番茄环斑病毒HC-RT-PCR-ELISA检测

番茄环斑病毒（ToRSV）是我国对外检疫一类有害生物,目前国内尚无存在的报道。PCR技术是一种快速灵敏的植物病毒检测方法,但核酸内的聚合酶抑制物会导致漏检现象,而只通过凝胶电泳进行结果判定会出现假阳性,这两方面限制了PCR技术在对外检疫中的应用。利用共价结合在PCR管壁上的引物特异性杂交诱捕核酸粗提液中的靶标核酸,洗掉杂质及抑制物质,在同一管内作RTPCR,凝胶电泳检测液相产物的同时对固相产物进行杂交检测,提高了结果的可靠性及灵敏度。利用所建立的HCRTPCRELISA成功地从法国进口葡萄苗中检出ToRSV。本方法还可用于其他植物病毒及转基因产品的检测。     

番木瓜环斑病毒PCR检测技术研究

建立了检测番木瓜环斑病毒 (PRV)的免疫捕捉 PCR (IC PCR)法、ELISA PCR法和巢式 PCR法 ,它们分别能从 10 - 4、10 - 7和 10 - 14 稀释度的番木瓜叶粗汁液 (所含鲜叶组织的量分别 0 .5ug、0 .5ng和 5× 10 - 6ng)中检测出PRV。     

烟草环斑病毒IC-RT-Realtime PCR检测方法研究

本研究首次应用免疫捕捉反转录实时荧光PCR技术(IC-RT-RealtimePCR)检测烟草环斑病毒,由于综合运用了抗原抗体特异性结合、核酸分子杂交、高灵敏度实时荧光PCR技术的优点,从而使病毒检测在特异性、灵敏度、稳定性等技术指标上比传统的DAS-ELISA方法都有显著提高,解决了烟草环斑病毒检测工作中由于隐症、病毒浓度低、干扰物质存在而影响检测结果的问题。     

番木瓜环斑病毒检测技术的研究

本研究在37℃条件下,以硝酸纤维素滤膜(NCM)为载体:3％酪蛋白为封闭剂、辣根过氧化物酶标记的A蛋白为酶标结合物(SPA-HRP)和以稀释100倍兔抗PRV-Ys的IgG为其工作浓度,成功地建立了检测PRV的间接Dot-ELISA。其检测灵敏度达到了较满意的ng水平。同时,本研究以PRV-Ys株系RNA作模板、oligo(dT)~(12-18)作引物、pUC19作cDNA克隆载体和以E.coli JM107作受体,采用缺口翻译(Nick Translation)方法成功地制备了pYs6 cDNA分子探针(插入片段约300bp)。其检测PRV-RNA的灵敏度达到了较理想的pg水平。     

植物组织粗汁液中的番木瓜环斑病毒的ELISA检测技术

本研究建立和改进了检测番木瓜和西葫芦组织粗汁液里的番木瓜环斑病毒（ＰＲＶ）的ＤＡＣ－ＥＬＩＳＡ法和Ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ法。用不同的ＥＬＩＳＡ方法来检测不同寄主植物粗汁液里的ＰＲＶ,其所用的合适的制备粗汁液的缓冲液是不同的。用ＤＡＣ－ＥＬＩＳＡ法检测西葫芦粗汁液时,以０．５ｍｏｌ／Ｌ磷酸盐缓冲液（ｐＨ７．５,内含０．１ｍｏｌ／Ｌ乙二胺四乙酸二钠）为宜;而检测番木瓜粗汁液时,则还要加入０．２５ｍｏｌ／Ｌ脲。用Ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ法检测时,在上述磷酸盐缓冲液中加入２％聚乙烯吡咯烷铜能提高对西葫芦粗汁液的检测效果。应用合适的制备粗汁液的缓冲液,ＤＡＣ－ＥＬＩＳＡ法和Ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ法的灵敏度分别提高到１／４０９６和１／１０２４（稀释度）。本研究还表明,影响ＤＡＣ－ＥＬＩＳＡ法的定过测定的主要因素是粗汁液的稀释度和包被液（０．０５ｍｏｌ／Ｌ碳酸盐缓冲液,ｐＨ９．６）的用过。在较高粗汁液稀释度和包被液的用量相同时,粗汁液里的病毒含量与ＤＡＣ－ＥＬＩＳＡ法的ＯＤ４９２ｎｍ值呈真实的线性关系。     

