蜂毒素分子的改造及其基因在毕赤酵母中的表达

为获得保留有抗菌活性而降低溶血作用的蜂毒素,对蜂毒素的分子结构进行了改造.将第5位的Val变为Arg,第15位Ala变为Arg,删除了第16位的Leu.用PCR技术获得了改造后的蜂毒素基因,将其克隆入酵母表达载体pPICZa-A,获得重组表达质粒pPICZa-A-MEA.该质粒转化毕赤酵母菌GS115,甲醇诱导下表达,发酵上清液经抑菌活性、溶血活性测定及亲和层析纯化,结果表明,蜂毒素基因成功地在毕赤酵母中表达,经改造后表达的蜂毒素保留了抗菌活性且溶血活性显著降低,经纯化后用Bradford法测定表达蜂毒素的含量约为0.29mg/ml.     

蜂毒素基因的突变与表达及其构效关系研究

为获得保留有抗菌活性而降低溶血活性作用的蜂毒素,对其分子结构进行了改造.其中一条序列缺失Lys-7,另一条缺失Leu-9.用PCR技术获得两条新的蜂毒素基因,将其克隆到酵母表达载体pPICZα-A,获得重组质粒pPICZα-A-Mel1和pPICZα-A-Mel2.将2个重组质粒分别转化毕赤酵母菌GS115.筛选获得重组酵母菌.对重组酵母菌培养条件进行优化,在YEPD中含甘油2%,pH为7,重组酵母菌培养48h后,0.5%的甲醇诱导72h,表达目的蛋白通过Tricion-SDS-PAGE确定分子质量为5.4kD.杀菌效价分别达0.947、1.085.结果表明两条蜂毒素基因成功的在毕赤酵母中表达,经突变后表达的蜂毒素降低了溶血活性,同时保留了抗菌活性.     

改造的蜂毒素基因在毕赤酵母中分泌表达及培养条件研究

对蜂毒素基因进行改造后,通过PCR方法获得新蜂毒素基因(MEA),将其克隆到表达载体pPICZa—A,而后将重组表达载体pPICZa-A-MEA转化GS115,筛选获得重组酵母菌．对GS115-ME经甲醇诱导表达并对培养条件进行优化探讨．对改造的蜂毒素进行了溶血活性、热稳定性及酸碱稳定性测定．结果表明,蜂毒素基因成功地在毕赤酵母中表达,经改造的蜂毒素在保留了抗菌活性的同时溶血活性降低20倍左右,同时还具有良好的热稳定性和酸碱稳定性．     

人精氨酸酶在毕赤酵母的高效表达、纯化和活性研究

目的：人精氨酸酶（Arginase, Arg）的基因arg在毕赤酵母高效分泌表达,建立相应纯化工艺路线,研究重组人精氨酸酶的活性。方法：将人精氨酸酶基因arg按正确的阅读框架插入到毕赤酵母表达载体pPIC9α信号肽基因后,构建得到重组毕赤酵母表达质粒。转化毕赤酵母GS115筛选高表达菌株。结果：成功构建了酵母表达载体pPIC-Arg,转化毕赤酵母GS115后筛选到分泌表达目的蛋白Arg的菌株,目标蛋白可以分泌到培养基中。经过膜过滤和凝胶过滤层析对培养基上清进行纯化,即可获得纯度达到95%的活性产物。活性测定表明,纯化的Arg比活性为310 IU/mg。结论：成功构建了Arg的毕赤酵母高效表达菌种,建立了目标物质的分离纯化工艺。     

抗菌肽牛乳铁多肽素（LfcinB）在毕赤酵母中的表达及活性鉴定

利用巴斯德毕赤酵母(Pichia pastors)系统表达抗菌肽——牛乳铁多肽素(bovine lactoferricin,简称Lf-cinB),获得的分泌型表达产物具有较强的抗菌活性。首先将人工合成的LfcinB基因片段克隆到巴斯德毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9K中,获得的重组质粒pPIC9K-LfcinB通过限制性内切酶SalⅠ酶切线性化,经电穿孔法转化入毕赤酵母细胞SMD1168内。G418抗性筛选,得到高拷贝转化子,经PCR检测LfcinB基因与毕赤酵母染色体稳定整合。阳性克隆经甲醇诱导表达LfcinB。结果表明,抗菌肽牛乳铁多肽素基因已经整合到酵母细胞基因组中并获得表达,表达产物具有较强的杀菌作用。     

