺序。     

中华鳖4个Sox基因保守区的序列分析

采用PCR技术,扩增和克隆了中华鳖Sox基因（TSSox）。经DNA序列分析显示,Sox基因在系统进化上十分保守,其中TSSox4与鸟类LF4基因编码的氨基酸序列完全相同、与人类SOX4和Sox4编码的序列仅一个氨基酸的差异;TSSox5与鸟类的LF5基因的编码也仅一个氨基酸发生了改变;TSSox2与海龟的TSox2相似性最高。4条TSSox序列中,TSSox与人SRY基因序列相似性最高,达75％;序列上的相似性可能暗示了它们在功能上的保守性。     

南四湖泥鳅和大鳞副泥鳅随机扩增多态DNA分析初报

采用随机扩增多态性DNA(RAPD)技术对南四湖的泥鳅（Misgurnus anguillicaudatus）和大鳞副泥鳅（Paramisgurnus dabryanus）进行了初步分析。共用10个10bp的OPG组寡核苷酸片段作为引物,筛选出结果好的5个引物,从泥鳅4个体基因组DNA中扩增出142个片段,共有片段12个,特有片段5个;从大鳞副泥鳅3个体基因组DNA中扩增出101个片段,共有片段18个,特有片段5个,在总扩增出的243个片段中,共有片段仅4个。所有扩增片段大小介于0.2-3kb之间。用PoPGen32软件计算出个体间的遗传距离,依此进行UPGMA聚类得到的分子系统树与形态分类学的结果一致,这7个体被聚成2大类,正对应着形态学的2个种：泥鳅和大鳞副泥鳅。     

黄鳝Sox9基因的克隆及其鉴定分析

Sox9基因在人和多种动物中具有进化保守性,在性别决定过程中发挥着重要作用。通过对黄鳝Sox9基因的分子克隆及其限制酶切分析,确定了该克隆的限制酶图谱。从限制酶片段的PCR分析以及HMG盒的DNA序列测定,鉴定该阳性克隆为黄鳝Sox9基因克隆,黄鳝Sox9基因的克隆进一步说明Sox9基因在进行上的高度保守性,对其基因组DNA和cDNA序列结构和转基因黄鳝的深入研究,无疑有助于从进化上阐明Sox9基因功能。     

两种泥鳅中PdSox8和PdSox9的RFLP分析

以α-32P-dCTP标记的大鳞副泥鳅的PdSox8和PdSox9基因片段为探针,研究了二者在泥鳅和大鳞副泥鳅中的限制性片段长度多态性。结果表明两种探针在6尾大鳞副泥鳅（3♀3 ♂）和6尾泥鳅（3♀3 ♂）的经EcoRI和HindIII完全酶切的基因组DNA中检测到了较丰富的阳性杂交带,并讨论了其产生的可能原因。未发现性特异杂交带。 Abstract：With the α-32 P-dCTP-labeled PdSox8 and PdSox9 fragments of Paramisgurnus dabryanus as probes, the Restricted Fragment Length Polymorphism(RFLP) were analyzed in two species of loaches P. dabryanus and Misgurnus anguillicaudatus. The results showed that the plentiful positive bands were observed in the genomic DNA of 6 individuals(3♀3♂) of P. dabryanus and 6 individuals(3♀3♂) M.anguillicaudatus, which were digested thoroughly by EcoRI and HindIII. The possible reasons were discussed. No sex-specific band was observed.     

泥鳅和大鳞副泥鳅卵雌核的紫外辐射灭活条件筛选

采用紫外线对泥鳅和大鳞副泥鳅卵雌性原核进行干法灭活以及在合成卵巢液、TC-199溶液、Ringer氏溶液和Holtfreter氏溶液中灭活,结果表明:当辐射剂量为90-180mJ/cm~2时,卵子在四种溶液中的单倍体诱导率均较高。合成卵巢液组的最佳辐射剂量为120-180mJ/cm~2;TC-199和Ringer氏溶液组的最佳辐射剂量为120mJ/cm~2;原液使用Holtfreter氏溶液效果欠佳,干法灭活效果最差。在上述各辐射剂量下,畸形苗经染色体组鉴定92％为雄核发育单倍体。综合评价,灭活效果依次是:人工合成卵巢液>TC-199溶液>Ringer氏溶液>Holtfreter氏溶液>干法。     

大鳞副泥鳅雌雄个体的形态分析

本文利用数理统计手段研究南四湖大鳞副泥鳅雌雄个体形态差异,结果表明大鳞副泥鳅雌雄个体形态整体差异不显著,但体长/吻腹长指标差异显著;1龄鱼、3龄鱼雌性个体体长、体重大于雄性个体,2龄鱼则呈相反趋势;t检验表明,仅3龄鱼雌雄个体间体长、体重差异显著。