新型冠状病毒S蛋白抗体制备及双抗体夹心ELISA抗原检测方法的建立

由SARS-CoV-2(Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2)引起的新型冠状病毒肺炎(Corona virus disease 2019,COVID-19)自2019年底暴发以来,已导致上亿人次感染和数百万人死亡,严重威胁着全人类的生命健康。为了建立一种能快速对新冠病毒疫苗中S蛋白抗原进行定量检测的方法,本研究通过免疫山羊制备多克隆抗体作为包被抗体,通过杂交瘤细胞技术制备了S蛋白特异性单克隆抗体并作为检测抗体,建立了双抗体夹心ELISA抗原检测方法,并验证其线性范围、敏感性、特异性、稳定性及符合率。结果显示,建立的双抗体夹心ELISA检测方法线性范围为1U~64U,相关系数R²大于0.99;特异性良好,敏感性为92.1%;批内和批间变异系数分别为2.5%~11.7%和1.3%~14.8%,检测已知背景样本符合率为96.7%。结果表明,该方法特异性好、敏感性高、且稳定性和准确性高,可用于新冠疫苗中S蛋白抗原含量测定。     

人心肌肌钙蛋白Ⅰ单克隆抗体及多克隆抗体的制备

目的:以重组人心肌肌钙蛋白Ⅰ(cTnⅠ)为抗原制备鼠源单克隆抗体(McAb)及兔源多克隆抗体,并鉴定抗体的特性。方法:以纯化的重组人cTnⅠ为抗原免疫BALB/c小鼠,取鼠脾细胞同Sp2/0骨髓瘤细胞融合,利用选择培养基筛选融合的杂交瘤细胞,用有限稀释法分离获得能够稳定分泌抗cTnⅠ的McAb阳性克隆,并利用体内诱生法大规模制备McAb,用辛酸-硫酸铵沉淀法纯化抗体;兔多抗制备以cTnⅠ为抗原常规免疫后取其血清;用间接ELISA和Western印迹鉴定抗体的性质。结果:经ELISA鉴定,筛选出5株能分泌cTnⅠMcAb的杂交瘤细胞株,即C5B2、C5B3、C5B4、C5B1、B1A6,效价最高的B1A6株分泌的McAb为IgG3型,纯化后效价为1∶10000,亲和常数为1.08×10-9mol/L,Western印迹鉴定表明cTnⅠMcAb有良好的特异性;兔多抗纯化后的效价为1∶8000。结论:制备了具有良好特性的cTnⅠMcAb和多克隆抗体。     

新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体制备及双抗体夹心ELISA抗原检测方法的建立

由新型冠状病毒（SARS-CoV-2）感染引起的新型冠状病毒肺炎（COVID-19）自暴发以来,严重威胁着人类健康。建立一种快速、可靠、易操作的可用于SARS-CoV-2感染早期诊断的检测方法,对于疫情防控至关重要。SARS-CoV-2核衣壳蛋白（Nucleocapsid protein,NP）是抗原检测的理想靶点。为了建立一种可快速对SARS-CoV-2 NP进行定量检测的诊断方法,本研究通过免疫山羊制备羊抗SARS-CoV-2多克隆抗体并作为包被抗体,通过杂交瘤细胞技术制备鼠抗NP单克隆抗体并作为检测抗体,建立了双抗体夹心ELISA抗原检测方法。对反应条件进行优化,并验证其线性范围及检测下限、敏感性、特异性、稳定性及准确度。结果显示,建立的方法检测线性范围为1 000 ng/mL～7.8 ng/mL,R2>0.99,检测下限为3.9 ng/mL;敏感性为96.875%,特异性良好,与Vero细胞、SARSCoV-2刺突蛋白、流感病毒等不发生交叉反应;批内和批间变异系数分别为2.1%～11.7%和4.3%～11.8%;检测样品回收率在94.3%～104.8%之间。结果表明,该方...     

hGH单克隆抗体的筛选及双抗体夹心ELISA检测方法的建立

采用杂交瘤法制备单克隆抗体,并用辛酸-硫酸铵法纯化单抗,通过ELISA方法和Western blotting测定抗体的效价与特异性,并进行抗体类型、相对亲和力测定;应用纯化的单抗建立hGH双抗体夹心ELISA检测方法。筛选出两株可以稳定分泌抗hGH单抗的杂交瘤细胞株,分别命名为3E11、2G9,抗体类型均为IgG1,抗体滴度均可达10-10,特异性好,相对亲和力高,以筛选到的两株单抗建立的双抗夹心ELISA法线性范围为0.09～1.5625ng/mL,R2>0.9,灵敏度为0.09ng/mL。筛选出高效抗hGH的单抗,并建立了hGH双抗体夹心ELISA检测方法。     

