水分胁迫对小麦抗氰呼吸途径发生、运行及基因表达的影响

小麦 (Triticumaestivum L .cv .LongchunNo .16)幼苗根部在 -0 .5MPaPEG溶液中渗透胁迫 2 4,48和 72h ,使叶片分别受到轻度、中度和重度水分胁迫 ,而根则只受到轻度胁迫 .与此相对应 ,叶片的交替途径容量 (V_alt)、实际运行活性 ( ρV_alt)、运行系数 ( ρ)及其对总呼吸的贡献 ( ρV_alt/V_t)均呈递降趋势 ,而根的V_alt,ρV_alt,ρ值和ρV_alt/V_t在胁迫 2 4h时下降 ,此后在进一步的胁迫过程中有所恢复 ,表明抗氰呼吸对轻度水分胁迫有一适应过程 .用烟草交替氧化酶基因 (Aox)探针进行的northern杂交结果显示 ,水分胁迫下叶片和根中AoxmRNA水平的变化与它们各自V_alt和 ρV_alt的变化趋势一致 ,说明水分胁迫通过抑制Aox基因的表达而降低了抗氰呼吸的发生能力和运行活性 .     

乙型肝炎病毒pre-S1区中和抗体可变区的原核表达

鼠源单克隆抗体MA18/7是特异识别乙型肝炎病毒 (HBV)pre S1抗原的中和抗体。为表达MA18/7的小分子抗体 ,将MA18/7的重链可变区基因(V_H)和轻链可变区(V_L)基因分别克隆到原核表达载体pTO-T7进行原核表达。结果V_H和V_L均以包涵体的形式高效表达 ,包涵体经过变性、复性及金属离子亲和纯化后获得纯度>90%的重组抗体片段。生物传感器、竞争ELISA和间接ELISA测定均显示 ,V_H 或V_L 均不能结合相应抗原 ,但二者体外混合后可迅速非共价结合形成具有良好活性的可变区抗体Fv,表明MA18/7的抗原结合活性区由重链可变区和轻链可变区共同组成.     

抗A型产气荚膜梭菌α毒素单链抗体基因的克隆和表达

应用RT PCR技术 ,从分泌具有中和活性的抗A型产气荚膜梭菌α毒素单克隆抗体的杂交瘤细胞中 ,扩增出抗体V_H 和V_L 基因 ,连接成ScFv基因 ,并将其克隆至pGEM T载体中构建了重组质粒pXScFv 2E3。经序列分析证实 ,V_H 和V_L 基因及linker基因拼接正确 ,基因全长为 726bp ,编码 242个氨基酸。随后将其定向克隆于表达载体pHOG21,转化至大肠杆菌XL1 BLUE筛选出表达菌株XL1 BLUE(pHOG 2E3)。经ELISA和SDS PAGE分析表明 ,在20℃用IPTG诱导培养时 ,表达的ScFv蛋白占菌体总蛋白的 25 %。并且ScFv基因表达产物能够中和α毒素的磷酯酶C活性     

抗人黑色素瘤单链抗体基因在大肠杆菌中的融合表达

应用RT-PCR技术从分泌抗人黑色素瘤单克隆抗体的杂交瘤细胞HB8760中克隆了抗体轻、重链可变区基因,用(Gly₄Ser)₃连接肽基因将V_H、V_L连接成ScFv基因,并进行了序列测定。ScFv基因全长927bp,其中VH基因长360bp,编码120个氨基酸,V_L基因长324bp,编码108个氨基酸。在大肠杆菌融合表达载体pGEX-4T-1中表达了GST-ScFv融合蛋白,表达产量占菌体总蛋白的29%。凝血酶消化后的产物具有黑色素瘤细胞结合活性。     

抗CEA单链抗体与链亲和素融合基因的表达

克隆分泌CEA杂交瘤细胞重链可变区（V_H）和轻链可变区（V_L）,以Linker连接V_H及V_L构建抗CEA单链抗体.同时以Spacer连接单链抗体和链亲和素,构建成功单链抗体和链亲和素融合基因,克隆该融合基因至原核表达载体,pET21a(+),经IPTG诱导表达出该双特异性融合蛋白.活性鉴定表明该融合蛋白具有结合CEA及生物素的双特异性.该融合蛋白在生物领域中有较广阔的应用前景.     

