家蝇抗菌肽AMPs17蛋白原核表达条件的优化及其抗真菌活性检测

目的:优化AMPs17重组蛋白的原核表达条件,分析重组蛋白的抗真菌活性。方法:比较不同的诱导温度(25℃、28℃、30℃、32℃、34℃)、异丙基硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)诱导浓度(0. 025mmol/L、0. 05mmol/L、0. 1mmol/L、0. 3mmol/L、0. 5mmol/L、0. 8mmol/L、1. 0mmol/L)和诱导时间(12h、15h、18h、21h、24h)对AMPs17重组蛋白表达量的影响,筛选AMPs17重组蛋白的最佳表达条件;采用镍离子金属螯合剂亲和层析柱对重组蛋白进行纯化,SDS-PAGE和ImageJ图像分析系统对表达结果进行分析,Western blot对AMPs17重组蛋白进行鉴定,高效液相色谱分析重组蛋白的纯度,微量液体稀释法及菌落计数法检测其抗真菌活性。结果:在诱导温度为32℃、IPTG浓度为0. 05mmol/L的条件下诱导培养15h,AMPs17重组蛋白的表达量最高且最为稳定;HPLC色谱仪分析显示AMPs17重组蛋白纯度可达到90%以上;优化后的AMPs17重组蛋白能有效抑制白色念珠菌的生长。结论:优化了家蝇抗菌肽AMPs17的诱导表达条件,获得了高表达、稳定且具有抗真菌活性的蛋白质,为后续抗菌机制及应用研究提供一定的实验基础。     

白喉毒素DAB389-（Gly4Ser）2-α-促黑激素工程菌发酵条件的初步研究

目的：为了提高融合蛋白白喉毒素DAB389-（Gly4Ser）2-α-促黑激素的表达量,研究工程菌发酵条件的最优化。方法：利用三角瓶模拟小剂量发酵,在不同的受体菌、培养基、培养温度、时间、pH值、诱导剂浓度、诱导时间和温度等因素变化下研究目的蛋白的表达量。结果：工程菌优化的发酵条件为：最佳表达菌种为大肠杆菌BL21（λDE3）,最适宜的培养基为M982,适合的pH值为7．0-7．4,最佳诱导温度为30℃,诱导时间为6h,诱导剂IPTG的最佳用量为1．4mmol/L。结论：获得了DAB389-（Gly4Ser）2-α-促黑素细胞激素工程菌的最优化发酵条件,为中试放大提供了理论依据。     

肝靶向肽-抗肿瘤肽CSP-MDA-7/IL-24融合基因原核表达条件优化

目的:优化肝靶向肽-抗肿瘤肽(CSP-MDA-7/IL-24)在大肠杆菌中诱导表达的相关条件。方法:通过考察CSP-MDA-7/IL-24重组菌生长曲线,选择合适的诱导时机,通过SDS-PAGE检测CSP-MDA-7/IL-24蛋白的表达量,单因素分析诱导时间、培养基p H值、诱导温度和诱导剂IPTG浓度,在此基础上各选取5个水平进行正交实验,摸索最佳诱导表达条件。结果:培养基p H7.0、IPTG浓度0.12 mmol/L、培养温度42℃、诱导表达4 h为重组蛋白的最佳表达条件。结论:为进一步制备重组蛋白CSP-MDA-7/IL-24及评价其生物活性奠定了基础。     

荧光素酶基因luc在大肠杆菌中表达条件优化

对重组荧光素酶大肠杆菌菌株M15／pQE30-luc进行了表达条件的优化研究。单因素结果表明：在初始pH值7．0,装液量为20％,2％的接种量,终浓度为0．5mmol／L的IPTG,添加10—30mmol／L的Mg^2＋,摇床转速为200r／min,37℃诱导3．5h酶的表达量最高。正交试验结果表明：初始pH值为7．0,添加40mmol／LMg^2=,接种量2％,装液量为20％时表达量最高,比酶活达1．63×10^8RFU／mg蛋白。     

集胞藻PCC 6803蛋白SpPhaB和SpPhaE的原核表达及结晶条件筛选

【目的】克隆蓝藻集胞藻PCC 6803 SpPhaB和SpPhaE的编码基因并构建原核表达载体,优化培养条件以提高在大肠杆菌中可溶蛋白的表达量,筛选SpPhaB结晶条件,为PHB家族蛋白的结构与功能研究提供基础。【方法】克隆集胞藻PCC 6803 PHB合成途径的phaB、phaE基因,将phaB、phaE基因构建到表达载体pET28a中,优化IPTG浓度、诱导温度和诱导时间,提高在大肠杆菌BL21(DE3)中SpPhaB和SpPhaE可溶蛋白的表达产量,经Ni柱亲和层析纯化分别获得His-SpPhaB和His-SpPhaE蛋白,进一步筛选SpPhaB结晶条件。【结果】构建了pET28a-SpPhaB和pET28a-SpPhaE表达载体;优化获得SpPhaB可溶蛋白的最佳表达条件为：诱导温度37 °C、转速220 r/min、IPTG浓度0.1 mmol/L、诱导时间7 h;SpPhaE的可溶性蛋白最佳表达条件为：诱导温度25 °C、转速220 r/min、IPTG浓度0.5 mmol/L、诱导时间7 h,并获得了SpPhaB的结晶条件。【结论】构建了具有高效表达可溶的集胞藻PCC 6803 SpPhaB和SpPhaE的原核表达系统,并筛选优化了SpPhaB的结晶条件,为研究SpPhaB蛋白的结构及功能奠定了基础。     

