人Elongator复合物Elp3亚基基因可显著补偿酵母elp3缺失菌株的生长缺陷

从HeLa细胞中分离的人的Elongator复合物在组成及与RNAPⅡ的作用方式上与酵母的Elongator复合物十分相似．但对其功能研究极少。为了研究人的Elongator复合物催化亚基Elp3的功能,将人elp3等基因转入酵母elp3基因缺失的突变菌株（elp3△菌株）,并对转化菌株进行功能互补实验和ssa和pho5基因表达分析,结果表明人elp3基因可显著恢复突变菌株对高温和Caffeine的敏感性．在低磷条件下显著补偿了突变株ph05基因表达延迟的缺陷．并可在热激条件下提高ssa3基因的表达。含酵母elp3非HAT区和人elp3 HAT区的融合yhelp3对上述缺陷有着更强的补偿能力。而HAT区催化结构域缺失的yhelp3HAT-没有任何补偿能力．表明人Elp3亚基可能与酵母的该亚基功能相似．人Elp3的HAT活性也为其行使功能所必需。     

人Elongator复合物Elp4亚基基因可部分补偿酵母ELP4缺失菌株的生长缺陷

为研究人Elongator复合物EIp4亚基的功能,将人ELP4基因转入酵母ELP4基因缺失的突变菌株(elp4△菌株)中,并对转化菌株进行功能互补实验和SSA3和PHO5基因表达分析,结果表明人的ELP4基因不能恢复突变菌株对高盐的敏感性,但可以在一定程度上缓解突变菌株对高温、咖啡因(Caffeine)和6-氮尿嘧啶(6-AU)的敏感性,部分恢复低磷条件下PHO5基因表达延迟的缺陷,并可在热激条件下提高SSA3基因的表达,因此人的ELP4基因可以部分补偿酵母ELP4基因缺失所引起的生长缺陷,提示人的EIp4亚基可能与酵母的该亚基功能相似。     

酵母组蛋白乙酰转移酶Elp3多克隆抗体的制备、鉴定及应用

酵母Elp3(Yeast elongation protein 3,yElp3)是组蛋白乙酰转移酶复合物Elongator的催化亚基,通过组蛋白乙酰化参与基因转录延伸。近来证实胞质中也存在的Elp3还参与胞外分泌、tRNA修饰等重要生物学过程。为深入研究Elp3的复杂功能,PCR法克隆pYES2-yElp3质粒中编码yElp3N末端亲水区段(22~94aa),构建原核表达载体pMXB10-yElp3-219,经IPTG诱导表达和几丁质柱纯化后免疫兔制备多克隆抗体。ELISA检测显示该抗体有较高的效价(不低于1:2500),免疫印迹结果表明该抗体可特异性识别表达纯化及酵母细胞中的Elp3蛋白,运用该抗体进行的染色质免疫沉淀揭示转入elp3?菌株的酵母/人融合的yhElp3之所以可补偿突变株的基因表达延迟缺陷,是因其直接参与SSA3基因的转录延伸。     

一种快速筛选人目的基因反义片段的简单有效方法

本文选取人elp3基因三个不同的区段(基因全序列、5'端非HAT区、3'端HAT区)构建了反义质粒pRS313al 644、pRS314al 107、pRS314a450,通过与人elp3基因共转化酵母后的功能互补和基因表达检测,筛选出可显著抑制人Elp3表达的5'端非HAT区1107bp有效反义片段.该片段在随后的HeLa细胞转染实验中被检测出可显著抑制Elp3的mRNA水平.表明利用该方法可避开繁琐的细胞培养和转染步骤,快速筛选到人类兴趣基因的有效反义片段.     

