木瓜蛋白酶的研究 Ⅴ.活性中心的C~(14)-标记

木瓜蛋白酶与不同当量的1-C~(14)-溴代乙酸作用結果,后者虽远为过量时亦只有半当量与每克分子酶結合(假定酶分子量为21,000)。C~(14)-羧甲基木瓜蛋白酶氨基酸图譜的放射自显影中仅发現一个被标記了的衍生物,可能是羧甲基組氨酸。看来活性中心组氨酸殘基与溴代乙酸的反应速度远远大于其他可能与溴代乙酸結合的基团,初步計算結果表明反应速度常数比至少在八百万倍以上。     

木瓜蛋白酶的研究 Ⅳ.活性中心组氨酸残基的羧甲基化

(1)在过量半胱氨酸存在下微量溴代乙酸或碘代乙酸在pH5对木瓜蛋白酶有強烈的抑制作用,当抑制剂与酶的克分子比为0.5时,抑制即达完全。抑制前后木瓜蛋白酶巯基含量不变。溴代乙酸作用后所得到的羧甲基木瓜蛋白酶汞盐結晶,与木瓜蛋白酶汞盐結晶相同。(2)在6M尿素溶液中溴代乙酸与木瓜蛋白酶的作用速度显著降低,底物L-白氨酰胺及抑制剂对氯汞苯甲酸都具有保护作用。这些事实表明溴代乙酸的抑制与木瓜蛋白酶的催化活性有密切关系,其作用点很可能是活性中心所在。(3)以双相电泳层析进行氨基酸組成分析結果指出,溴代乙酸作用点很可能是組氨酸殘基。     

猪肾酰化酶作用机制的研究——Ⅱ.酶蛋白中巯基,咪唑基与酶活力的关系

(1)酰化酶能被各种巯基試剂所抑制,其中以PCMB的抑制最为明显,在所有的抑制情况下,都保留有一定的剩余酶活力。巯基乙酸能完全解除PCMB的抑制,恢复程度随所加的浓度而定,当巯基乙酸过量子抑制剂150倍时,酶活力反而高于原始活力20%,若浓度再高,酶活力又重新下降。(2)酰化酶經光氧化后活力就迅速丧失,但加对色氨酸殘基专一的試剂N-溴代琥珀酰亚胺并不影响酶的活力。溴代乙酸在較高浓度下亦能抑制酶的活力,抑制程度在作用pH为5左右时較为明显。(3)pH不影响酰化酶与底物結合的米氏常数K_M,而影响最大反应速度V。从pH对V影响的作图中求出活性基团的pK值为5.9和8.6,分別相当于酶蛋白中組氨酸和半胱氨酸的解离常数。(4)从实驗結果中推測,組氨酸和半胱氨酸是酰化酶的必需基团,它們可能与酶中金属离子以配位价的形式結合而共同构成一活性中心,在酶催化反应吋底物先通过金属离子与酶相結合,然后再进一步被催化。     

木瓜蛋白酶的研究 Ⅰ.对不同底物水解作用的比较

(一)氢离子浓度对木瓜蛋白酶水解不同合成底物的影响均属于非竞争性类型,即对不同底物的米氏常数皆与pH无关,pH仅影响最大反应速度。因此很可能木瓜蛋白酶的米氏常数即等于其与底物结合的解离常数。(二)甲醇对木瓜蛋白酶水解Bz-精-NH_2及Cbz-谷NH_2-NH_2有抑制作用,但对Cbz-白-NH_2及Cbz-甘-NH_2的水解却有显著的促进作用。(三)甘氨酸乙酯对Bz-精-NH_2及Cbz-甘-NH_2的水解亦有促进作用,但活力提高的程度各不相同。(四)根据以上结果对木瓜蛋白酶的作用机制作了简短的讨论。     

乙醇溶液对木瓜蛋白酶催化活性的影响

研究了乙醇溶液对木瓜蛋白酶水解酪蛋白的催化活性及构象的影响。结果表明,木瓜蛋白酶在一定浓度乙醇溶液中水解酪蛋白的活性有显著上升。动力学测定表明木瓜蛋白酶在乙醇溶液中米氏常数（Km）下降。差示光谱显示,在乙醇溶液中木瓜蛋白酶的二级结构发生了变化。荧光发射光谱表明,木瓜蛋白酶在乙醇溶液中发射峰位几乎没移动,但发射强度明显增高。     