烟草环斑病毒IC-RT-Realtime PCR检测方法研究

本研究首次应用免疫捕捉反转录实时荧光PCR技术(IC-RT-Realtime PCR)检测烟草环斑病毒,由于综合运用了抗原抗体特异性结合、核酸分子杂交、高灵敏度实时荧光PCR技术的优点,从而使病毒检测在特异性、灵敏度、稳定性等技术指标上比传统的DAS-ELISA方法都有显著提高,解决了烟草环斑病毒检测工作中由于隐症、病毒浓度低、干扰物质存在而影响检测结果的问题.     

RT—PCR检测蓝舌病毒技术的建立

蓝舌病毒 (ＢｌｕｅｔｏｎｇｕｅＶｉｒｕｓ,ＢＴＶ)是呼肠孤病毒科 (Ｒｅｏｖｉｒｉｄａｅ)环状病毒属 (Ｏｒｂｉｖｉｒｕｓ)的代表种 ,含10个节段的双链ＲＮＡ(ｄｓＲＮＡ)作基因组。其中 ,Ｌ2节段编码ＢＴＶ型特异性抗原ＶＰ2 ,Ｌ3节段和Ｓ7节段编码群特异性抗原多肽ＶＰ3和ＶＰ7。其中 ,ＶＰ7是ＢＴＶ粒子的主要结构多肽之一 ,其编码基因序列保守。ＶＰ7具有高度的抗原性 ,能刺激被感机体产生强的群特异性免疫反应[1] 。蓝舌病毒的易感宿主是牛、羊及野生反刍动物 ,死亡率高达 6 0 %～ 70 %以上 ,并且至今仍无有效的防治措施 ,对畜牧业…     

番木瓜环斑病毒PCR检测技术研究

建立了检测番木瓜环斑病毒(PRV)的免疫捕捉-PCR(IC-PCR)法、ELISA-PCR法和巢式-PCR法,它们分别能从10-4、10-7和10-14稀释度的番木瓜叶粗汁液(所含鲜叶组织的量分别0.5ug、0.5ng和5×10-6ng)中检测出PRV.     

一步法双重RT—PCR检测SARS冠状病毒技术研究

参照WHO公布的PCR检测SARS相关冠状病毒的引物序列,我们合成了4对引物,建立了一步法RT-PCR检测SARS相关冠状病毒的方法。利用该方法,对武汉市非典型肺炎疑似病例喉澈液进行了SARS相关冠状病毒检测,其中w20用4对引物检测均在相应的位置出现了DNA条带,W1只有BNIin-s／as引物出现预期产物。同时我们将样品W20的RT-PCR扩增产物进行了序列测定,结果显示该片段序列与其他地区和国家分离的SARS冠状病毒基因高度同源性,这进一步说明RT-PCR扩增的产物是SARS冠状病毒基因片段。在此基础上我们又建立了四种SARS冠状病毒一步法双重RT-PCR检测方法,在一个RT-PCR反应中用两套引物同时对SARS冠状病毒基因两个不同的片段进行检测,检测结果具有更高的特异性。     

烟草环斑病毒的定量检测技术研究

目的:建立特异、灵敏、快速的TaqMam实时荧光定量PCR方法,用于烟草环斑病毒(TRSV)的定量检测。方法:用纳米磁珠法提取病毒RNA,构建包含烟草环斑病毒全CP序列的质粒标准品。根据CP保守序列设计特异性的引物和TaqMam荧光探针,构建标准曲线,建立TRSV的实时荧光绝对定量PCR方法,并对该方法的特异性、灵敏度和重复性进行评估。结果:建立的方法特异性好,与南芥菜花叶病毒、马铃薯X病毒和马铃薯Y病毒均无交叉反应;至少能检测到767个病毒拷贝,灵敏度比普通PCR高100倍;同一样品试验内及试验间重复性实验的变异系数均小于3%,重复性好;检测结果准确可靠,构建的标准曲线有较好的线性关系(R2=0.997)。结论:建立的TRSV TaqMan实时荧光定量PCR检测方法可满足口岸高通量、快速、准确的检验检疫要求。     