抗人Elp3 的N末端抗体制备及在染色质免疫沉淀中的应用

人 Elp3（human elongator protein 3, hElp3）具有组蛋白乙酰转移酶活性,是与延伸中的 RNA 聚合酶Ⅱ结合的 elongator 复合物的催化亚基,可参与组蛋白的乙酰化修饰与基因的转录延伸. Elp3 及其复合物功能异常与人类多种疾病相关. 为运用染色质免疫沉淀等手段深入研究 Elp3 功能,PCR 法克隆 pYES2-hElp3 质粒中编码 hElp3的N端亲水区段（1～69 氨基酸残基）,构建原核表达载体 pMXB10-hElp3-210,经 IPTG 诱导和几丁质柱纯化后,免疫兔制备多克隆抗体. ELISA 检测显示,该抗体有较高的效价(不低于1∶2　500).免疫印迹实验结果表明,该抗体可与纯化的及 HeLa 细胞中的 hElp3 蛋白特异性结合.运用该抗体对转入 elp3Δ菌株的人 Elp3 的染色质免疫沉淀实验结果表明,人 Elp3 可参与酵母 SSA3 基因的转录调控,这可能是人Elp3 能够部分补偿酵母 SSA3 基因延迟表达缺陷的原因.     

Elongator复合物:一种新的参与转录延伸的组蛋白乙酰转移酶

由6个亚基组成的Elongator复合物是RNA聚合酶Ⅱ（RNA polymeraseⅡ．RNAPⅡ）全酶的一个重要组成部分,它可以与高度磷酸化的RNAPⅡ相结合,其Elp3亚基具有组蛋白乙酰转移酶（histone acetyltransferase,HAT）活性,在以染色质为模板的转录延伸中发挥重要作用。Elongator是目前发现的第一个参与转录延伸的HAT复合物。     

延伸因子复合物对真核生物tRNA的修饰作用

延伸因子复合物(Elongator complex, Elp)由6个亚基蛋白Elp1～6组成,在真核细胞生物中呈现高度的进化保守,提示其具有重要的生物学功能。研究表明,Elp涉及多种细胞行为如转录延伸、细胞外分泌、端粒基因沉默和DNA损伤修复、神经系统的发育和功能等。然而越来越多的证据显示,Elp通过介导tRNA修饰影响翻译过程,从而间接调控上述细胞行为。在人类,ELP1/IKBKAP突变可导致家族性植物神经功能障碍症,ELP2、ELP3和ELP4基因的遗传变异也可能与其他神经退行性病变相关。本文对Elp的结构、Elp修饰tRNA和Elp相关疾病等的研究现状及其进展进行综述。     

酵母Pho80对Pho85蛋白激酶活性的调节

酵母pho80和pho85基因编码的蛋白质是阻遏型酸性磷酸酯酶基因表达调控系统中的2种负调控因子.其中pho85基因编码产物己被证明是1种类似于p34~(^cdc2/CDC28)的蛋白激酶,磷酸化该调控系统中的正调控因子Pho4,并使之失活,用抗pho85抗体从啤酒酵母YPH499及其衍生菌株的细胞抽提液中得到Pho85免疫复合物,对大肠杆菌表达的Pho4蛋白进行了体外磷酸化分析,证实酵母Pho80是Pho85蛋白激酶活力所必需,pho80基因的表达水平直接影响Pho85免疫复合物对Pho4蛋白的磷酸化程度.根据基因序列推导的Pho80蛋白氨基酸序列中,含有一段与几种cyclin同源的区域,通过寡核苷酸的插入或小片段缺失而对该区域及邻近部位在基因水平进行的微小改变均可导致Pho80丧失阻遏酸性磷酸酯酶基因表达的能力.     

互作蛋白质与复合物亚基的基因表达相关性比较分析

利用在多种应激条件下酵母的基因表达谱数据 ,分别计算互作蛋白质及复合物亚基编码基因的表达相关性。结果发现 ,相对于随机对照组 ,互作蛋白质的编码基因与蛋白质复合物的编码基因表达相关性均显著 (P <0 .0 1) ,即互作蛋白质及复合物亚基有共表达的倾向。通过比较 ,进一步发现蛋白质复合物亚基的基因表达相关性显著高于互作蛋白质的基因表达相关性 (P <0 .0 1) ,这与复合物亚基之间功能联系强于定义不甚确切的互作蛋白之间功能联系现象吻合。     

