S-磺酸型胰岛素A链的二体

用凝胶过滤法测定胰岛素A 链的分子量,发现当用过量的亚硫酸钠和四硫硫酸钠将胰岛素拆开成S-磺酸型A 及B 链时,A 链以单体和二体两种形式存在。一旦除去亚硫酸钠和四硫硫酸钠,冷冻干燥后,A 链单体大部分转变成二体。将A 链样品长期放置,还会有四体、六体的聚合物出现。将回收的A 链二体透析冻干后,再用四硫硫酸钠及亚硫酸钠处理,A 链二体能拆开成单体,说明A 链单体间以硫硫键相连成二体。     

S-磺酸型胰岛素A链的二体

用凝胶过滤法测定胰岛素A链的分子量,发现当用过量的亚硫酸钠和四硫硫酸钠将胰岛素拆开成S-磺酸型A及B链时,A链以单体和二体两种形式存在。一旦除去亚硫酸钠和四硫硫酸钠,冷冻干燥后,A链单体大部分转变成二体。将A链样品长期放置,还会有四体、六体的聚合物出现。将回收的A链二体透析冻干后,再用四硫硫酸钠及亚硫酸钠处理,A链二体能拆开成单体,说明A链单体间以硫硫键相连成二体。     

S-磺酸型胰岛素B链的直线聚合作用 Ⅲ.S-磺酸型胰岛素B链的一些性质

前此报导,S-磺酸型胰島素B链(以下簡称B鏈)具有直綫聚合的性貭,并曾对其聚合过程进行了初步研究。为了进一步了解此聚合过程的机制,需要对B鏈单体的构型和其它性貭有所了解。关于氧化的磺酸型B鏈的性貭,文献中有一些报导。經重氢交换測定,此系一稍具螺旋結构的大肽。至于S-磺酸型B链,前此根据其旋光值判断,也具有一些螺旋构型。     

S-磺酸型胰岛素B链的直线聚合作用——Ⅰ.现象

在同种蛋白质分子间的相互作用中,直线聚合占有一特殊的地位。分子通过次级键的结合,首尾相连,又侧向聚集,形成纤维。此中,研究得最早的是结晶胰岛素形成纤维状胰岛素的过程;这个可逆的球状纤维状(G F)的变化,第一次填平了两大类蛋白质之间的鸿沟。Waugh和同工作者详细地研究了胰岛素直线聚合机制的一些方面。胰增血糖激素、镰刀状血红蛋白等与此同类。原肌球蛋白的直线聚合作用也有过不     

S-磺酸型胰岛素B链的直线聚合作用——Ⅱ.电子显微镜观察

在前文中我们报导了S-磺酸型胰岛素B链(以下简称B链)在pH6—9间直线聚合作用的一些现象和影响聚合作用的一些因素。根据粘度与流动双折射的变化,我们推断聚合过程可分成诱导、聚合与胶凝三个阶段。在诱导阶段,B链单体形成核心,此后核心乃发展而形成纤维。其解聚过程也经探索,但尚未找到彻底解聚的条件。     

S-磺酸型胰岛素B链的直线聚合作用 Ⅳ.几种有机物质的影响

前此报导了S-磺酸型胰島素B鏈(以下簡称B鏈)的直綫聚合作用,关于纤維中B鏈单体間的連接鍵及直綫聚合与单体构型間的关系,亦曾有过一些推測。蛋白质溶液中加入有机溶剂可以改变溶剂的介电常数,因而要影响蛋白貭分子間或分子內的作用力     

磺酸型及还原型胰岛素A链、B链的低场~1H-NMR谱峰的初步识别

以Varian-XL400核磁谱仪对磺酸型及还原型A链、B链在pH10.76时的低场~1H-NMR谱峰作了初步识别,指出它们的分辨率大大高于S—硫甲基型A链、B链谱峰的分辨率。并研究了十二烷基磺酸锂(LDS)对它们的影响。LDS的疏水尾部使酪氨酸受到疏水基因的屏蔽作用,导致峰值向高场位移。     

