树突状细胞特异表达新基因的大规模筛选

 树突状细胞在抗原提呈过程中起极其重要的作用．为大规模筛选抗原刺激后人树突状细胞特异表达基因,建立了一种基于“长距离” Ｐ Ｃ Ｒ 技术的减法杂交技术,在实验中取得了较好的效果．初步测序分析了 ２００ 个插入片段为 ０７～２ ｋｂ 的克隆,结果发现新基因片段占 ５０％ ,其中 ３０％ 的片段包含基因编码区,１５％ 的片段包含完整编码区,打点杂交分析新基因中 ８０％ 为抗原刺激后树突状细胞所表达．从已知和未知基因中发现了一些与树突状细胞生物学功能可能相关的基因,这将有助于进一步揭示与阐明树突状细胞的生物学功能．更多及更长片段的测序工作正在进行中．     

家蚕血细胞特异表达新基因Bm04862的鉴定及表达

通过家蚕组织芯片数据筛选得到家蚕血细胞特异表达基因Bm04862,并首次对该基因进行了克隆与鉴定。应用RACE技术获得该基因全长,并对其进行生物信息学分析。Bm4862基因开放阅读框819 bp,共编码273个氨基酸残基,预测其为跨膜蛋白;通过q RT-PCR技术对其时空表达情况进行分析;结果显示Bm04862基因在家蚕血细胞中特异高表达,并在4龄眠期和预蛹2 d时达到表达高峰;构建Bm04862真核表达载体,转染Sf9细胞分析其蛋白的亚细胞定位情况,结果表明其定位于细胞核膜和部分细胞质中。此外,用大肠杆菌刺激蚕体24 h后,Bm04862基因表达水平显著上调,表明大肠杆菌可以诱导该基因的表达,由此推测该基因可能参与家蚕的免疫应答。这为深入研究该基因在家蚕免疫反应中的功能提供了参考。     

植物基因的特异表达与调控

许多基因的表达调节是在转录水平上进行的。基因特异表达的顺式和反式作用因子的研究为探讨基因表达调节机制积累了必要的资料,对基因表达精细的细胞定位具有重要的理论意义和应用意义。     

表达芯片筛选类风湿关节炎特异表达基因

为了寻找类风湿关节炎（rheumatoid arthritis,RA)新的特异性表达标记物,应用基因芯片对RA、骨关节炎（osteoarthritis,OA）和强直性脊柱炎（ankylosing spondylitis,AS）患者关节滑膜组织的基因表达谱进行比较,并采用实时定量PCR方法对芯片结果进行验证. 全基因组表达芯片的结果显示,与OA滑膜组织及AS滑膜组织相比,在RA患者的滑膜组织中,CD38,ANKRD38,E2F2,CFDP1, CD7, ISG20 和IL2RG基因表达异常|实时定量PCR结果证实,RA患者滑膜组织中,CD38、E2F2和IL2RG基因表达明显增高.     

心脏特异表达基因ASBIO的克隆及表达

从人类心脏文库中成功克隆了一个新的含有锚蛋白重复序列及SOCS盒结构域蛋白（ Ankyrin repeat and SOCS box protein, ASB）的家族成员ASBIO。该基因定位于染色体7q36．1,开放阅读框包含1329个核苷酸,由7个锚蛋白重复序列和1个SOCS盒组成,编码452个氨基酸,分子量大约是49．5kD。物种间的进化型分析比较表明该基因是非常保守的,人的ASB10基因和小鼠的Asb10基因有84．8％的同源性。半定量RT-PCR实验结果证明Asb10基因在成年小鼠的心脏和肌肉组织中高表达,提示其可能与心脏和肌肉组织的发育有关。亚细胞定位显示ASB10蛋白在细胞质和细胞核均有表达,为进一步研究奠定了基础。     

一个小鼠睾丸特异表达新基因mtIQ2的克隆和表达谱分析

运用数据库消减杂交筛选出一个在小鼠睾丸中特异表达的新基因--mtIQ2 (Genbank Accession No: DQ153247), Northern blot结果表明该基因的cDNA序列全长为1.2kb,小鼠多组织RT-PCR结果表明:该基因在睾丸中特异表达,而在其他组织中没有表达.运用隐睾模型对该基因的表达研究表明:在手术后第9d,该基因表达急剧下降,到18d完全消失.这些实验提示该基因在睾丸的发育和性成熟过程中可能起重要作用.     