全人源化抗结肠癌单链抗体基因的克隆和表达

分离大肠癌患者外周血单个核细胞 (PBMC) ,在体外用灭活的大肠癌细胞再次致敏后 ,经EBV转化 ,然后用有限稀释法克隆分泌抗大肠癌细胞抗体的B细胞 ;多次PCR扩增和克隆其抗体可变区基因 (V_H/V_LcDNA) ,并用编码 (Gly₄Ser)₃ 的互补序列连接成ScFvcDNA(V_H linker V_L) ,经酶切克隆入载体fUSE 5RF ,使之呈现于噬菌体表面。通过用 3轮肿瘤细胞和正常人PBMC淘选后 ,ELISA检测 80%的单克隆噬菌体抗体显示了很强的阳性反应。以上结果初步说明 :联合应用体外致敏、EBV转化、PCR扩增和噬菌体呈现技术制备高亲和力全人源化的抗肿瘤抗体是可行的.     

Kinetics of urea uptake by Melosira italica (Ehr.) Kütz at different luminosity conditions

The kinetic parameters K_m and V_max for urea uptake by Melosira italica were determined at 160 μeinsteins m⁻² s⁻¹ and in the dark. The transport systems showed an affinity for the substrate and a storing capacity in the dark (K_m = 65.07 μM; V_max = 2.18 nmoles 10⁵ cells ⁻¹ h⁻¹) greater than under 160 μE m⁻² s ⁻¹ (K_m = 111.2 μM; V_max = 1.11 nmoles 105 cells⁻¹ h⁻¹). Similarly, a reduction in consumption rate of urea under increasing photon flux densities was observed. The use of an inhibitor (potassium cyanide) indicated that the uptake process requires metabolic energy. That urea transport is more important in darkness, may constitute a survival strategy in which this compound is utilized by cells mainly during heterotrophic growth.     

高温放线菌V4菌株热稳定β-淀粉酶的产生及其性质的研究

高温放线菌V₄菌株(Thermoactinomyces sp.V₄)产生的β－淀粉酶最适反应温度为70℃,最适pH为6,酶的热稳定性良好,50℃(4h)不失去酶活力,55℃(2h)保持最初活力的92％,酶对可溶性淀粉的水解率达77％,纸层析结果显示水解产物主要为麦芽糖,经旋光测定,水解产物具有β－构型。巯基抑制剂对此β－淀粉酶无抑制作用。V₄菌株同时产生异淀粉酶及少量的－菌一淀粉酶。     

高大气CO2浓度下小麦旗叶光合能量利用对氮素和光强的响应

采用开顶式气室盆栽培养小麦,设计2个大气CO₂浓度、2个光照强度和2个氮水平的组合处理,通过测定小麦叶片光合速率-胞间CO₂浓度响应曲线和叶绿素荧光参数,来测算小麦叶片光化学速率、光合电子传递速率以及叶绿体磷酸丙糖利用效率(TPU)等参数,研究施氮量和光强对高大气CO₂浓度下小麦旗叶光合能量传递与分配的影响,以阐明全球气候变化下植物光合能量分配对光合作用适应性下调的作用机制及其氮素调控。结果表明,大气CO₂浓度升高后小麦叶片的光呼吸电子传递速率(J₀)和Rubisco氧化速率(V₀)显著下降;光合电子流的光化学传递速率(J_C)、Rubisco羧化速率(V_C)和TPU则明显升高,而且施氮后变化幅度加大;小麦叶片J_C/J_F(PSⅡ反应中心总电子流速率)和TPU/V_C显著增加,经过PSⅡ反应中心的电子流更多地进入碳同化过程,表现较高的光合速率(P_n)。遮荫提高了叶片光化学速率和PSⅡ反应中心总电子流速率(J_F),这一作用在低氮叶片尤为突出,但使得J₀和V₀明显升高,并显著降低J_C/J_F,所以P_n明显下降。正常光照条件下,增施氮素可提高小麦叶片的J_F、J_C、V_C和TPU,并使高大气CO₂浓度下J₀和V₀较正常大气CO₂浓度处理显著降低,有效地提高了植物叶片对光能的利用效率;遮荫后高大气CO₂浓度下小麦叶片J_C、V_C、TPU、J_C/J_F和TPU/V_C显著高于正常大气CO₂浓度处理,而且这一变化不受氮素水平的显著调节。因此,氮素在高大气CO₂浓度下对小麦叶片光合能量利用的调节因光强而异,正常光照下可显著改善小麦叶片对光合能量的利用状况,而遮荫后这一作用减弱。     

