一种新的抑制能力的比较指标

本文根据邹承鲁提出的酶活性不可逆改变的动力学原理,导出了以下新的定量衡量不可逆抑制剂抑制能力的比较指标来代替传统的I_(5。):初抑制力,J=(1-k′_( 2)/?K_( 2))·A;和终抑制力,j=(1-k′_( 2)/k_( 2))·A[Y]/A[Y] B。根据此指标比较了胰凝乳蛋白酶的抑制剂DFP、PMSF、TPCK的抑制能力。和传统的I_(50)相比,此指标的动力学意义清楚,与各动力学参数以及底物和抑制剂浓度等量的关系明确。同时可以用在抑制剂存在下的底物反应法方便地测定这些指标。     

OPTA对乳酸脱氢酶的抑制动力学

邹承鲁建立的酶活性不可逆改变动力学理论已为实验所验证,它不仅适用于单底物酶的抑制和激活的动力学研究,而且也适用于双底物酶反应系统.但在双底物酶反应系统中,底物和酶的结合方式有四种机制,即随机机制、有序机制、强制有序机制和乒乓机制,迄今为止这一动力学方法仅对随机机制的肌酸激酶进行了实验研究.而其它机制的实验研究尚未见诸报道.我们选用了有序机制的乳酸脱氢酶(LDH),用邻苯二甲醛(OPTA)为抑制剂对该酶的抑制过程进行了实验研究.结果表明,OPTA对该酶的抑制为不可逆抑制.其产物生成与时间的关系曲线符合邹氏方程:[P]=[P]_x(1-e~(-A[OPTA]).由ln([P]_x-[P])对t作图为一直线,表明它的抑制作用为单相动力学过程,抑制剂与酶的结合为一步反应.由直线的斜率A[OPTA]对[OPTA]作图为一过原点的直线.说明表观速度常数A与OPTA的浓度无关.OPTA与酶的结合为非络合型.测得的OPTA与EE-NADH结合的微观速度常数分别为:K(?)=49.6(mmol L)~(-1)min,(?)=2.31(mmol L)min~(-1)(?).明显小于(?)的事实表明.NADH对失活有明显的保护作用.OPTA是一个竞争性的不可逆抑制剂.用传统的方法测得的(?)为42.5(mmol L)min~(-1).与邹氏方法测得的结果非常接近.     

银杏叶丙酮提取物对动物脂肪酸合酶的抑制

银杏叶丙酮提取物(AEGL)对动物脂肪酸合酶(FAS)有强抑制作用。选定的萃取条件是室温下用60%丙酮搅拌萃取30~60min。该萃取液IC50值为4.66μg/mL,抑制能力明显强于已知的FAS抑制剂,有效物的初步分离显示,对FAS有抑制作用的成分可能存在于黄酮组分中。酶学动力学研究表明,抑制包含可逆抑制和不可逆抑制两部分。推测酮酰还原功能域(KR)的NADPH结合部位是其作用部位之一。标准银杏叶提取物EGb761对FAS的可逆抑制和不可逆抑制都明显比银杏叶的60%丙酮萃取液弱,后者对NADPH呈现比较明显的竞争性,不同于EGb761,这表明银杏叶还具有新的应用开发领域。     

SARS冠状病毒主蛋白酶抑制剂的筛选及抑制动力学研究

对SARS冠状病毒主蛋白酶(SARS-CoV M^pro)进行异源重组表达与提纯,并以其为靶点,利用基于荧光共振能量转移(FRET)技术的体外药物筛选模型,对蛋白酶抑制剂聚焦库96种化合物进行了体外抑制活性的评价,并从动力学的角度探讨筛选出的阳性化合物对SARS-CoV M^pro的抑制能力与机制。结果表明:通过筛选获得抑制率>80%、淬灭率<20%的化合物5种,为P-1-08、P-1-19、P-2-24、P-2-28、P-2-54,其半数有效抑制浓度(IC₅₀)分别为:0.69±0.05μmol/L、1.19±0.41μmol/L、0.14±0.01μmol/L、1.36±0.07μmol/L、0.36±0.03μmol/L。其中化合物P-1-08、P-1-19、P-2-24、P-2-54对SARS冠状病毒主蛋白酶的抑制作用为不可逆抑制,化合物P-2-28的抑制作用为可逆抑制。根据Lineweaver-Burk图和Dixon图的研究,发现化合物P-2-28对SARS冠状病毒主蛋白酶呈竞争性抑制,抑制常数Ki为0.81μmol/L。通过对底物浓度,IC₅₀值及Ki值关系的研究,进一步验证了P-2-28的抑制作用为竞争性抑制。该抑制剂的发现为SARS冠状病毒主蛋白酶抑制剂的研究打下基础,为抗SARS病毒药物开发提供了先导化合物。     