产甘油假丝酵母胞浆3-磷酸甘油脱氢酶基因（CgGPD）功能分析

【目的】从高产甘油生产菌株产甘油假丝酵母（Candida glycerinogenes）基因组中克隆了NAD+依赖3-磷酸甘油脱氢酶编码基因（CgGPD）,但是该基因及其上游调控序列具体的功能还是未知的。本文研究了CgGPD基因及其上游调控序列的功能。【方法】本文以酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）及其渗透压敏感型突变株为宿主,构建3种不同的酵母表达载体导入酵母细胞,研究了不同酵母转化子在渗透压胁迫条件下CgGPD基因表达对细胞的耐高渗透压胁迫应答及其细胞的甘油合成能力的影响。【结果】实验结果表明无论是以来源于S. cerevisiae 的TPI启动子还是来源于CgGPD基因的启动子,过量表达CgGPD基因的转化子均能够显著加速葡萄糖消耗速度和提高甘油合成能力,在gpd1/gpd2突变株中表达CgGPD基因能够消除细胞对外界高渗透压的敏感性,同时转化子胞内甘油大量积累。【结论】CgGPD基因在野生型酵母S. cerevisiae W303-1A表达显著提高细胞的甘油合成能力,在gpd/1gpd2突变株中能够互补GPD1基因的功能,CgGPD基因表达受渗透压诱导 调控。     

PHO80、PHO85基因和芽殖酵母金属离子耐受

PHO8 5基因是芽殖酵母中的一个多功能基因。它参与了无机磷酸的代谢、碳源利用、糖原积累、特定蛋白质的降解和细胞周期调控。研究了酵母株YPH499及其衍生的pho85缺失株、pho80缺失株、pap1(pcl7)缺失株在不同浓度的不同金属离子中的存活情况 ,结果表明和芽殖酵母YPH499相比 ,pho85缺失株和pho80缺失株表现出对K 、Mg2 、Zn2 、Ca2 和Mn2 的耐受下降 ,而PAP1基因的缺失则不会导致芽殖酵母对上述金属离子的敏感性的变化 ;而对Cu2 ,3株突变株都表现出和YPH499相同的耐受性。同时测定了各缺失株和YPH499对上述金属离子的半致死浓度以及pho85缺失株、pho80缺失株和YPH499的细胞内总钙量。这些结果显示 ,PHO85蛋白激酶通过和它的PCLPHO80而不是PAP1结合 ,参与了芽殖酵母K 、Mg2 、Zn2 、Ca2 和Mn2 离子平衡的调控。PHO85和PHO80基因的缺失损害了芽殖酵母钙的储存。     

粗糙脉孢菌26 S蛋白酶体三个亚基缺失菌株的构建及表型分析

【目的】通过构建26S蛋白酶体的3个亚基RPN4、RPN7、RPN10的缺失突变菌株,研究这些缺失突变体的表型,进而探究这3个亚基在蛋白酶体中的作用。【方法】采用同源重组基因敲除技术、电转化、粗糙脉胞菌杂交、子囊孢子萌发及PCR鉴定等方法分别获得3个调节亚基的基因缺失突变体。利用racetube和平板生长法进行突变体表型检测。【结果】得到rpn4和rpn10的缺失突变纯合体及rpn7缺失突变异核体菌株。【结论】与野生型相比,rpn7KO(ku70RIP背景)突变体的菌丝生长及产生分生孢子的能力显著减弱;rpn4KO突变体在生长初期的菌丝生长缓慢,而后期的产孢能力与野生型无显著差异;rpn10KO突变菌株的表型介于上述两种突变体的表型之间。这些结果表明26S蛋白酶体的这3个亚基对脉胞菌的生长和发育至关重要。     