柑橘衰退病毒多克隆和单克隆抗体的制备及检测效果分析

通过改进提纯方法获得了柑橘衰退病毒(Citrustristezavirus,CTV)的提纯液,其产量为1mg/100g植物组织。用CTV免疫大耳白兔,获得多克隆抗体,间接ELISA效价为1∶25600。用CTV免疫小鼠,经细胞融合、ELISA筛选和克隆化培养,获得18株能稳定分泌抗CTV单克隆抗体的杂交瘤单细胞株。对其中4株单克隆腹水抗体进行分析的结果表明,这些抗体的ELISA效价为1∶51200~1∶204800,其中2G和3H的抗体类型及亚类为IgG2a,1E和4H为IgG2b。用所制备抗体对不同来源柑橘样品的CTV检测结果显示,单克隆和多克隆抗体结合使用,采用三抗体夹心ELISA(TAS-ELISA)可以获得理想的检测效果,其特异性强、灵敏度高。同时发现所分析4株单克隆抗体对不同的CTV分离物鉴别能力存在差异,但有关这些CTV分离物的特性及其血清学关系还需进一步研究。     

OGT 多克隆抗体的制备及特异性分析

目的:为了探讨O-GlcNAc糖基转移酶OGT的生理和病理作用,需制备能高效特异性检测OGT的抗体。方法:在NCBI数据库中,查找人源OGT基因序列,根据OGT的结构特点,选取OGT的C末端催化结构域中的一段多肽序列(464-949位点氨基酸)做抗原。首先,构建OGT的C末端催化结构域(464-949位点氨基酸)的重组表达载体pET30-a-OGT-C,转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,IPTG诱导表达融合His标签的OGT-C蛋白,Ni+珠亲和层析法纯化提取OGT-C蛋白。再以OGT-C重组蛋白作为抗原,免疫Wistar大鼠制备多克隆抗体,并用间接ELISA法检测OGT抗体的效价,Western blotting鉴定抗体特异性。结果:多抗效价达1:80000;在免疫印迹实验中,此多抗可以高效的检测重组抗原,并可以特异性识别培养细胞内源表达的ncOGT和mOGT这2种OGT亚型。结论:实验结果表明,获得高效价、高特异性的OGT多克隆抗体,在OGT的生物学研究中可以用于检测ncOGT和mOGT的表达。     

抗CPV-2a单克隆抗体的制备及双抗体夹心ELISA检测方法的建立

犬细小病毒病是危害养犬业的重要传染病之一,患病犬难以治愈.单克隆抗体治疗此病效果明显,本文介绍了制备抗CPV-2a单克隆抗体的方法.用纯化的犬细小病毒(canine parvovirus,CPV) 2a型分离株免疫新西兰大白兔和Balb/c小鼠制备抗CPV-2a多克隆抗体及单克隆抗体.经亚克隆得到1H9、2B5、2B7和2C7共4株单抗,Western blotting鉴定单抗的免疫反应性;间接ELISA方法检测单抗的特异性.为了快速对犬细小病毒病作出诊断,建立了CPV-2a双抗夹心ELISA方法.兔多抗作为捕获抗体,鼠单抗作为示踪抗体,辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG作为检测系统;捕获抗体和示踪抗体最佳稀释度分别为1:800和1:2 000;检测系统最佳稀释度为1:4 000.结果表明:所得4株单抗与pET-32a-VP2蛋白发生特异性反应,且与狂犬病毒(RV)、犬温热病毒(CDV)不交叉反应;建立的双抗夹心ELISA方法对病毒的最低检出量为4.375 μg/mL,与美国RB试剂盒相比,符合率为95%.单抗制备为犬细小病毒病的治疗奠定了基础;双抗夹心ELISA方法的建立为疑似粪便样本提供了简单、快速和可靠的检测手段.     