S-硫甲基型胰岛素A及B链相互作用的200MHz~1H NMR研究

前已报道,S-硫甲基型胰岛素A及B链相混后,α螺旋等有序二级结构含量增加,部分酪氨酸残基由相对亲水的环境逐渐转移到相对疏水的环境,整个过程在1.5～2小时达到稳定,说明在还原型A、B链能重组成有活力的胰岛素的相同条件下,两肽链间确实存在着次级键相互作用。本文报道以200兆赫NMR~1H谱所测S-硫甲基型A及B链的图谱,对其主要谱峰作了初步识别。在pH10.8时,A及B链以克分子比1.5:1相混后,Tyr的(2,6)位及(3,5)位质子峰较之单独链有低场位移,提示Tyr的酚羟基解离减少,Tyr转移至相对疏水的环境;也可能是肽链构象变化,使Tyr受去屏蔽效应所致。在A、B链相混后,每半小时累加的结果表明,不仅Tyr的两个低场峰随时间有低场位移,甲基峰随时间也有连续的低场位移,在1.5小时后达到稳定。此时间过程与前者报道的紫外差光谱、园二色性的观察结果一致,说明构象的调整涉及整个肽链。不同pH下的~1H谱测定显示,在一段pH区间都存在着A、B链间的次级键相互作用。上述结果表明,或许正是这种链间的次级键相互作用,才使A、B链之巯基有可能正确配对,重组成有生物活力的胰岛素分子。     

从胰岛素A及B链重合成胰岛素

(1)用亚硫酸盐及四硫硫酸盐将胰岛素的硫-硫键拆成S-磺酸基后,再经过离子交换或板型电泳分离,可以得到纯的A及B链。(2)用小白鼠惊厥法检查,S-磺酸型A及B链都不具有生物活力。用过量巯基乙酸将纯的A或B链的S-磺酸基还原为巯基,然后分别将还原型的A或B链溶液(pH 8.5)单独在空气中氧化也不产生活力。但将还原型A及B链混合,在同样条件下氧化时,可以获得有活力的产物。活力一般恢复到原活力的5-10%左右。(3)用还原型的A或B链分别与S-磺酸型的B或A链共同保温都可以得到有活力的产物。(4)将恢复活力的重氧化产物进行提纯的结果得到比活力为每毫克18.4国际单位的结晶。这样所获得的晶体其结晶形状、降血糖性质、电泳性质以及在三种溶剂系统中的比移都和结晶胰岛素相同。(5)以上晶体和结晶胰岛素的胃蛋白酶酶解图谱也基本上相同。     

还原型胰岛素A、B链相互作用的初步研究

本文报道在chance所用“一步法”重组胰岛素的类似条件下,还原型A、B链相互作用研究的初步结果。在pH10.6对S—磺酸型A及B链加入1.2倍SH/SSO_3—的二巯基苏糖醇,在一小时内A、B链与DTT的混合物较之单独的A、B链与DTT的混合物,紫外差光谱显示295、245nm负差峰,峰值随时间增大;园二色性测定观察到混合链的α螺旋含量比单独的A、B链有所增加。这表明在A、B链的巯基氧化生成二硫链前,还原型A、B链间的相互作用导致Tyr残基逐渐内埋,肽链构象的调整使有序二级结构增加。根据此时还原程度的测定,讨论了DTT与S—磺酸型A、B链作巯基交换的可能机制,过多的还原试剂易破坏已正确配对的二硫键,也妨碍肽链构象的调整。     

去B链C端五肽胰岛素类似物的制备和性质

A_1B_(29)-(MSC)_2胰岛素经胃蛋白酶限制性地水解得A_1-(MSC)-DPI。通过Edman降解方法,从A_1-(MSC)-DPI制备了B链N端缩短的DPI类似物,即:去B_1(Phe)-DPI,去B_(1-2)(Phe Val)-DPI和去B_(1-3)(Phe Val Asn)-DPI。本文还叙述了它们的生物活力。     