白念珠菌ALS3、SSA1基因表达在念珠菌性阴道炎免疫机制中的作用

目的探讨白念珠菌ALS3、SSA1基因缺失对阴道上皮细胞激发免疫反应的作用。方法培养白念珠菌野生株及ALS3、SSA1基因敲除株(SC5314、Δals3、Δssa1),对其进行形态测定。按不同MOI感染人阴道上皮细胞系VK2/E6E7细胞,通过台盼蓝染色观察和乳酸脱氢酶(LDH)活性检测,评价不同MOI白念珠菌对上皮细胞的损伤作用;使用酶联免疫吸附试验(ELISA)评估感染过程中炎性细胞因子及趋化因子在共培养上清中的差异。结果 ALS3基因的缺失对白念珠菌芽管长度影响差异无统计学意义,而SSA1基因的缺失与其他两个菌株相比芽管长度减少约30%～40%(P<0.001)。台盼蓝染色观察及LDH测定发现,3株菌在感染上皮细胞时,其细胞损伤能力均与菌载量成正比;与野生型相比,Δssa1突变体在相同比率感染上皮细胞时,细胞损伤能力明显降低,且差异有统计学意义(P<0.05),Δals3突变株影响较小,甚至略微升高。检测炎性细胞因子及趋化因子发现,突变株在诱导上皮细胞产生促炎因子及趋化因子(GM-CSF、G-CSF、IL-1α、IL-8)的能力上明显减弱,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论 ALS3和SSA1基因表达在阴道上皮细胞抗白念珠菌感染的局部免疫应答过程中可能起到重要作用,且SSA1基因表达意义更大。     

以酵母单杂交体系克隆水稻RAPB基因cDNA及其序列测定

在一些真核基因的 5′上游区中存在核心序列为CCAAT的顺式元件 ,CCAAT结合蛋白以异源多聚体的方式结合于该顺式元件并行使转录调控功能 .CCAAT结合复合物至少存在 3个不同的亚基 ,且结合复合物的单个亚基都不具备DNA结合活性 .首次报道以酵母单杂交体系筛选方法 ,结合酵母功能互补法鉴定 ,从水稻中克隆了定名为RAPB的cDNA ,它编码与酵母CCAAT结合复合物中HAP2亚基具类似功能的蛋白 .RAPB蛋白的C端同样存在与HAP2功能域高度保守的区域 ,但其N端与其他HAP2类似蛋白间无明显的顺序同源性 ,且不存在谷氨酰胺丰富区 .根据Southern杂交结果推测 ,在水稻 (OrizasativaL .)基因组中仅存在一个拷贝的RAPB基因 .     

酿酒酵母PMT1与PMT3双基因缺失对细胞寿命的影响

研究蛋白质O-甘露糖转移酶(Protein O-mannosyltransferase,PMT)家族中PMT3基因缺失,以及PMT1与PMT3双基因缺失对酵母细胞复制性寿命的影响。采用一步基因置换法构建PMT3基因缺失酵母菌株(pmt3Δ),基于基因同源重组的原理,构建PMT1和PMT3双基因缺失酵母菌株(pmt1Δpmt3Δ);显微镜下分离和计数酵母子细胞的数目,统计酵母细胞复制性寿命。与野生型酵母细胞的平均复制性寿命(26代)比较,pmt3Δ菌株(24代,P0.05)和pmt1Δpmt3Δ菌株(25代,P0.05)的平均寿命均无明显变化,差异无统计学意义。酵母PMT3单基因缺失,以及PMT1和PMT3双基因缺失均不影响细胞的复制性寿命。     

p53相关蛋白激酶结合蛋白CGI-121

利用酵母双杂交技术从人的睾丸cDNA文库中鉴定得到p53相关蛋白激酶(PRPK)结合蛋白CGI-121,体外实验表明,重组CGI-121能抑制PRPK磷酸化p53第15位的Ser,未磷酸化p53进入泛素蛋白酶体途径,导致细胞增殖或肿瘤发生;然而,体内过表达CGI-121并没有显著的抑制PRPK磷酸化p53.Michael Downey等在研究cdcl3基因缺陷型酿酒酵母中筛选得到cdcl3-1突变体的抑制基因CGI-121,CGI-121是真核生物一个新的保守复合物--KEOPS复合物组成之一.KEOPS复合物具有促进端粒延伸和使端粒拆开的功能.CGI-121突变体在热敏感cdcl3-1酵母突变株中可以减少ssDNA的积累和缩短端粒;同时,在端粒功能异常芽殖酵母中CGI-121和piD261/Bud32促进端粒的拆开.然而,基因调控自身表达的机制以及在PRPK信号途径和KEOPS复合物中的扮演的角色有待于进一步研究.     