抗肿瘤血管抗体AA98功能片段VH/κ的脲浓度梯度柱复性

利用稀释法、凝胶过滤、脲浓度梯度凝胶过滤3种方法研究了抗肿瘤血管抗体功能片段V_H/κ的体外复性.通过考察复性液中还原型谷胱甘肽/氧化型谷胱甘肽(GSH/GSSG)比例、精氨酸浓度、pH值、洗脱速度、变性液中蛋白质浓度、凝胶过滤脲梯度长度等因素,发展了脲梯度凝胶过滤柱复性V_H/κ的方法.结果表明,与传统的稀释法和柱复性法相比,脲梯度法复性获得的V_H/κ的活性回收率和相对亲和力均有显著提高.     

金针菇在淀粉废水中发酵的营养条件研究

用摇瓶试验对金针菇菌丝体在淀粉废水中培养的营养条件进行了研究。结果表明,利用淀粉废水进行金针菇液体发酵的最适营养条件为：经液化处理的淀粉废水,加KH₂PO₄0.25 g/100 mL,MgSO₄·7H₂O0.05g/100mL,V_B1150μg/L,V_B250μg/L,pH5.40。测定了该营养条件下菌体的生长曲线及发酵过程中培养基残糖的变化。发酵周期为7d,发酵终点生物量达2.08 g/100 mL,COD去除率为70.8%。     

抗肿瘤血管三结构域单链抗体VH/L的构建与表达

以本室研制的一株抗肿瘤血管单克隆抗体AA98为基础,采用PCR扩增抗体AA98基因的重链可变区(V_H)和轻链(L),以重链恒定区1(C_H1)5′端12个氨基酸的序列作为连接肽,并将连接肽中的Lys突变为Ser,构建VH连接肽-L三结构域单链抗体。重组VH/L单链抗体在大肠杆菌中得到了高效表达,其表达量占菌体总蛋白质的20%。表达的蛋白质在菌内形成包含体,经凝胶过滤法复性,获得了有抗原结合活性的V_H/L。该三结构域单链抗体的成功构建和复性,为重组抗体片段的研制提供了借鉴。     

DCE-MRI联合DWI对直肠癌患者术前T、N分期及系膜淋巴结良恶性的诊断价值

摘要 目的：探讨动态对比增强磁共振(DCE-MRI)联合弥散加权成像（DWI）诊断直肠癌术前T、N分期和系膜淋巴结良恶性的价值。方法：收集2017年2月至2019年10月中国医科大学附属本溪中心医院和中国医科大学附属盛京医院接诊的80例直肠癌患者,均进行常规核磁共振成像（MRI）、DCE-MRI、DWI扫描,获得DCE-MRI、DWI定量参数[转运常数（K ^trans ）、细胞外血管外空间的体积分数（V _e ）、速率常数（K _ep ）、表观扩散系数(ADC)],比较不同T、N分期、不同性质系膜淋巴结DCE-MRI、DWI参数,及其对T、N分期和系膜淋巴结性质的诊断效能。结果：直肠癌癌灶K ^trans 、 K _ep 、V _e 高于正常肠壁,ADC低于正常肠壁（P＜0.05）。TNM分期为T_Ⅲ～Ⅳ期的患者K ^trans 、 K _ep 、V _e 高于T_Ⅰ～Ⅱ期,ADC低于T_Ⅰ～Ⅱ期（P＜0.05）;TNM分期为N₁期的患者K ^trans 、K _ep 、V _e 高于N₀期,ADC低于N₀期（P＜0.05）。联合诊断的灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值较高。结论：DCE-MRI联合DWI对直肠癌术前T、N分期、系膜淋巴结性质诊断价值较高。     