蓝藻Anabaena sp.PCC7120 羧体碳酸酐酶的鉴定

在丝状蓝藻Anabaena sp.PCC7120细胞粗提液的碳酸酐酶(CA)分析中,发现了两种形式的CA活性.高CO_2下生长的细胞,在35μmol/L EZ(Ethoxyzolamide,碳酸酐酶的抑制剂)存在的情况下,CA总活性的85％左右被抑制,其半抑制浓度I_(50)为7.4μmol/L;随着EZ浓度的继续增加,CA活性在EZ浓度达到约150μmol/L处出现了第二个抑制峰,在250μmol/L处抑制程度达到最大,使CA总活性的15％被抑制,其半抑制浓度I_(50)为190μmol/L。在空气条件下生长的细胞中也出现了CA的两个抑制峰:低I_(50)为6μmol/L,高I_(50)为120μmol/L,对羧体的分离及体外测试表明,在羧体制备物中的CA活性只有一个EZ的抑制峰,而且在EZ浓度达到35μmol/L,正如所期望的那样,该CA活性全部被抑制。其半抑制浓度I_(50)为5.2μmol/L左右。这个值跟空气或高CO_2条件下生长的细胞粗提物中的低I_(50)(6μmol/L或7.4μmol/L)十分相似。说明低浓度的EZ可以特异性地抑制定位于羧体的CA活性。另外一种形式的CA,具有高I_50(120—190μmol/L),约占CA总活性的15—20％,则有可能定位于细胞质膜。     

化学发光法用于芳香酯酶抑制剂体外筛选

在前期的研究中,我们将9-(4-氯苯氧羰基)-10-甲基吖啶酯三氟甲基磺酸盐(CPOCMA)用于测定血清芳香酯酶活性,取得满意结果.在此基础上,本文以CPOCMA为底物,建立化学发光法评估药物对芳香酯活性影响的新方法.以硝酸甘油为模型药物,比较了化学发光法与UV方法的一致性.并将此法应用于评价三种抗炎药吲哚美辛、阿司匹林和乙酰氨基酚对芳香酯酶活性的影响.药物的加入使血清催化CPOCMA水解的动力学减缓,这表明这些药物均为抑制剂.吲哚美辛、阿司匹林和乙酰氨基酚表现出的IC50值分别为0.254、0.564和0.656 mmol/L,抑制常数ki分别为0.154、1.38和2.98 mmol/L.加入药物后的Lineweaver-Burk曲线表明这三种药物对PON的抑制均为竞争性抑制.根据加入药物后的动力学曲线,其IC50值、抑制常数和米氏常数的变化均表明这三种药物的抑制能力大小顺序:吲哚美辛阿司匹林乙酰氨基酚.CPOCMA可以作为PON底物体外评价药物对PON的抑制能力和抑制机理.UV法不适合评价紫外吸收峰与UV法的检测波长重叠的药物,而新建立的化学发光法对这类药物的筛选有独特优势.     

认识不可逆抑制酶促反应

认识不可逆抑制酶促反应任维栋,张桂春（潍坊医学院生化教研室,山东潍坊２６１０４２）关键词不可逆抑制作用,酶,动力学不可逆抑制剂对研究酶的活性中心、药物毒物的作用机理及物质代谢途径与调节起着重要作用。１９６５年,邹承鲁发表了不可逆抑制酶促反应动力学的论...     