果蝇中整合素αPS3／βν介导吞噬细胞吞噬凋亡细胞和细菌

整合素是由2个跨膜α和β亚基组成的异源二聚体,具有各种细胞功能。整合素βν是果蝇整合素的β亚基,参与吞噬凋亡的细胞和细菌。该研究搜寻了与βν亚基形成复合物并共同作用的α亚基,通过RNAi感染动物模型检测发现,αPS3（而不是其他4个α亚基）是果蝇胚胎有效吞噬凋亡细胞所必需的。αPS3编码scb突变时,包括缺失突变、插入P元件或改变核苷酸序列,都能降低吞噬能力。这种降低作用能被过表达scb逆转。此外,用干扰RNA（RNAi）同时干扰苍蝇中αPS3和βν后,其吞噬能力与干扰任一个亚基相同。αPS3缺失也能降低幼虫血细胞吞噬金黄色葡萄球菌的能力。采用免疫共沉淀分析化学交联处理的果蝇细胞系发现,αPS3与βν具有物理相互作用。结果提示,整合素αPS3／βν是果蝇吞噬细胞吞噬凋亡细胞和细菌的受体。     

黄脂菌素生物合成基因簇中调控基因xanR3的功能

【目的】研究黄脂菌素产生菌灰黄链霉菌中编码ArsR家族转录调控蛋白(Arsenical resistance regulator)的xanR3基因的功能。【方法】利用大肠杆菌和链霉菌双亲本接合转移的方法,构建xanR3基因缺失突变株及回补突变株。利用cDNA在相邻同方向的基因间隔区进行PCR确定黄脂菌素生物合成基因簇中的转录单元。利用荧光定量RT-PCR方法进行突变株中黄脂菌素生物合成基因簇转录水平的检测。【结果】对得到的xanR3基因缺失突变株及回补突变株进行发酵,发现xanR3基因缺失突变株产黄脂菌素能力下降,回补菌株中黄脂菌素产量相比缺失突变株有一定程度的恢复,但仍未达到野生型水平。经鉴定,黄脂菌素生物合成基因簇中共有18个共转录单元,其中4个共转录单元在?xanR3突变株中转录水平明显下降。【结论】ArsR家族转录调控基因xanR3是黄脂菌素生物合成的正调控基因。     

产甘油假丝酵母HOG1 MAPK同源基因CgHOG1的克隆及特征分析

摘要:【目的】获得产甘油假丝酵母(Candida glycerinogenes)耐高渗和过量合成甘油的关键调控基因—丝裂原活化蛋白激酶基因(CgHOG1),并考察其渗透压调节功能。【方法】运用简并PCR 结合Self-Formed Adaptor PCR技术从产甘油假丝酵母基因组中克隆CgHOG1基因并进行生物信息学相关分析,将CgHOG1基因在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae W303-1A)hog1Δ缺失突变株中互补表达,考察菌株耐渗透压能力变化。【结果】所获得CgHOG1基因全长1164 bp,编码387个氨基酸序列(GenBank No. KC480066);氨基酸序列与来源于Ogataea parapolymorpha的Hog1p同源性最高,为86%;该基因在酿酒酵母hog1Δ缺失突变株中异源表达能够显著提高菌株的抗盐耐高渗和甘油合成能力。【结论】本文所获得的基因CgHOG1是一个具有耐高渗和过量合成甘油调控功能的新基因,研究结果为产甘油假丝酵母超高渗应答机制的研究及抗盐耐旱作物改造提供了新的基因。     

耐辐射球菌RNA聚合酶β亚基突变对基因表达全局的影响

RNA聚合酶的B亚基参与与利福平的结合,并在原核生物中高度保守．许多细菌中利福平耐药株的rpoB基因均有氨基酸改变．本实验室曾分离2两株耐辐射球菌（Deinococcus radiodurans）自发突变利福平耐药株（突变为：L420R和1258—669-bp缺失）．本研究发现,β亚基的变化对生长速度有独特的效果．利用DNA芯片技术和生化分析鉴定耐辐射球菌的利福平突变株如何调控基因表达改变生长速度的分子机制．参与代谢、细胞进程和信号传递以及信息贮存和处理的基因的转录在9bp缺失突变株中显著改变．9bp缺失突变株的上调基因的共有启动子序列为富含AT的序列．与野生株相比,L420R和9bp缺失突变株积聚了更多的活性自由基．这些结果初步探讨了D亚基突变调控基因的表达机制．