抗松材线虫纤维素酶单链抗体库的构建及筛选

构建鼠源性松材线虫纤维素酶（Bursaphelenchus xylophilus cellulase, BXC）的噬菌体单链抗体库,从中筛选特异性BXC的单链抗体。以BXC为抗原免疫BALB/C小鼠,从脾脏提取总RNA,用RT-PCR技术扩增小鼠抗体重链（V_H）和轻链(V_L)可变区基因。经重叠PCR(SOE-PCR)在体外将V_H和V_L连接成单链抗体(scFv)基因,并克隆到噬菌粒载体pCANTAB5E中,电转化至大肠杆菌TG1,经辅助噬菌体超感染,成功构建了库容为5×10⁴的Anti-BXC单链抗体库,并从该抗体库中初步筛选到了特异性识别BXC的噬菌体单链抗体scFv。将表面展示单链抗体的单克隆噬菌体转化大肠杆菌HB2151进行可溶性表达,SDS-PAGE及Western blot分析结果显示,可溶性scFv获得表达,且与BXC具有结合活性,为松材线虫的检验检疫以及病理学研究奠定了基础。     

抗CD3基因工程嵌合抗体IgG在哺乳动物细胞中的表达和活性测定

利用基因工程方法将鼠源性抗CD3抗体HIT3a的可变区和人源抗体(IgG)的完整的恒定区连接起来,构建全抗型抗CD3嵌合抗体,该型抗体具有较低的免疫源性可作为免疫抑制剂应用于器官移植,减少受体产生免疫排斥,提高移植器官的存活率。利用PCR方法从抗CD3 ScFv重组噬菌体表达载体pCANTAB 5E上扩增抗CD₃抗体的轻链和重链可变区,将轻链和重链可变区组装到含有人抗体（IgG）恒定区的表达载体中,构建抗CD3嵌合抗体IgG的轻链和重链表达载体PKN100和PG1D105,并用脂质体法共转染CHO细胞。结果证明,抗CD₃嵌合抗体的V_L和V_H与HIT3a抗体的V_L和V_H完全相符,ELISA和Western blot检测结果证实转染细胞的培养上清中含有抗CD₃嵌合抗体IgG的表达,表达产物能与Jurkat细胞结合,并能竞争性抑制HIT3a抗体和Jurkat细胞结合活性,³H-TdR掺入实验表明, 抗CD3嵌合抗体与亲代抗体HIT3a一样,具有促进外周血单核细胞增殖的作用。我室构建的全抗型抗CD3嵌合抗体分子表达载体可在CHO细胞中稳定表达,表达产物有较好生物活性,具有潜在的临床应用价值。     

噬菌体抗体库的构建及抗乳腺癌细胞单链抗体的筛选

构建抗人乳腺癌细胞MCF 7的噬菌体单链抗体库 ,从中筛选MCF 7细胞特异性单链抗体。用MCF-7细胞免疫BALB C小鼠 ,取脾脏 ,提取总RNA ,用RT-PCR技术扩增小鼠抗体重链 (V_H)和轻链 (V_L)可变区基因 ,经重叠PCR(SOE-PCR) ,在体外将V_H和V_{L连接成单链抗体 (scFv)基因 ,并克隆到噬菌粒载体pCANTAB5E中 ,电转化至大肠杆菌TG1,经辅助噬菌体超感染 ,构建噬菌体单链抗体库。从该抗体库中筛选特异性识别MCF-7细胞的噬菌体单链抗体 ,将表面展示单链抗体的单克隆噬菌体转化大肠杆菌TOP10进行可溶性表达。成功地构建了库容为12×10⁶ 的抗MCF-7乳腺癌细胞的单链抗体库 ,初步筛选到了与MCF 7细胞特异性结合的scFv,Westernblot检测表明 ,在大肠杆菌TOP10中实现了单链抗体可溶性表达}     

Similar Susceptibility to Excess Irradiance in Sun and Shade Acclimated Saplings of Norway Spruce [Picea Abies (L.) Karst.] and Stone Pine (Pinus Cembra L.)

We compared the responses of sun and shade acclimated saplings of Picea abies and Pinus cembra to excess photosynthetic photon flux density (PPFD) equivalently exceeding the level for saturating net photosynthetic rate (P _N). Exposure for 2 h up to 2000 μmol(photon) m⁻² s⁻¹ did not affect radiant energy saturated P _N. Photoinhibition of photosynthesis was indicated by a small (10 %) reduction of the potential efficiency of photosystem 2 as derived from measurements of chlorophyll fluorescence (F_V/F_M). However, the extent of F_V/F_M reduction and half-time for recovery were similar in sun and shade acclimated saplings of both species. Furthermore, the effect on F_V/F_M was not stronger when the plants were exposed to excess PPFD at 5 °C instead of 15 °C. Frost-hardening of plants increased slightly their resistance to excess PPFD. Establishment of these conifer saplings usually acclimated to shade in their natural habitat may hardly be endangered by a sudden increase of PPFD, e.g., by gap formation. This revised version was published online in August 2006 with corrections to the Cover Date.     

