鸡蛋胚下表层卵黄DNA的提取方法

利用Ficoll-400不连续密度梯度离心将受精和未受精鸡蛋的胚下表层卵黄进行纯化, 显微镜观察表明卵黄球形态良好, 没有胚细胞的存在.然后利用较高浓度的蛋白酶K消化,较长时间的酚抽提,最后提取了DNA. 电泳显示DNA条带清晰.该方法简便快速,从每个鸡蛋的胚下表层卵黄可回收10 ng DNA.     

氯化钠密度梯度离心法制备用于显微注射的外源DNA片段

DNA显微注射是生产转基因动物最可靠和最常使用的一种方法,外源DNA的纯度对显微注射的成功起着至关重要的作用。本文介绍用氯化钠密度梯度离心的方法制备用于显微注射的外源DNA片段。与传统的琼脂糖凝胶回收的方法相比较,用此方法制备的外源DNA片段对小鼠受精卵进行显微注射后,受卵体母鼠的胚胎存活率,以及子代小鼠的外源基因整合率均有明显的提高。这一方法可为进一步提高转基因动物的成功率,提供方法学上的参考。 Abstract:DNA microinjection is the most popular and reliable method of producing transgenic animals.The purity of foreign DNA plays an important role for the success of microinjection.In this study,we introduced the use of sodium chloride step gradients in fractionating foreign DNA fragment for microinjection.The data demonstrated that,compared with the conventional agarose gel extraction method,NaCl purification scheme of toreign DNA could improve the treated embryo survival and foreign DNA intergration rate markedly.     

家兔肝脏LRP蛋白的分离纯化与鉴定

利用家兔LRP蛋白聚集形成蛋白复合物的性质,首先通过两次蔗糖密度梯度离心从家兔肝脏中分离得到LRP粗提液,再利用分子大小差异,使用Sephacryl-1000分子筛层析纯化,SDS-PAGE银染结果显示最终得到了单一电泳条带的家兔LRP蛋白.最后使用LRP单克隆抗体的Western blotting鉴定结果正确.     

应用离心方法提高杆状病毒对哺乳动物细胞转导实验效率

重组杆状病毒作为一种对哺乳动物细胞的新型基因转移载体已获得了日益广泛的应用。为进一步提高转导实验的效率,本研究利用已构建的带有CMV启动子-增强型绿色荧光蛋白(eGFP)表达盒的重组杆状病毒BacV-CMV-EGFPA,在CV-1细胞中探索了应用离心方法提高转导实验效率的可行性。结果显示离心方法可显著提高单位时间内重组杆状病毒对哺乳动物细胞的转导效率,同时不会对靶细胞造成损伤。通过对离心时间、离心后孵育时间、病毒上清的稀释缓冲液的进一步摸索优化,结果显示病毒上清以PBS为稀释缓冲环境室温600g水平离心1h即可获得高水平的转导效率,优于在PBS环境中27℃孵育8h的效果。该方法可在获得高转导效率的同时显著缩短实验时间,具有快捷、高效、低损伤的特点,可作为一种常规操作方法用于日常实验。本研究进一步应用该方法对多种不同来源和类型的哺乳动物细胞株进行基因转导,结果显示该方法可适用于多数不同种属和组织来源的哺乳动物细胞,其中对贴壁细胞的效果最为显著。     

大熊猫精液超低温冷冻的比较

对卧龙自然保护区大熊猫研究中心的9只雄性大熊猫电刺激采精,比较研究了稀释液中甘油含量、精液离心、不同稀释液和冷冻方法对大熊猫精液超低温冷冻保存后的活力、运动状态和顶体的影响。稀释液中甘油的含量为4％－5％较好,冻精解冻后的活力和顶体的正常率能保持鲜精的一半。离心和未离心的精液经超低温冷冻,解冻后的活力和运动状态都较接近。TEST和SFS两种稀释液的效果没有明显的差异。细管的冷冻过程较颗粒方便、快捷,时间容易控制,是一种较好的超低温冷冻精液的方法。     

实验离心技术与生命科学中的重大发现

实验离心技术的产生和发展与生命科学的发展密切相关,尤其是在细胞生物学和分子生物学领域,实验离心技术起着不可或缺的重要作用。许多科学家运用这些技术在其领域做出了突出贡献,并荣获诺贝尔奖。就实验离心技术的产生和发展及其对生命科学发展的重要作用做简要回顾。     

离心、超滤技术在甲型肝炎减毒活疫苗生产工艺中的应用

采用离心和超滤技术进行甲型肝炎减毒活疫苗生产 ,达到提高病毒的收获率。将含有甲型肝炎病毒的细胞收获液离心 ,上清进行超滤浓缩 ,回收病毒 ,病毒回收效果好。实验证明 ,该方法适合规模化生产。     