猪PR-39抗菌肽基因在毕赤酵母中的表达

[目的]在毕赤酵母中表达抗菌肽PR-39基因,获得有抗菌活性的PR-39。[方法]根据酵母和猪密码子偏好性,对其密码子进行优化改造。将经SOE-PCR获得的PR-39基因与毕赤酵母表达载体pPIC9K连接,构建重组载体pPIC9K-PR-39。经SacⅠ线性化电击转化毕赤酵母GS115,取阳性克隆进行髙拷贝转化子筛选和诱导表达。[结果]pPIC9K-PR-39重组质粒构建成功,pPIC9K-PR-39菌株发酵产物检测结果对DH5α大肠杆菌和金黄色葡萄球菌都有抑菌效果。[结论]获得了PR-39基因的重组酵母,并用毕赤酵母系统成功地分泌表达了具有明显抗菌活性的抗菌肽PR-39。     

抗菌肽牛乳铁蛋白肽衍生肽在毕赤酵母中的表达及活性鉴定

利用巴斯德毕赤酵母系统表达抗菌肽牛乳铁蛋白肽衍生肽简称LfcinBD,获得的表达产物具有较强的抗菌活性.将人工设计的用化学合成法合成的以酵母偏爱密码子编码的LfcinBD基因片段克隆到巴斯德毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9K中,获得的重组质粒pPIC9K-LfcinBD通过限制性内切酶Sac Ⅰ酶切线性化,电击法转化毕赤酵母GS115宿主菌,G418抗性筛选,得到高拷贝转化子.经PCR检测,LfcinBD基因与毕赤酵母染色体稳定整合.阳性克隆经甲醇诱导表达LfcinBD,诱导表达5 d,每24 h取上清1 mL,进行抑菌试验.结果表明,抗菌肽牛乳铁多肽衍生肽基因已整合到酵母细胞基因组中并获得表达,经0.5%甲醇在30℃诱导48 h可产生较强抗菌活性的抗菌肽,而且对氨苄青霉素抗性的大肠杆菌亦有较强的抑菌作用.     

猪β防御素1基因在毕赤酵母中的分泌表达

PBD-1是猪防御系统起重要作用的抗菌小肽,为实现其在毕赤酵母中的表达,根据已发表的猪β防御素1(PBD-1)氨基酸序列和酵母偏好密码子,用PCR方法获得PBD-1基因,克隆到分泌型表达载体pPIC9K信号序列α因子之后,构建重组表达质粒pPIC9K-PBD-1,用SalⅠ将其线性化后转化毕赤酵母SMD1168,采用PCR法筛选Mut 表型,在AOX1启动子调控下,分子量约4.5kD的PBD-1抗菌肽得到表达。抗菌特性研究表明,该表达产物对金黄色葡萄球菌有较好的抑菌活性。首次在毕赤酵母表达系统中实现了PBD-1的分泌表达。     

杂合抗菌肽在毕赤酵母中的表达及其活性测定

为获得溶血活性低、抗菌活性高的杂合抗菌肽,以家蝇抗菌肽Cec Md和中国林蛙抗菌肽Chensirin为母体肽,并结合毕赤酵母偏爱密码子的原则,设计出6条具有抗菌潜力的新型杂合抗菌肽,将其命名为CC22、CC28、CC29、CC30和CC34(1),CC34,利用SOE-PCR技术合成所需的目的基因,并将其克隆至毕赤酵母表达载体pGAPZαA,通过电击转化技术,将其转化至毕赤酵母SMD1168中,经含有Zeocin的抗性平板筛选阳性转化子,YPD液体培养72h后,经Tricine-SDS-PAGE检测出目的蛋白,然后采用高效液相色谱法对其进行纯化。检测结果显示,表达产物CC29对大肠杆菌、鸡沙门氏菌的最小抑菌浓度(MIC)均为25μg/ml;CC34(1)对大肠杆菌表现相对较弱的抑制作用,最小抑菌浓度为100μg/ml;CC34对鸡沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度为50μg/ml;且杂合抗菌肽对有益菌均没有表现出抑制作用。6条杂合肽的溶血活性均呈现较低水平,其中表现出抗菌活性的3条抗菌肽中,以CC29的溶血活性最低,CC34(1)和CC34相对次之。结合抑菌活性,CC29和CC34的抑菌效果较为明显,从而确定溶血活性低且抗菌活性较高的CC29和CC34为新型杂合抗菌肽。     