去B链羧端九肽胰岛素的制备和性质

去B链C端八肽胰岛素(DOI)经羧肽酶B作用除去B_(22)-精氨酸,产物经SP-SephadexC25分离以后得到电泳均一的去B链C端九肽胰岛素(DNI)。从CD光谱可以看出,在水溶液中DNI的构象比DOI更松散。DNI与人胎盘细胞膜胰岛素受体的结合能力很低,但却比DOI高一些。     

从胰岛素A及B链重合成胰岛素 Ⅲ.活力恢复水平的进一步提高

本文进一步改进了从A及B鏈重合成胰島素时的某些条件,如避免使用脲、控制还原温度及时間、改进沉淀还原产物时的pH使还原型A及B鎚的回收更为完全,以及控制重氧化时的温度等,最后胰島素活力恢复水平可以达到原活力的50%左右。同时我們观察了拆开胰島素三个硫硫鍵时其生物活力丧失的过程,初步认为胰島素的必需硫硫鍵数是二个。     

胰岛素A与B链在浓脲溶液中的变化

胰岛素硫-硫键可以用过量的亚硫酸钠与四硫硫酸钠作用而拆开成为S-磺酸型A与B链(以下简称A与B链)。Bailey等在8M脲溶液中用此法拆开蛋白质的硫-硫键,在我们以前的工作中也采用了类似条件。但是脲溶液在浓度较大、温度较高的时候会     

从胰岛素A及B链重合成胰岛素 Ⅳ.有关重合成的一些条件

利用二者溶解度的不同可以将无脲条件下拆开的胰岛素初分而得到较纯的S-磺酸型A及B链,再在中性pH用纤维素板电泳可以制得纯的S-磺酸型A链。将经过分离提纯的A及B链按不同比例重新混合还原重氧化结果表明活力恢复程度与A与B链的比例有关,A比B过量对活力恢复有利,A:B=1.5:1时活力恢复最高,可达天然胰岛素的50%左右。本文还对从S-磺酸型A及B链重合成胰岛素最有利的还原及重氧化条件进行了探讨,除其他条件外重氧化的最适pH为10.6。B链单独存在时其还原及重氧化速度均明显地较A链的相应速度为低,但二者共同存在时的还原及重氧化速度却与A链单独存在时相同,表明在溶液中自由A及B链间存在着对恢复活力有重要影响的相互作用,可能是通过次级链作用的相互作用。     

ATP－乙醛磺酸衍生物的荧光性质

２－氨基乙磺酸类似物乙醛磺酸（ＳＡＤ）具有荧光（ＥＸ：３１４ｎｍ;ＥＭ：４００ｎｍ）。ＳＡＤ与ＡＴＰ反应过程中醛基减少的时间动力学表明,ＡＴＰ在３７℃经过４小时可能完全与ＳＡＤ反应。ＳＡＤ与ＡＴＰ反应的结果可使ＡＴＰ的荧光增强约一倍。以上结果表明：ＳＡＤ可以在上述温和条件下与ＡＴＰ进行反应,因此,ＳＡＤ可能成为一种ＤＮＡ和ＲＮＡ的修饰或调节分子。     

ATP－乙醛磺酸衍生物的荧光性质

２－氨基乙磺酸类似物乙醛磺酸（ＳＡＤ）具有荧光（ＥＸ：３１４ｎｍ;ＥＭ：４００ｎｍ）。ＳＡＤ与ＡＴＰ反应过程中醛基减少的时间动力学表明,ＡＴＰ在３７℃经过４小时可能完全与ＳＡＤ反应。ＳＡＤ与ＡＴＰ反应的结果可使ＡＴＰ的荧光增强约一倍。以上结果表明：ＳＡＤ可以在上述温和条件下与ＡＴＰ进行反应,因此,ＳＡＤ可能成为一种ＤＮＡ和ＲＮＡ的修饰或调节分子。