一种琼脂糖凝胶电泳分离质粒DNA的方法

分子无性繁殖已成为扩增特定 DNA 片段的广为使用的技术,而细菌质粒是很多无性繁殖工作中所选用的载体。近年来分离载体的方法,大多是根据载体 DNA 的共价闭合环状(CCC—DNA)性质及其对变性的抗性.在氯化铯—溴化乙锭梯度中,CCC—DNA 密度大,比线状 DNA 沉降快,所以用密度梯度超离心方法可获得高纯度的 CCC—DNA。但超离心方法在时间上、材料上都不够经济,在     

两种抽提乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA方法的效果比较

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)作为一种嗜肝DNA病毒,在感染肝细胞后会在细胞核中形成病毒转录复制的模板和基因储存库--共价闭合环状DNA(covalently closed circular DNA, cccDNA),其持续存在是乙型肝炎慢性化和难以治愈的核心,也是此研究领域内的重点。从细胞样品中稳定抽提获取cccDNA对于保证cccDNA检测的准确性至关重要。Hirt法是一种抽提真核细胞染色体外DNA的方法,被用于HBV cccDNA的抽提,但存在操作复杂和耗时长等问题。为简化操作,有研究对Hirt法进行改良,结合硅胶膜离心柱来抽提染色体外DNA,但尚不清楚该法用于HBV cccDNA抽提与传统Hirt法的效果差异。本研究基于HBV cccDNA细胞转染系统、HBV复制细胞系及感染系统,以DNA印迹(Southern blot)和定量聚合酶链式反应(quantitative polymerase chain reaction, qPCR)作为检测评价手段,平行比较了传统Hirt-酚/氯仿法与改良Hirt-过柱法抽提HBV cccDNA的效果。结果表明,两种方法具有相当的抽提效率和抽提特异性,而改良Hirt-过柱法耗时更短,提示在进行细胞HBV cccDNA抽提时可选择改良Hirt-过柱法以提高实验效率。     

从凝胶中回收DNA

引言 琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺电泳技术目前得到了广泛的应用。它们按分子大小分离DNA分子,具有很高的分辨率。从混合物中分离单一种类DNA分子,凝胶电泳既可用于分析又可用作制备。用于制备时一个主要问题是如何从一含DNA的胶带中得到较高的DNA回收率而避免凝胶介质污染。本文拟对回收的方法学作一概述。     

四种土壤微生物总DNA的纯化方法的比较

比较了4种从土壤中直接抽提的微生物总DNA的纯化方法,实验结果表明1 %的琼脂糖凝胶电泳纯化方法及葡聚糖凝胶G 2 0 0离心层析纯化方法均不能完全纯化从土壤中抽提的微生物总DNA。若将直接抽提的总DNA先经葡聚糖凝胶G 2 0 0离心层析纯化,再用1 %的琼脂糖凝胶电泳纯化,则能取得较好的纯化效果。含2 %PVP的1 %琼脂糖凝胶电泳纯化,用DNA凝胶回收试剂盒回收后没有得到纯化后的土壤微生物总DNA。     

一种简便、高效、经济的从凝胶中回收DNA的方法

目的:尝试一种简便、高效的从凝胶中回收DNA的方法。方法:在Eppendorf管的管底用注射器扎孔,将一小团用Eppendorf管融化后拉成的细丝放入管中,把含有DNA的凝胶放在细丝上,离心,收集从管底流出的液体,经酚氯仿抽提后用乙醇沉淀DNA。结果:经过简单的离心即可近乎100%地回收凝胶中的DNA。结论:使用该方法从琼脂糖凝胶回收DNA,操作简单,回收率高,无其他试剂污染。     

一种改进的牛体细胞核移植去核方法

为了提高传统的盲吸法牛体细胞核移植去核效率,将0.5mL离心管底部截掉,在截口处蒙上一层400目的细胞筛网,再与1 mL的离心管套在一起。实验1,将成熟的卵母细胞置于改造过的离心管内膜上,分别以1,000r/min、2,000r/min及3,000r/min离心10min,Hoechst 33342染色后,在荧光显微镜下计算第一极体与染色体的位置关系及去核效率;实验2,将卵母细胞以2,000r/min离心后去核做受体,颗粒细胞做供体进行核移植,检查重构胚胎的早期发育情况。结果表明:以2,000 r/min将卵母细胞离心10min后,有86.6%卵母细胞的极体与染色体之间夹角在20°以内,此时去核效率最高(87.4%);将卵母细胞离心后,对随后的重构胚发育无影响。因此,采用离心辅助去核的方法可以显著提高牛卵母细胞的去核效率。     