LDH-C：睾丸重要的特异表达基因

乳酸脱氢酶C(LDHC)是目前已知的最早在男性生精细胞中发现的睾丸特异同功酶。LDHC最早通过凝胶电泳技术在人精子及睾丸生精细胞中被发现。免疫组化结果显示LDHC最早出现在早期的粗线期初级精母细胞中,其数量随着减数分裂逐渐增加。成熟精子中LDHC主要定位在精子尾部的主段区域。研究显示,乳酸脱氢酶家族的同功酶在哺乳动物细胞中无所不在,他们受到发育的调控,具有组织细胞的特异性,且功能多样。本文就LDHC的发展史及他们在帮助精子完成受精过程中的作用作一综述。     

神经系统特异表达基因调控机理的研究进展

神经系统特异性基因正确的时空表达受细胞内外信号的调控,信号传导途径最终的靶位点是能结合特异转录因子的DNA序列.目前发现的决定神经系统基因特异性表达的顺式作用元件既有增强子,也有沉默子.它们可以特异性地增强基因在神经系统的表达,或特异性抑制基因在非神经系统的表达. 顺式元件要发挥这些作用,依赖于与其结合的反式因子,而这些反式因子又能与其他蛋白质或DNA序列发生互动, 通过协调作用,共同决定基因的时空表达顺序.     

拟南芥根特异表达基因启动子在烟草中的表达

以拟南芥为材料,利用PCR技术分离pyk10启动子序列,构建了该启动子GUS植物表达载体,农杆菌介导转化烟草,分析该基因在烟草中的表达,以明确拟南芥根特异表达基因pyk10启动子在烟草中的表达特性.结果表明:克隆的pyk10启动子与已报道的pyk10启动子一致性为100%,GUS基因在烟草的根部特异表达,表明该启动子为根部特异表达启动子,为揭示植物根的发生、分化和发育机制,以及培育抗根部病虫害和营养高效利用型转基因烟草奠定了基础.     

表达人溶菌酶基因牛乳腺特异表达载体的构建

利用高保真PCR法,分别扩增了牛乳腺酪蛋白基因的1.8kb和1.1kb的5'和3'调控 序列,克隆入TA载体.经测序鉴定后,利用DNA重组技术依次亚克隆入改造过的真核表达载体 pcDNA3(切除CMV启动子),并插入人溶菌酶基因(hLYZ)的cDNA, 构建成牛乳腺特异表达 载体.获得的重组载体经限制性内切酶酶切鉴定、PCR验证等表明,成功克隆了酪蛋白基因5 '和3'的调控区,并成功构建了表达人溶菌酶基因的牛乳腺特异表达载体.     

蒺藜苜蓿花器官特异基因的表达分析

蒺藜苜蓿(Medicago truncatula G.)花器官特异表达基因是参与其花器官形成与发育的重要基因。筛选蒺藜苜蓿的花器官特异表达基因, 寻找这类基因在其他模式植物中的直系同源基因, 并将其表达模式在不同植物间进行比较, 有利于深入的理解这类基因在蒺藜苜蓿花器官发育中的功能。根据蒺藜苜蓿表达谱, 并以其PISTILLATA(PI)基因为模板, 文章筛选了97个蒺藜苜蓿花器官特异表达基因(Ratio≥10, 且Z≥7.9)。通过同源比对, 确定了这类基因在拟南芥(Arabidopsis thaliana L.)、大豆(Glycine max L.)、百脉根(Lotus japonicus L.)和水稻(Oryza sativa L.)中的直系同源基因。对这类基因在5种植物中的表达量、表达部位和功能进行比较, 发现进化关系较近的植物, 直系同源基因的表达变异较小, 而进化关系较远的植物, 直系同源基因的表达变异较大。进一步对表达分化较大的直系同源基因进行启动子分析, 发现不同植物中直系同源基因表达模式的变化与启动子中调控元件的特性有关。     