番木瓜抗病突变体阻碍环斑病毒体内运转

应用RT－PCR一步法检测了PRSV Ys株系在感病番木瓜及其抗病突变体植株体内的运转动态,结果表明：在感病植株中,接种后48hr接种叶的未接种部位可检出病毒,第4天部分接种叶柄可检出病毒,第6天植株各部位均能检出病毒;而在抗病植株中,接种后可以而且仅能在接种部位检出病毒;因而认为抗病突变体能够阻碍病毒从接种部位运出及（或）向未接种部位运入。     

番茄环斑病毒单克隆抗体的制备

以纯化的番茄环斑病毒(Tomato ringspot virus,ToRSV)为抗原,注射免疫BALB/c小鼠,将免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞Sp2/0进行融合,经多次细胞筛选及克隆化,获得3株(A8、B7和G9)可分泌抗ToRSV单克隆抗体的杂交瘤细胞株,并以之分别制备小鼠腹水单克隆抗体。经酶联免疫吸附试验检测表明,该3株杂交瘤细胞腹水抗体效价在10-5～10-6之间,且均具有与ToRSV反应的特异性。     

番茄花叶病毒单克隆抗体的制备及检测应用

用番茄花叶病毒(ToMV)免疫的BAL B/c鼠脾细胞与SP2/0鼠骨髓瘤细胞融合,经筛选克隆,获得4株能稳定传代并分泌抗ToMV单克隆抗体(Mab)的杂交瘤细胞,其中2株能同时检测ToMV和烟草花叶病毒(TMV),各单克隆抗体腹水ELLSA效价在1∶32 000～1∶1 024 000之间。经TASELISA测定,4株单克隆抗体检测病汁液的稀释度均能达到1∶2 000倍以上。4株单克隆抗体与其他病毒无交叉反应。Westernblot分析表明,其中两株与ToMV176kD的外壳蛋白亚基有特异反应,而另两株无反应,推测它们是针对构象决定簇的抗体。     

Development of PCR Diagnostic System for Detection of the Seed-Transmitted Tobacco Ringspot Virus in Quarantine

Tobacco ringspot virus (TRSV) is a plant quarantine virus in Korea. As such, a TRSV examination is conducted when importing various crops. In this study, RT-PCR and nested PCR systems for TRSV detection in quarantine sites, and the modified-positive control plasmid for proving laboratory contamination and false positive reactions were developed. The developed diagnostic system was used to detect TRSV in the quarantine site. It revealed that from 2012 to August 2014, a total of 12 cases were detected in imported various crops. The system is expected to continue contributing to TRSV detection in plant quarantine.

Electronic supplementary material

The online version of this article (doi:10.1007/s12088-015-0518-8) contains supplementary material, which is available to authorized users.     

荧光素标记的庚型肝炎病毒基因探针的制备及应用

参考国内外已完成测序的庚型肝炎病毒（ＧＢＶＣ／ＨＧＶ）基因序列,选取毒株间系列较保守的基因片段,并合成与之互补的核苷酸序列（Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ）,用末端转移酶将荧光素Ｎ６ｄｄＡＴＰ标记该片段,制成庚肝病毒基因探针。在严格控制温度的条件下,与固定于硝酸纤维膜（ＮＣ膜）上血清斑点杂交,洗膜后与抗荧光素碱性磷酸酶（ＡＰ）结合,加底物后化学发光自显影判断结果。该方法检测与套式逆转录聚合酶链反应（ＮｅｓｔｅｄＲＴＰＣＲ）检测结果的阳性符合率为８８．２％,阴性符合率为１００％;并且与其他相关病毒基因无交叉反应,具有较好的特异性与灵敏性。其检测结果比ＥＩＡ法检测庚肝病毒抗体更具临床意义。