木瓜蛋白酶的研究 Ⅵ.白氨酰胺的聚合作用

木瓜蛋白酶于pH7在半胱氨酸存在下能催化白氨酰胺生成聚白氨酸,聚合物分子量約为1,200,过程中只有聚合作用并无白氨酰胺的水解。当反应系統中同时有苯丙氨酸甲酯存在时則生成白氨酸与苯丙氨酸之比为1∶1的,分子量約为1,400的共聚物。虽然从酶制剂的均一性,离子交換柱层析时活力的平行分布以及溴代乙酸的抑制看来,轉酰基反应和水解反应一样都是由木瓜蛋白酶所催化的,但根据白氨酰胺与苯甲酰精氨酰胺同时存在时的总反应速度为二者在相同条件下分別作用速度之和,催化白氨酰胺聚合的pK_b为5.3与苯甲酰精氨酰胺水解的pK_b值(3.3)显著不同,以及N-溴代琥珀酰亚胺对水解和聚合作用的影响也不相同等看来,木瓜蛋白酶催化水解与聚合作用的活性中心很可能不完全相同。     

蛋白质功能基团的改变与其生物活力的关系 Ⅲ.对硝基苯酰甲基溴对某些蛋白质活力的影响

对-硝基苯酰甲基溴(NPAB)在不太高的浓度之下对木瓜蛋白酶,核糖核酸酶,胰凝乳蛋白酶和胰島素等的生物活力有明显的抑制作用。当NPAB与胰島素或胰疑乳蛋白酶共同保温时,随着生物活力的下降也同时发生吸收光譜的变化。对于胰凝乳蛋白酶而言,355mμ光密度的增加与其活力的下降完全平行說明NPAB仅作用于一个必需基团,再从二氫肉桂酸对这一抑制作用的?た蠢?这一基团可能是酶活性中心的一部分。NPAB对胰島素及核糖核酸酶的作用受pH影响,說明这一反应受蛋白分手中解离基团的控制,并且从它的pK值看来,这一解离基团很可能是组氨酸的咪唑基。pH影响木瓜蛋白酶和胰疑乳蛋白酶与NPAB的作用較为复杂,可能有不只一种解离基团参与控制它們与NPAB的反应。     

乙二醇对木瓜蛋白酶催化活性的影响

对不同浓度乙二醇水溶液影响木瓜蛋白酶水解酪蛋白的催化活性及构象的改变进行研究。结果表明,木瓜蛋白酶在乙二醇水溶液中水解酪蛋白的活性显著下降。动力学测定表明,木瓜蛋白酶在乙二醇水溶液中最大反应速度明显下降;差示光谱显示,在乙二醇水溶液中木瓜蛋白酶的二级结构发生了变化;荧光发射光谱显示,木瓜蛋白酶在乙二醇水溶液中发射峰位几乎没移动,但发射强度明显增高。     

木瓜蛋白酶的固定化及其性质研究

在海藻酸钠-壳聚糖固定化木瓜蛋白酶(immobilized papin on sodium alginate-chitosan,IPSAC)的实验中,当给酶量为1 mg g1载体时,酶活性为39.2 U,酶活力回收为21.1%.在尼龙布固定化木瓜蛋白酶(knmobilized papain onnylon,IPN)的实验中,当每块尼龙布(3 cm×3 cm)给酶量为1 mg时,酶活性为35.6 U,酶活力回收为19.2%.木瓜蛋白酶(papain,PA)、IPSAC、IPN的最适pH分别为7.2、7.2和6.8.PA及IPSAC在70℃以下活性稳定;IPN在50℃以下活性稳定.IPSAC与IPN半衰期分别为59 d和66 d.     

木瓜蛋白酶水解壳聚糖的工艺研究

本文通过正交试验对木瓜蛋白酶水解壳聚糖的工艺进行优化,并对降解过程中粘度、还原糖等一些指标的动态变化进行研究。结果显示,木瓜蛋白酶在反应温度45℃下降解壳聚糖的最佳工艺条件为壳聚糖的脱乙酰度70%,pH4.0,底物浓度1%,壳聚糖与酶的比例为25∶1(w/w)。其中底物脱乙酰度对酶解效果影响呈极显著水平,pH值影响呈显著水平。木瓜蛋白酶可较为有效地降解脱乙酰度为70%的壳聚糖,在其最适条件下对壳聚糖水解约60min,可控制产物平均分子量在1万以内。木瓜蛋白酶起始降解速率很快,20min后VDP变化趋于平稳,60min后基本维持在93～94%上下。反应进行60min后产物的平均分子量约为9000。还原糖含量在反应进行150min之后,还原糖的生成速度基本趋于平稳。     