斑马鱼胚胎胚盾特异表达基因的鉴定

目的由于原肠期细胞的剧烈运动,在斑马鱼胚胎的背侧汇聚形成了称为胚盾(shield organizer)的结构,是胚胎发育的信号组织中心,在背腹轴建立和胚层诱导过程中具有关键作用。系统鉴定在胚盾特异表达的基因,可为进一步探讨胚盾形成的机制及其指导胚胎早期发育的分子机理提供参考。方法 Tg(gsc:GFP)转基因鱼在胚盾表达特异的绿色荧光。通过流式细胞分选技术分离富集GFP阳性细胞并提取总RNA进行RNA深度测序,检测可能在胚盾高水平表达的基因。然后利用荧光实时定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)和原位杂交技术鉴定若干在胚盾特异表达的基因。结果从Tg(gsc:GFP)转基因鱼胚胎中分离富集到了纯度超过96%的GFP阳性细胞,RNA深度测序的结果显示有657个基因的表达水平比整胚细胞或GFP阴性细胞高2倍以上。最后,确认了KIAA1324、ripply1、twist2、isthmin1、nme4、zgc174153、rrbp1b等7个基因在胚盾特异表达。结论系统鉴定到了斑马鱼胚胎胚盾特异表达基因,为下一步研究这些基因的发育生物学功能奠定了基础。     

蒺藜苜蓿花器官特异基因的表达分析

蒺藜苜蓿(Medicago truncatula G)花器官特异表达基因是参与其花器官形成与发育的重要基因。筛选蒺藜苜蓿的花器官特异表达基因,寻找这类基因在其他模式植物中的直系同源基因,并将其表达模式在不同植物间进行比较,有利于深入的理解这类基因在蒺藜苜蓿花器官发育中的功能。根据蒺藜苜蓿表达谱,并以其PISTILLAZA(PI)基因为模板,文章筛选了97个蒺藜苜蓿花器官特异表达基因(Ratio≥10,且Z≥7.9).通过同源比对,确定了这类基因在拟南芥(Arabidopsis thaliana L.)、大豆(Glycinemax L.)、百脉根(Lotusjaponicus L.)和水稻(Oryzasativa L.)中的直系同源基因。对这类基因在5种植物中的表达量、表达部位和功能进行比较,发现进化关系较近的植物,直系同源基因的表达变异较小,而进化关系较远的植物,直系同源基因的表达变异较大。进一步对表达分化较大的直系同源基因进行启动子分析,发现不同植物中直系同源基因表达模式的变化与启动子中调控元件的特性有关。     

胚胎发育早期头部特异表达的小鼠新基因BSG5的克隆及功能

BrainSpecificGene 5 (BSG5 )基因是用消减差异筛选的方法克隆到的在小鼠胚胎头部特异表达的新基因。它与人的KIAA0 6 2 8基因在氨基酸水平上有 81 9%的同源性。BSG5基因长 2 4 87bp ,定位在小鼠的第 1 5号染色体上 ,包含 2个外显子。它编码的蛋白质全长 4 99个氨基酸 ,含 1 2个C2H2型的锌指结构域。以BSG5基因全长编码区为探针的原位杂交结果显示BSG5基因在小鼠胚胎发育早期头部特异表达 ,在小鼠胚胎发育稍后时期的尾部和肢芽也有表达。此外 ,以鸡胚为模型研究BSG5基因也发现该基因在鸡胚的头部特异表达。这提示BSG5基因与头部发育有密切关系 ,其结构与表达特征预示着它编码的是一个具DNA结合功能的转录调控因子     