美洲大蠊抗菌肽AMPPA13的表达及纯化

[目的]预测美洲大蠊新的抗菌肽基因,构建原核表达体系并纯化表达产物。[方法]通过生物信息学方法,预测分析出潜在的美洲大蠊抗菌肽。构建pET32a重组质粒,优化诱导表达条件,通过亲和层析,分子筛等手段获得纯化的抗菌肽,并进行Western Blot鉴定。[结果]预测出美洲大蠊新的抗菌肽基因AMPPA13,成功构建重组质粒pET32aAMPPA13。优化诱导表达条件得最佳IPTG浓度为0.1 mmol/L,最佳诱导时间为4 h,最佳诱导温度为37℃。纯化后AMPPA13浓度为268μg/m L。[结论]克隆出美洲大蠊抗菌肽基因,并成功构建原核表达体系,得到1 m L纯化的AMPPA13,经Western Blot鉴定,表达产物正确。     

黄粉虫抗菌肽在大肠杆菌中表达条件优化及活性分析

为了提高黄粉虫抗菌肽基因tmAMP1m在大肠杆菌中的表达量,研究了培养温度、诱导时间及IPTG浓度等不同条件对HIS-TmAMP1m融合蛋白表达量和活性的影响。通过Tricine-SDS-PAGE分析确定最佳表达条件,同时,通过琼脂孔穴扩散法检测其抑菌活性。结果表明,含有重组质粒的大肠杆菌在37℃,使用终浓度为0.1 mmol/L IPTG培养4 h时,融合蛋白表达量较高,可占细菌总蛋白40%以上,抗菌活性最好。用Ni2+亲和层析纯化获得较纯的融合蛋白,Western blotting分析表明其能与His单克隆抗体起特异性反应。诱导表达的融合蛋白对宿主菌生长产生一定程度抑制。融合蛋白经100℃煮沸10 h,在20℃反复冻融10次,与强酸强碱缓冲液、不同的有机溶剂和蛋白酶混合后都具有极强的稳定性,仍然表现出良好的抗菌活性。此外,最小抑菌浓度(MIC)测定结果表明,融合蛋白对5种菌具有良好的抗菌活性。研究结果为昆虫抗菌肽推广应用和进一步研究奠定了基础。     

小反刍兽疫病毒N蛋白原核表达条件的 优化及反应活性

目的探讨小反刍兽疫病毒(Peste des Petits Ruminants Virus,PPRV)N蛋白原核表达、条件优化及反应活性。方法参照GenBank中PPRV (Nigeria/75/1)N基因序列,人工合成该基因,构建重组表达质粒pET-30a (+)-N,转化至BL21 (DE3)感受态细胞,IPTG诱导表达,进行SDS-PAGE电泳、Western-blot分析。在不同温度、时间、IPTG浓度条件下诱导表达N蛋白,确定最佳表达条件。结果 PPRV N蛋白(64.4kD)成功表达,能被羊PPRV免疫血清所识别。N蛋白主要以包涵体存在,其最佳诱导条件:诱导温度28℃、IPTG终浓度2.0mmol/L、诱导时间16h。结论原核表达的PPRV N蛋白具有良好的特异性和反应活性,为单克隆抗体的制备及快速诊断方法的建立提供了技术资料。     

采用正交设计优化HPV16L1重组蛋白表达的实验研究

通过正交试验对构建的人乳头瘤病毒（HPV）16型L1蛋白的重组表达菌株pQE31—HPV16L1／M15（pREP4）进行表达条件的优化,以增加目的蛋白的表达量。实验选取影响蛋白表达的4个主要因素,分别为诱导时间、诱导剂浓度、细菌密度和诱导温度,采用四因素两水平正交试验,通过SDS-PAGE及Western blot测定重组表达蛋白,以Tanon凝胶成像系统分析目的蛋白含量作为检测条件优化效果的指标,所得数据采用SAS软件进行统计分析。实验结果表明在37℃、IPTG0．5mmol／L,菌密度OD600为1．0的条件下诱导4h所得蛋白量最大;经统计正交分析的最佳诱导条件为37℃、0．5mmol／LIPTG和菌密度OD600为1．0的条件下诱导7h。经实验验证,应用正交分析的最佳条件诱导所得目的蛋白量最大,但实际中通常采用诱导4h条件。实验证明正交试验可以用于基因工程菌株蛋白表达条件优化过程,提高工作效率。     

结核分枝杆菌H37Ra株HspX蛋白的表达条件优化、纯化和鉴定

以结核分枝杆菌H37Ra菌株基因组DNA为模板,利用PCR技术扩增获得HspX基因,通过DNA无缝克隆技术将其克隆至pET28a质粒中,构建重组表达质粒pET28a-HspX。将pET28a-HspX转化至大肠埃希菌表达菌株BL21(DE3),采用不同温度、IPTG浓度和时间诱导HspX蛋白表达。使用Ni-IDA亲和层析柱纯化目的HspX蛋白,透析去除咪唑,通过Western blot检测HspX抗原特异性。最终确定表达重组蛋白HspX的最佳诱导条件为：诱导温度37℃、IPTG浓度0.2 mmol/L、诱导时间8 h。结果表明,获得了高纯度和被特异性识别的可溶性Hsp X蛋白,为未来Hsp X蛋白用于结核病诊断试剂和疫苗奠定基础。