何首乌提取物对脂肪酸合酶的抑制作用

最新报道脂肪酸合酶 (FAS)是治疗肥胖症的潜在靶部位 ,但目前已知的FAS抑制剂还很少 .测定表明 ,中药何首乌提取物对FAS同时具有很强的快结合可逆抑制和慢结合不可逆抑制作用 .萃取的最佳溶剂为 4 0 %乙醇水溶液 .该提取物对FAS全反应的半抑制浓度为 0 .0 0 5mg ml(以萃取时中药重量计 ) ;不可逆抑制过程为两相 ,在 0 4 6mg ml浓度下在 0 5min内快相失活超过 5 0 % ,慢相在 32min时失活达 90 % .该提取物对FAS中的酮酰还原反应有强抑制 ,半抑制浓度为 0 0 18mg ml,对烯酰还原反应有弱抑制作用 .抑制动力学分析表明 ,何首乌提取物对FAS的抑制和底物NADPH之间呈非竞争性关系 ,和丙二酰辅酶A接近竞争性关系 ,而与乙酰辅酶A为反竞争性关系 .推测何首乌还含有作用于FAS中的丙二酰转酰酶的抑制剂 .用何首乌提取物口服饲喂大鼠 ,可明显减低大鼠摄食量和降低大鼠体重 ;实验结束时实验组大鼠肝脏FAS活性低于对照组 .以上结果表明 ,中药何首乌提取物对FAS有很强的抑制作用 ,其抑制能力明显强于已知抑制剂 ,其动力学表现也和已知抑制剂完全不同 ,预计为新的抑制剂 ,对研究FAS的作用机理及在防治肥胖症的应用上可能具有重要的价值     

氨基葡萄糖对酪氨酸酶的抑制作用

通过对酪氨酸酶催化底物L-DOPA反应速率的观察测定,研究了氨基葡萄糖（G-NH2）对酪氨酸酶的抑制作用。在反应液中加入50μL浓度为2.2 mg/mL G-NH2时（体系中G-NH2终浓度为36μg/mL）,酶抑制率为50%。GNH2对酪氨酸酶的抑制作用是个复杂的过程,酶反应呈先促进后抑制。分析酶抑制曲线Lineweaver-Burk双倒数图,得出G-NH2为混合抑制剂,进一步研究发现多巴醌生产量会减少,抑制类型是不可逆抑制。     

基于重组HepG_2-P4503A4与HepG_2-P4503A46全细胞体外药物代谢比较研究

本研究以探针药物硝苯地平(NF)、睾酮(TST)及其抑制剂酮康唑(KCZ)与重组HepG2-P4503A4、HepG2-P4503A46细胞全细胞在优化的重组细胞浓度、药物浓度、孵育时间等条件下进行体外孵育,通过高效液相色谱仪检测其药物代谢(抑制)动力学参数,并将二者进行比较分析。重组HepG2-P4503A46与HepG2-P4503A4细胞的硝苯地平、睾酮的代谢活性无显著差异(P0.05);在0~10μM的浓度范围内,酮康唑对硝苯地平和睾酮的抑制活性均随酮康唑浓度的增加而增加,且其IC50值均低于1μM,为nM级,表明酮康唑对二者的硝苯地平代谢具有较强的抑制活性,抑制剂酮康唑对重组HepG2-P4503A46与HepG2-P4503A4细胞的抑制活性差异不显著(P0.05)。本研究表明无论是底物代谢或底物抑制活性,重组HepG2-P4503A46细胞均与重组HepG2-P4503A4细胞差异不显著,P4503A46可能为巴马小型猪体内人P4503A4的同源酶。     

Mg^2＋对豚鼠心室肌细胞ATP敏感钾电流的抑制作用

利用全细胞电压钳方法研究了细胞外高Mg~(2 )对豚鼠心室肌细胞I_(k,ATP)(ATP敏感钾电流)的作用。细胞的I_(k,ATP)是被代谢抑制剂2,4-二硝基酚(DNP)激活的,可被特异性阻断剂优降糖完全阻断。细胞外8mmol/L MgSO_4几乎能完全抑制DNP激活的I_(k,ATP)膜电位0mV水平时抑制率为92±8.6％;4mmol/L MgSO_4可部分抑制I_(k,ATP),抑制率为44±14.6％。Mg~(2 )与ATP联合使用对I_(k,ATP)的作用与Mg~(2 )单独作用无明显差异。结果提示,抑制I_(k,ATP)是Mg~(2 )防止缺氧或缺血状态下心肌细胞动作电位时程缩短的一个重要原因,因而可能也是Mg~(2 )抗缺血性心律失常的重要机制。     