人胰高血糖素样肽-1与人血清白蛋白融合蛋白在毕赤酵母中的表达

目的：在巴斯德毕赤酵母中表达有降糖活性的人胰高血糖素样肽-1（hGLP-1）突变体（2Gly-hGLP-1）与人血清白蛋白（HSA）的融合蛋白。方法：为将GLP-1氨基酸序列第2位的丙氨酸（Ala）定点突变为甘氨酸（Gly）,根据毕赤酵母偏爱密码子合成编码2Gly-hGLP-1的基因;采用重叠PCR法拼接2Gly-hGLP-1和HSA的基因,使得2Gly-hGLP-1的C端与HSA的N端通过甘氨酸五肽接头连接;将该融合基因插入表达载体pPIC9构建为重组载体pPIC9/2Gly-hGLP-1-HSA,电击转化至毕赤酵母GS115细胞,通过表型筛选和诱导表达实验获得高效表达菌株;工程菌在5L发酵罐中培养后,对发酵产物进行分离纯化和生物学活性分析。结果：融合蛋白在5L发酵罐中的表达量约为200mg/L,经纯化后纯度可达95%以上;小鼠糖耐量实验表明该融合蛋白具有明显的控血糖活性。结论：在毕赤酵母中分泌表达的融合蛋白2Gly-hGLP-1-HSA具有降血糖活性。     

透明颤菌血红蛋白基因vgb和腈水解酶基因bxn在毕赤酵母中的表达研究

为获得高效表达外源蛋白的Pichia pastoris菌株而设计了重组质粒pPIC9K—vgbbxn,其中透明颤菌血红蛋白基因vgb胞内表达以提高菌体的发酵密度,腈水解酶基因bxn分泌表达。转化GS115菌株后,通过PCR、SDS-PAGE检测证实两基因已经整合进酵母基因组且能高效表达,以及用准确的蛋白活性测定方法成功地检测到二所表达的产物均具有正常的活性。摇瓶发酵实验证明,血红蛋白在贫氧条件下可明显促进酵母菌体生长和bxn基因分泌表达。     

猪IL-18在毕赤酵母中的表达及活性分析

采用PCR方法从pGEM-IL-18重组质粒中扩增出IL-18基因并构建真核融合表达载体pPIC9K-IL-18,电激法转化入毕赤酵母GS115,采用G418抗性梯度法筛选得到多拷贝重组菌株,甲醇诱导表达,应用SDS-PAGE分析重组蛋白的表达情况,并将表达蛋白用凝胶层析柱纯化后,用MTT法检测其生物学活性。实验结果表明重组的GS115酵母菌株可表达分泌pIL-18,其表达在72h时达高峰,分泌量可达160mg/L,纯化的重组pIL-18蛋白具有显著的促进淋巴细胞增殖的活性,说明本试验已在毕赤酵母中在国内首次成功表达了具有生物学活性的pIL-18。     

利用双抗生素标记提高血管钠肽在毕赤酵母中的分泌表达

依照血管钠肽氨基酸序列,根据毕赤酵母密码子偏爱性,人工合成了血管钠肽的编码基因,通过PCR技术,扩增出5'端含有组氨酸标签的血管钠肽基因片段,构建的分泌型表达质粒pPIC9K-VNP,pPICZαB -VNP分别经SalⅠ和SacⅠ线性化后,双质粒转化毕赤酵母GS115宿主菌后,G418/Zeocin双抗筛选出整合型His⁺Mut^s表达菌株,Tricine-SDS-PAGE和Western blot分析,证明His-VNP在毕赤酵母中可有效分泌表达,摇瓶产量可达70mg/L左右,双质粒整合较单质粒整合重组子目的多肽表达量提高了75%。生物学活性研究表明,表达产物在体外具有对巨噬细胞iNOS和TNFα mRNA的抑制作用。     