大鼠肠内容物细菌基因组DNA提取方法的比较

目的比较两种肠内容物前处理和两种提取方法对清洁级SD大鼠肠内容物细菌基因组DNA提取效率。方法分别选用PBS多次离心漂洗、液氮破细胞两种前处理方法和酚/氯仿抽提、试剂盒过柱法两种提取方法进行组合分析,对4份肠内容物和16份含金黄色葡萄球菌肠内容物进行随机提取。结果大鼠肠内容物细菌基因组DNA含量和纯度测定结果显示,与PBS反复离心相比,液氮研磨前处理能显著提高大鼠肠内容物基因组DNA。荧光定量PCR表明,液氮研磨前处理较PBS反复离心能更好地收集细菌基因组DNA,其Ct值最低。结论研究结果表明,采用液氮研磨试剂盒法在大鼠肠内容物DNA提取中是较为优良的方法,该方法为建立实验动物中微生物的定量PCR检测方法打下了基础。     

家蚕核多角体病毒DNA

用酚或pH10缓冲液抽提家蚕核多角体病毒DNA 时,得到两种不同的结果。酚抽提的DNA 超离心沉降系数(S_20,w)是28.5S,电镜观察到的是线型DNA 分子,长约8微米,最长的可达10微米以上。聚丙烯酰胺凝胶电泳、Sepharose 柱分析和蔗糖密度梯度超离心等分析中,都是一个组分。pH10缓冲液抽提的DNA,超离心沉降系数(S_(20),w)只有4.7S,聚丙烯酰胺凝胶电泳中迁移速度远比酚抽提的快,并且是一条扩散的宽带,Sepharose 柱分析亦表明分子量远比酚抽提的小。文章对这种不同的结果进行了讨论。     

DNA的等密度离心法

在密度梯度中的平衡离心(Equilibrium Centrifugation),现在普遍把它称做为等密度区带离心(lsopycnic banding Centrifugation)或叫等密度离心(lsopycnic centrifugation)。这种名称应该说是适合的,因为它的意思是,离心样品,在离心力作用下,被赶到离心池或离心管中介质的某一点上。     

随体DNA不是指随体中的DNA

随体(satellite)是细胞中的一个结构成分,指某些染色体远端前的一小段,是一小段染色体,一般也是一个核仁组织区.随体DNA(Satellite DNA),则是指在DNA密度梯度离心时,处于卫星带中的DNA.真核生物的核内DNA,在CsCl或Cs_2SO_4中进行密度梯度离心时,除了形成一个主带(main band),即包含大部分DNA的分带外,往往在主带较轻或较重的一边还有一个或几个副带,称卫星带(satellite band).一般地,随体DNA(处于卫星带中的DNA)是高度重复DNA. 随体既然是一小段染色体,其中当然就有DNA.     

改良离心集菌法检测痰内抗酸杆菌的研究

目的研究改良离心集菌法,测定其是否能使抗酸杆菌的诊断更为安全简便。方法选取传统的抗酸杆菌直接涂片法1＋和1＋以下的阳性标本100例,用改良离心集菌法复检;再配制浓度为10000、5000、1000和100条／mL的痰菌液各100份,分别用直接涂片法和改良离心集菌法检测其检出限和检出率;最后以日常门诊标本1036例分别用两种方法进行临床应用检测和分析。结果100例直接涂片法1＋和1＋以下的阳性标本改为改良离心集菌法复检,结果为4＋有93例、3＋为7例;直接涂片法和改良集菌法的检出限分别为1000和100条／mL;10000、5000、1000和100条／mL的痰菌液用直接涂片法和改良离心集菌法检测其检出率分别为97％、53％、5％、0％和100％、100％、94％、7％。1036例日常标本用直接涂片法和改良集菌法检测的阳性率分别12．74％和16．47％。结论改良离心集菌法的阳性率高于直接涂片法,检出限低于直接涂片法,不但大大改善了实验室和实验人员生物安全,还弥补了直接涂片法中对结核杆菌在痰液中分布不均一性带来的漏检的方法局限性,因此改良离心集菌法是安全、简便的抗酸杆菌实验室值得推广使用的新诊断方法。     

管藻目绿藻刺松藻LHCII复合物的分离

采用TritonX 10 0增溶刺松藻类囊体膜 ,经初离心、蔗糖密度梯度离心和Mg2 聚集作用后再离心 ,纯化到一种只含有分子质量为 2 80 0 0u脱辅基蛋白的LHCII复合物。证实此种多肽为同时结合有Chla、Chlb和管藻黄素及管藻素的色素蛋白复合物 ,Chla/b =0 .91。吸收和荧光光谱显示分离物中各种色素之间保持着良好的能量传递关系 ,其中管藻黄素及管藻素吸收的光能可直接传递给Chla ,而无需Chlb作为中介     

一种改良的RNA超离心制备方法

RNA制备是分子生物学中常用的实 验技术之一。RNA的常用制备方法包括蛋白酶K/SDS法、异硫氰酸胍或盐酸肌超离心法以及热酚法等。我们在制备非洲爪赡(XenopusLaevis)早期胚胎RNA的过程中,通过对不同实验方法的比较,摸索出一种RNA制备方法(改良法),提高了起离心的效率,简要介绍如下。