水牛睾丸特异LDHC基因的原核表达及生物学活性研究

目的:克隆水牛睾丸特异Ldhc基因全长在大肠杆菌中原核表达,研究其生物学活性.方法:以水牛睾丸组织为材料提取总RNA,RT-PCR扩增Ldhc cDNA,PCR获得水牛全长Ldhc基因;连接pET-32b构建表达质粒pET-32b-Ldhc;转化BL21(DE3)大肠杆菌,IPTG诱导表达并利用SDS-PAGE分析.体外Ni离子柱纯化目的蛋白,Western印迹鉴定其抗体结合活性,同工酶谱鉴定其生物学活性.结果:成功制备了表达质粒pET-32b-Ldhc;IPTG诱导得到56KDa目的蛋白;Ni柱纯化获得纯度90%以上的蛋白;Western印迹显示目的蛋白具有特异的抗体结合活性;同工酶活性染色证明其具有乳酸脱氢酶活性.结论:试验成功制备了水牛睾丸LDH-CA蛋白,并初步验证了其生物学活性,为我们进一步探讨LDH-G4的功能及免疫节育疫苗的制备等奠定了基础.     

人血小板生成素基因乳腺特异表达载体的构建和表达

目的为了获得能在转基因动物乳汁中高效表达人血小板生成素（TPO）的特异表达载体。方法将山羊β-乳球蛋白基因5’端上游-3.9kb和-1.9kb调控序列及β-酪蛋白启动子分别与人TPO基因连接,构建了pB3.9T、pB1.9T和pPT3个乳腺特异表达载体。将上述载体分别进行瞬间转染和稳定整合筛选实验,从mRNA及蛋白水平检测TPO基因的表达。结果BLG3.9、BLG1.9和PlA3 3种调控元件都可以启动人TPO在乳腺细胞中特异表达。瞬时转染时3种载体表达水平依次为pPT〉pB3．9T〉pB1.9T。但当外源基因稳定整合入细胞基因组后,TPO表达量持续升高,且pB3.9T表达量明显超过另外两种载体。结论证实了BLG转录子去阻遏和激活转变调节的存在,可能在其5’端-3.9kb与-1.9kb之间存在这一调节区域。并且与BLG1.9相比,BLG3.9能更有效地启动人TPO基因在乳腺细胞中的表达,也说明在-3.9至-1.9kb之间可能存在特殊的增强序列。     

应用基因芯片分析甘蓝型油菜柱头特异表达基因

以甘蓝型油菜(Brassica napus)野生型(宁油10号)及其柱头授粉功能缺失突变体FS-M1为材料,使用油菜基因表达谱芯片筛选甘蓝型油菜柱头特异表达基因。在含有16 540个基因的油菜基因表达谱芯片中(43 803探针),获得了4 410条差异表达探针,选择部分差异表达基因进行实时定量PCR,所得结果与芯片检测结果相吻合。其中,野生型较FS-M1显著上调且获得209个功能注释的探针,对应198个基因,这些特异表达的基因主要富集在水解酶、转移酶、氧化还原酶和转录因子中;涉及较大的基因家族包括:细胞色素P450基因、GDSL脂肪酶/水解酶基因、ABC转运蛋白基因、myb转录因子基因、bHLH转录因子基因、过氧化物酶家族和受体激酶基因等。推测这些基因与甘蓝型油菜柱头发育及授粉功能有关。     

LDH—C：睾丸重要的特异表达基因

乳酸脱氢酶C（u）Hc）是目前已知的最早在男性生精细胞中发现的睾丸特异同功酶。LDHC最早通过凝胶电泳技术在人精子及睾丸生精细胞中被发现。免疫组化结果显示LDHC最早出现在早期的粗线期初级精母细胞中,其数量随着减数分裂逐渐增加。成熟精子中LDHC主要定位在精子尾部的主段区域。研究显示,乳酸脱氢酶家族的同功酶在哺乳动物细胞中无所不在,他们受到发育的调控,具有组织细胞的特异性,且功能多样。本文就LDHC的发展史及他们在帮助精子完成受精过程中的作用作一综述。