用木瓜蛋白酶及固定化木瓜蛋白酶拆分DL-苯丙氨酸

为了将手性化合物D-苯丙氨酸和L-苯丙氨酸进行分离,利用木瓜蛋白酶及固定化木瓜蛋白酶催化的方法对其拆分．试验结果表明,用DL-苯丙氨酸合成N-乙酰-DL-苯丙氨酸,得率为88.7％．木瓜蛋白酶、海藻酸钠 壳聚糖固定化木瓜蛋白酶(IPSAC)、尼龙布固定化木瓜蛋白酶(IPN)催化合成N-乙酰-L-苯丙氨酰苯胺时,对催化合成过程影响最大的因素分别是溶液中的离子强度、溶液中的离子强度、反应温度;溶液中的离子强度与pH对合成的影响较大．本试验得出分别用木瓜蛋白酶、IPSAC、IPN催化合成N-乙酰-L-苯丙氨酰苯胺的3个最佳方案;用此3个方案合成时,产率分别为61.2%、54.7%、36.3%．N-乙酰-L-苯丙氨酰苯胺水解生成L-苯丙氨酸,产率59.2%,光学纯度为96.6％．N-乙酰-D-苯丙氨酸水解生成D-苯丙氨酸,产率61.7%,光学纯度为95.7％．     

产气气杆菌茁霉多糖酶的研究II．化学试剂对酶活力的影响

研究了某些化学试剂对产气气杆菌 Aerobacter aerogenes 的茁霉多糖酶 (Pullulanase EC3.2.1.41)活力的影响。Hg2+,Cu2+,Al3+,Fe3+等金属离子对酶活力有强烈的抑制作用,Ca2+,Mg2+有激活作用。1×10-3M的β-环状糊精完全抑制酶的活力,是竞争性抑制剂,其抑制常数Ki为0．55×10-5M。8M尿素,1.0M的盐酸胍,0.5％的SDS等蛋白质变性剂导致酶活力的完全丧失,在反应体系中有5×10-4M的Ca2+时,对酶有明显的保护作用。色氨酸残基的专一性修饰剂N-溴代琥珀酰亚胺(简称NBS)在1×10-4M的浓度下使酶活力完全丧失,甚至在1×10-5M的浓度下,只保留9％的活力,酶液在用NBS处理前加入不同浓度的底物,对活力有明显的保护作用,表明色氨酸残基对于茁霉多糖酶的活力是十分重要的。     

溜曲霉β-N-乙酰氨基己糖苷酶的化学修饰

用几种蛋白质侧链修饰试剂对β-N-乙酰氢基己糖苷酶进行化学修饰,在一定条件下,当巯基、羟基、酪氨酸残基分别被IAA及NEM、PMSF、NAI修饰后,酶活力不受影响,说明这些基团与活力无关。当羧基、组氨酸及色氨酸残基分别被EDC、DEP、NBS修饰后,酶活力大幅度下降,说明这些基团或者参与了酶催化作用,或者位于酶活性位区附近。     

葡萄糖淀粉酶色氨酸残基及底物结合位点的研究

 本文用N-溴代琥珀酰亚胺(NBS)对葡萄糖淀粉酶进行特异性修饰,当酶分子表面有3个色氨酸残基被修饰后,酶活力完全丧失。用邹氏图解法测得酶活性中心有一个色氨酸残基是必需的。如果在酶液中加入不同的底物再用NBS氧化,用荧光发射和荧光猝灭光谱检测表明,底物对酶分子有不同程度的保护作用。在被测试的三种底物中,这种保护能力依为糊精>淀粉>麦芽糖。     

甲醇溶液对木瓜蛋白酶催化活性的影响

试验结果表明,木瓜蛋白酶在一定浓度甲醇溶液中水解酪蛋白的活性显著上升;动力学测定表明,该酶在甲醇溶液中Km下降;在甲醇溶液中木瓜蛋白酶催化酪蛋白水解反应的最适pH为8.5,最适温度为70℃;紫外差示光谱研究表明,在甲醇溶液作用下木瓜蛋白酶的二级结构发生了变化;荧光发射光谱研究表明,木瓜蛋白酶在甲醇溶液中发射峰位向低波长移动,荧光峰值明显增高。     