猪囊尾蚴疫苗候选基因TSO18在酵母中的高效表达

将猪带绦虫六钩蚴TSO18基因亚克隆至毕赤酵母分泌性表达载体pPIC9K,构建重组表达载体pPIC9K_TSO18,电转化毕赤酵母菌GS115,使重组表达载体与酵母染色体发生同源整合。采用G418抗性梯度法筛选得到多拷贝重组菌株,用甲醇进行诱导表达,并对表达产物进行SDS_PAGE和Western blot分析、脱糖基化分析、分子筛纯化和小鼠免疫接种等表明,目的蛋白得到了高效表达并进行了适度的糖基化,易于纯化且具有免疫活性。在5L发酵罐中目的蛋白表达量达到2.54mg/mL,为制备基因工程疫苗打下了坚实的基础。     

宇佐美曲霉木聚糖酶基因xynⅡ在不同毕赤酵母中的分泌表达

将宇佐美曲霉E001的内切-1,4-木聚糖酶基因克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9K中,得到重组质粒pPXY-NII,将其经SalⅠ线性化后分别转化2株毕赤酵母GS115和KM71,xynⅡ基因通过同源重组被整合到毕赤酵母染色体上,并处于酵母α因子的下游,经筛选获得阳性重组菌PXGL98(Mut+)和PXKL29(Muts)。该木聚糖酶基因在2株毕赤酵母中均实现了分泌表达。同时对工程菌的发酵条件进行了优化,在甲醇诱导下,PXGL98与PXKL29培养物上清液中的酶活力分别可达1156.92 U/mL和1646.03 U/mL。     

球孢白僵菌丝氨酸蛋白酶基因CDEP-1在毕赤酵母中的表达

我们从球孢白僵菌中克隆了丝氨酸蛋白酶Pr1类基因CDEP-1。为明确CDEP-1的功能、评价其在害虫生物防治中的潜力,需要大量制备具有生物活性的CDEP-1编码蛋白。由于大肠杆菌系统表达真核基因存在产物复性困难的问题,本文利用毕赤酵母系统来表达CDEP-1。结果表明,CDEP-1可在毕赤酵母中高效的分泌表达,而且产物活性高,甲醇诱导48h后上清液中的酶活即可达到38,266U/L。诱导表达的上清液经浓缩后进行凝胶过滤层析,得到了CDEP-1的初纯品,蛋白质含量为50mg/L。将纯化的蛋白酶CDEP-1免疫家兔,制备了CDEP-1的抗血清。Westernblotting分析表明,制备的抗血清可特异性地检测CDEP-1。     

牛凝乳酶基因在毕赤酵母中的重组表达

通过PCR技术从克隆载体pMD18T-Prochy上扩增牛凝乳酶原基因,双酶切后定向插入到酵母表达载体pPICZaA中,构建表达质粒pPICZaA-Prochy,线性化后电转化毕赤酵母GS115,经PCR和测序鉴定凝乳酶原基因成功插入到毕赤酵母的基因组中。在甲醇诱导下进行凝乳酶的表达,SDS-PAGE分析证明重组凝乳酶的分子量约为37 kD,培养基上清液中凝乳酶的活性为12.2 SU/mL。本研究首次应用毕赤酵母表达牛凝乳酶,在培养基中获得分泌表达的重组凝乳酶,为干酪工业提供了新型及优良的凝乳酶来源。     

牛流行热病毒糖蛋白G1抗原表位在毕赤酵母中的表达和抗原性鉴定

从包含牛流行热病毒G蛋白基因的质粒pMD-G中克隆G1抗原表位区基因,亚克隆进表达载体pPIC9K,构建重组载体pPIC9K-G1,线性化后电转化毕赤酵母GS115,通过G418压力和PCR法筛选阳性重组酵母进行诱导表达。经SDS-PAGE、脱糖基化分析、Western blot、ELISA、兔体免疫实验和特异性分析,表明该基因在GS115中表达并进行了适度的糖基化,表达蛋白有良好的生物学活性和特异性,可作为包被抗原,开发ELISA诊断试剂盒。