猪L型、R型丙酮酸激酶同工酶动力学的进一步研究

本文对纯化的猪L型、R型丙酮酸激酶(PyK)同工酶的效应剂动力学作进一步研究。结果如下:1.FDP能激活两型PyK同工酶,使两型PyK对PEP的正协同别构效应降低(n_H减小),亲和力增高(S_(0.5)降低)但不影响两型PyK对ADP的Km。2.Mg~(++)对两型PyK同工酶也有相似的激活作用。3.丙氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸及ATP对两型PyK均有抑制作用,两酶相应的抑制百分率无显著差异。三种氨基酸均为两型PyK底物PEP的K型抑制剂,ATP则为两型PyK底物PEP的V型抑制剂。4.上述三种氨基酸对L型和R型PyK的抑制均呈别构负协同动力学。n_H均小于1,两型PyK相应的抑制常数K_i比较接近。还对PyK加热后的脱敏及PyK的反应机制作了探讨。     

青鱼腸胃道中蛋白酶的初步研究

(1)从淡水魚青魚腸胃道中提取出魚蛋白酶,酶制剂活力以酪蛋白作底物約为結晶胰蛋白酶的1/3。酶的前身有酶原存在,激活最适pH为8。(2)酶作用的pH偏于碱,水解酪蛋白和B-精-NH_2的最适pH都为9,酶和酶原对酸都不稳定,当pH低于4吋,酶活性和酶原激活的能力迅速丧失。(3)此酶对热很稳定,反应温度55度时,反应速度仍符合Arrhenius定律。測得水解酪蛋白和B-精-NH_2的活化能分别为14.6千卡/克分子及8.0千卡/克分子,較之胰蛋白酶水解此同一底物所需的活化能为低,尤以后者更显著,約相当于1/2值。(4)对小底物的水解以B-精-NH_2活力最高,K_m=3.3×10~(-3)M(40度pH8.7),为胰蛋白酶水解此同一底物所得K_m值的二分之一,对胰凝乳蛋白酶的底物B-酪-NH_2不作用,而对Cbz-甘-苯丙及白-NH_2却有較明显的活力。(5)半胱氨酸(10~(-3)M)和PCMB(10~(-4)M)对酶活力无影响,但能被DFP和胰蛋白酶抑制剂所抑制。DFP的抑剂随其与酶保温时間的增长而增大。lO~(-4)MDFP与酶液保溫10小时后能抑制酶活力达60%。胰蛋白酶抑制剂对此酶抑制的作用与抑制胰凝乳蛋白酶相类似。(6)从青魚腸胃道中找到有类胰蛋白酶抑制剂的存在。对魚本身蛋白酶有显著的抑制作用,对胰蛋白酶亦能抑制,但抑制能力較弱。     

棉酚对大鼠肾脏γ-谷氨酰转肽酶动力学的影响

本文应用动力学分析观察了棉酚对大鼠肾脏γ-谷氨酰转肽酶(γ-GT)的抑制作用。实验结果证实了棉酚在体外是大鼠肾脏γ-GT的抑制剂,而且抑制常数远小于r-GT的天然抑制剂——马尿酸。在不同浓度的棉酚作用下,改变双底物浓度,测定其活力并应用Lineweaver-Burk双倒数作图法,测得棉酚在两种底物情况下,对γ-GT的抑制作用均呈非竞争性抑制。     

菝葜皂甙原对Na~ 、K~ -ATP酶抑制的动力学研究

本文对菝葜皂甙原抑制Na~ 、K~ -ATP酶的动力学与机理进行了研究,并且与哇巴因的抑制作用进行了比较。动力学研究表明菝葜皂甙原抑制Na~ 、K~ -ATP酶,对底物Na~ 、K~ 均为混合性抑制剂;而对ATP则为反竞争性抑制剂。观察了磷脂对哇巴因和菝葜皂甙原抑制Na~ 、K~ -ATP酶的影响。磷脂不影响哇巴因的抑制作用;但多种磷脂都不同程度地降低菝葜皂甙原对Na~ 、K~ -ATP酶的抑制作用。     

绿藻Dunaliella salina钙依赖蛋白激酶的特征(英文)