壳聚糖固定化木瓜蛋白酶的研究

以壳聚糖为载体,成二醛为交联剂将木瓜蛋白酶固定化。5％戊二醛在4-6℃下处理载体5h,加酶液(3.5mg/mL蛋白,pH7.2)固定12h,活力回收达32％,作用于酪蛋白的半衰期为36天,其表观K_m(酪蛋白)值为0.075％(W/V),溶液酶的K_m值为0.086％;最适pH7.0～7.5,溶液酶为7.0～8.5。固定化酶在pH8.5以下,溶液酶在9.0以下活力稳定。固定化酶在45℃以下,溶液酶在75℃以下稳定。用6mol/L脲洗脱固定化酶4次(5.5h)活力仍有54.5％。用固定化酶处理啤酒浊度比对照下降了1.5-3.7倍,蛋白质含量下降了44％,冷藏(4℃)120天无冷混浊现象发生并保持了啤酒原有风味和理化性状。     

猪腎脏羧肽酶的提取及其性质的研究

(一)从猪腎脏組織細胞內抽提出一新羧肽酶制剂,能水解牛胰羧肽酶A,B的底物Cbz-甘-苯丙及B-甘-精及其他各种带有Cbz的合成肽。此酶具有較广的专一性,能作用于一般蛋白水解酶和肽酶所不能水解的脯-賴(ε-Tos)或脯-賴间的肽鍵。(二)酶的最适pH在7.5—8.0之間,不被DFP和PCMB所抑制,但能被較高浓度的碘乙酰胺(0.01M)所抑制。对大多数底物酶的反应属于零級反应。(三)酶对10~(-3)MEDTA透析后,活力全部丧失。如加入Co~( ),Mn~( )或Ca~( )等离子能部分或全部恢复酶的活力,但加入Co~( )却能使酶活力提高二倍以上。(四)初步将猪腎脏羧肽酶应用于C端氨基酸組成的測定,并取得較滿意的結果。     

3-磷酸甘油醛脱氢酶胍变性时的活力及构象变化

酵母3-磷酸甘油醛脱氢酶在盐酸胍溶液中的内源荧光及剩余活力的变化结果提示:apo酶及holo酶的活力在胍浓度为0.5M左右可完全丧失.同时伴有内源荧光强度的下降,光谱宽度的增加和335nm最大发射峰的红移(提示了色氨酸残基的暴露).与已经报导的肌肉酶(内源荧光强度在胍浓度为0.4—1.2M范围相对稳定)不同,酵母酶内源荧光在此浓度范围内表现为逐渐降低.在0.7M胍溶液中,内源荧光变化动力学过程只能测出一相,而酶失活动力学过程为快慢两相,快相动力学速度常数至少大于内源荧光降低速度常数三个数量级以上.以上结果提示:低浓度胍可引起该酶的完全失活,活性部位的空间构象比酶分子的构象更易受到变性剂的扰乱;有一个色氨酸残基位于或靠近酶的活性部位.     

木瓜蛋白酶在谷物色氨酸测定上的应用

目前测定谷物色氨酸的方法操作繁琐,费用昂贵,准确性也差,为了适应在普通实验室条件下进行大批样品的测定,我们采用木瓜蛋白酶水解玉米粉等谷物的蛋白质,然后用对二甲胺基苯甲醛(DAB)显色法进行比色测定,方法简单、快速,可达到上述测定目的。     

尼龙固定化木瓜蛋白酶及其应用研究

 尼龙经CaCl_2和H_2O的甲醇溶液处理,稀HCl水解用戊二醛交联以制备固定化木瓜蛋白酶。在溶液酶浓度为1mg/mL pH7.5—8.0、4—15℃条件下固定3h,活力回收42.5％,相对活力46％,偶联效率52％,半衰期72天。溶液酶Km值和固定化酶K_m~(aPP)值(底物酪蛋白W/V,％)分别为0.28％和0.35％。溶液酶和固定化酶分别在pH6.5和pH8.0以下活力稳定;最适pH分别为7.0和8.0;在65℃处理30min活力分别为原有活力的89％和66％。当酪蛋白浓度为1.5％和2.5％以上活力分别受到抑制。固定化酶在6mol/L脲中连续浸洗5次共6h其活力稳定,仍有原活力的44.4％;用以处理啤酒浊度比对照下降了2-11倍;蛋白质含量下降了55％;冷藏(4℃)120天,无冷混浊发生;同时各项理化指标和风味不变。