长叶红砂主要水分参数随季节和生境的变化

运用压力容积(PV)技术,研究了4种盐分生境下长叶红砂饱和含水量时最大渗透势(Ψ_s^sat) 、初始质壁分离时的渗透势(Ψ_s^tlp)、初始质壁分离时渗透水相对含量(ROWC^tlp)、初始质壁分离时的相对含水量(RWC^tlp)、质外体水的相对含量(AWC) 、束缚水与自由水的比值(V_a/V_o) ,以及饱和含水量时最大渗透势与初始质壁分离时的渗透势之差(ΔP)的季节变化.结果表明：长叶红砂的主要水分参数Ψ_s^sat、Ψ_s^tlp值为5月＞7月＞9月,AWC、V_a/V_o 和ΔP值表现为5月＜7月＜9月.说明长叶红砂在季节变化中历经了逆境锻炼,其耐水分亏缺能力随5、7、9月逐渐递增,这与植物的生长发育节律相吻合;与其他荒漠旱生植物相比,长叶红砂的Ψ_s^sat和Ψ_s^tlp值非常低,具有很强的忍耐高渗压和维持低水势的能力.以3个月份4种不同生境所测水分参数值为基础,运用模糊数学隶属函数法对不同生境长叶红砂耐水分亏缺能力进行综合评价,得出重盐土＞非盐渍土＞盐渍土.     

抗人CD3单链抗体与改形单域抗体的表达

设计并化学合成含有适当酶切位点及连接肽的寡核苷酸序列,与一定的背景载体连接并改造成适用于单链抗体表达的载体:外分泌型pWAI80和融合蛋白型pROH80从分泌抗人CD3单克隆抗体的杂交瘤细胞UCHT1中,经PCR扩增出轻、重链可变区基因V_H和V_K,并插入上述表达载体中构建成单链抗体基因.通过对鼠OKT3结合位点的结构模拟,并比较人、鼠抗体家族性保守序列,设计出改形OKT3的基因序列.化学法部分合成8个寡核苷酸片段,应用重叠PCR技术扩增出完整改形重链基因V_H,并克隆、酶切和测序鉴定.将所克隆V_H基因插入表达载体pCOMB3和 pGEX-4T-1中进行表达.经 IPTG诱导表达,对表达产物进行SDS-PAGE和 Western blot分析以及 ELISA检测,结果发现分泌型表达产物及 M13基因Ⅲ-V_H改形单域抗体融合蛋白具有与CD3单抗竞争抑制的活性;而融合型单链抗体及改形单域抗体表达产物主要以包涵体形式存在,占细菌总蛋白的 30％左右.     

抗CD20嵌合抗体片段Fab′突变体的表达和活性研究

利用PCR方法从抗CD20单链抗体（ScFv）表达载体上扩增抗CD20抗体轻链可变区基因（V^L）、重链可变区基因（V^H）,同时在抗体的可变区引入突变,然后将V^H、V^L基因重组到Fab′表达载体pYZF1中,构建抗CD20嵌合抗体Fab′片段表达载体,并在大肠杆菌16c9中进行高效可溶性分泌表达。经大量的筛选,获得一个产量和活性均有所提高的突变克隆。其突变位点在轻链可变区的CDR1区,即G77→A（Ser→Asn）。突变的抗体的表达量为每克干菌3.8 mg,而未突变抗体的表达量为每克干菌1.3 mg。突变体的亲和力常数K_a为2.2×10⁹ L/mol,约为突变前的2倍。竞争性免疫荧光抑制实验表明,突变的Fab′片段能竞争性抑制鼠源性抗CD20抗体HI₄₇和CD20表达细胞Raji细胞的结合,使HI₄₇的结合阳性率由98%下降至37.55%,体外细胞生长抑制试验亦证明突变的Fab′片段的抑制活性明显高于未突变的抗体。