通过凝胶过滤从绿藻Dunaliella salina中分离出一种新类型的钙依赖但非钙调素、磷脂依赖的蛋白激酶,用凝胶过滤法测得此酶的天然分子量为52kD。该酶的活性既依赖于Ca~(2 )也需要Mg~(2 ),最适浓度为4mmol/L。NaCl和KCl对酶活性具抑制作用。蛋白酶抑制剂K-252a和staurosporine可抑制该酶活性,但半抑制浓度 (IC_(50))远高于对蛋白激酶C(PKC)。当PKC专一性抑制剂sphingosine浓度高达800μmol/L时,对该酶只表现微弱的抑制效应。碱性的组蛋白H1为所测定的蛋白质底物中最适的底物,而酸性的酪蛋白不被磷酸化。磷酸化氨基酸残基分析表明,该酶属丝氨酸/苏氨酸型蛋白激酶。     

赤小豆抑制剂对胰蛋白酶不可逆抑制作用的动力学探讨

本文从中药赤小豆(Phaseolus Calcaratus,Roxb)中分离出一种胰蛋白酶抑制剂。通过一系列酶促反应动力学的研究表明,赤小豆抑制剂对胰蛋白酶有较强的不可逆竞争性抑制作用。其Km和ki值分别为1.43×10~(-3)mmol/L和2.4×10~(-6)mmol/L。     

假单胞杆菌DM1在二氯甲烷降解过程中的微生物动力学

采用半连续培养技术研究了假单胞杆菌(Pseudomonas)DM1在二氯甲烷降解过程中的微生物动力学。高浓度底物二氯甲烷和高浓度产物氯化物对DM1的生长和底物的消耗具有严重的抑制效应。反应的最佳浓度条件是：CH₂Cl₂ 1．2mmol／L,氯化物<100mmo1／L。当二氯甲烷或氯化物浓度高于其极限浓度时,细菌失活并自溶,p≤O。对于具有严重底物抑制的发酵过程,特别是以有毒化台物为唯一碳源的生物降解过程,本文提出一个新的动力学模型。由两项组成,第一项反映了传统的Monod类型的可逆络合机理,第二项表示有毒物质对生物体代谢作用的不可逆抑制效应。该模型比其他传统模型能更好地描述二氯甲烷的生物降解过程。     

多巴胺类似物抑制二氢蝶啶还原酶的研究

多巴胺类似物对二氢蝶啶还原酶有明显的非竞争性抑制作用(Ki或I_(50)值为10~(-5)—10~(-6)mol/L)。其中阿朴吗啡是最强的抑制剂之一(Ki或I~(50)=1-2×10~(-6)mol/L)。由于酪氨酸羟化酶和二氢蝶啶还原酶包含于同一酶促反应过程中,且限制了多巴胺合成的决定速度的那一步。这些结果可能提示出被多巴胺抑制的酪氨酸羟化作用包含着对这二种酶的抑制作用。     

蛋白磷酸酶-1对凋亡酶-3水解的PAK2活性的负调控机制

p21激活的蛋白激酶2(PAK2)可以通过与小G蛋白Cdc42和Rac结合而激活, 也可以通过凋亡酶-3(caspase-3)的水解作用而激活. PAK2的这2种激活方式都需要其402位苏氨酸残基(Thr-402)发生自磷酸化. 对于PAK2激活的研究已经有近10年的时间, 但PAK2活性的负调控机制仍然不清楚. 本文采用酶活性不可逆改变动力学的方法研究了蛋白磷酸酶1催化亚基(PP1a)对凋亡酶-3(caspase-3)水解的PAK2活性的调控机制. 根据在PP1a存在下PAK2的底物反应动力学方程, 我们确定了游离酶和酶-底物复合物的微观失活动力学常数. 结果表明: (ⅰ) PP1a可以直接使PAK2活化环上的Thr-402去磷酸化, 从而下调PAK2的激酶活力; (ⅱ)外源蛋白或多肽底物结合在PAK2活性位点上可以降低PAK2自激活和失活的速度. 本文所建立的方法不仅可以用于研究酶活性调节的修饰反应动力学, 还可以研究底物对修饰反应的影响, 为研究蛋白激酶和磷酸酶的作用机理奠定了理论基础.