抗猪鼻支原体单克隆抗体的研制及双抗体夹心ELISA检测法的建立

目的 制备多种抗猪鼻支原体的单克隆抗体,建立双抗体夹心ELISA方法用于该病原体的检测。方法用猪鼻支原体CVCC361免疫BALB／c小鼠,采用杂交瘤技术和酶联免疫吸附实验筛选出抗该病原体的单克隆抗体;运用免疫双向扩散试验、Western blotting确定I异G亚类及针对抗原的相对分子质量;筛选出配对抗体,建立双抗体夹心ELISA的检测方法,并评价其灵敏度和特异性。结果共筛选出17株单克隆抗体,抗体亚类分别为IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3,免疫印迹结果表明单抗ZB1、ZB2及ZB16与相对分子质量为35×103的抗原有特异性结合,而ZB3和ZBIO与相对分子质量为70×10^3的抗原有特异性结合。确定了2个配对抗体（ZB1-ZB1-HRP和ZB1-ZB2-HRP）,可检出最小抗原量为30ns／mL,检出猪鼻支原体活菌8．34×10^2CFU／mL,与人呼吸道常见的致病菌及支原体均无非特异性反应。结论筛选的单克隆抗体具有较高的特异性和敏感性,应用双抗体夹心ELISA方法可用于猪鼻支原体的检测。     

抗GPNMB单克隆抗体的制备及双抗体夹心ELISA方法的建立

目的:制备抗GPNMB单克隆抗体,建立双抗体夹心ELISA检测GPNMB在胶质母细胞瘤中的表达情况.方法:以新鲜胶质母细胞瘤组织为材料,提取总RNA,通过RT-PCR扩增得到GPNMB cDNA序列,经NcoⅠ和XhoⅠ双酶切后,克隆入PET-28a(+)进行原核表达,经蛋白纯化得GPNMB-6× His融合蛋白;以该融合蛋白免疫BALB/c小鼠,淋巴细胞杂交瘤法制备单克隆抗体;采用Western-blot、双抗体夹心ELISA以制备所得的抗GPNMB抗体检测胶质母细胞瘤细胞系U251、U373、SHG44和星形胶质细胞系SVG12中GPNMB的表达.结果:成功构建了GPNMB原核表达载体,获得了GPNMB-6×His重组蛋白;制备得到了G203、F105和M306共3株抗GPNMB的单克隆抗体,腹水ELISA效价分别为1∶8000、1∶8000、1∶5000,抗体亚类分别为IgG2、IgG1和IgG1,进一步实验证实单克隆抗体G203和M306可用于双抗体夹心ELISA检测不同胶质细胞瘤细胞系中GPNMB的表达.结论:成功制备出抗GPNMB单克隆抗体,效价及特异性良好,并证实GPNMB在胶质母细胞瘤细胞系中高表达,为进一步研究GPNMB在胶质母细胞瘤中的作用奠定了基础.     

汉滩病毒PS-6单克隆抗体的制备及其双抗体夹心ELISA检测方法的建立与应用

目的 制备汉滩病毒(Hantaan virus, HTNV)PS-6株小鼠单克隆抗体(monoclonal antibody, mAb),建立HTNV抗原双抗体夹心ELISA检测方法,验证方法的检测性能并初步应用于疫苗抗原含量检测。方法 以HTNV PS-6株灭活全病毒原液作为免疫原,采用小鼠杂交瘤融合技术,筛选mAb杂交瘤细胞株,制备mAb;用间接ELISA测定mAb效价;用Western blot鉴定mAb特异性;用间接ELISA测定mAb相对亲和力;经抗体配对筛选,建立双抗体夹心ELISA病毒抗原检测方法。以I型肾综合征出血热疫苗标准品作为定量标准,验证该方法的检测限、线性范围、特异性、准确度、精密度;对6批次I型肾综合征出血热灭活疫苗原液进行检测,初步验证该方法的适用性。结果 获得4株稳定分泌抗HTNV PS-6特异性抗体的阳性杂交瘤细胞株：4B2、3H8、5D7及2A7;间接ELISA检测腹水抗体效价均在1×10⁶～1×106～1×10⁷;Western blot鉴定4株mAb均能特异性识别HTNV PS-6;相对亲和力为4B2>5D7>3H8>2A7;抗体ELISA配对筛选后,选用5D7作为包被抗体,4B2作为标记抗体,包被抗体工作浓度为10μg/mL,HRP标记抗体工作浓度为1∶5 000。该方法对HTNV PS-6抗原检测限为0.039 1μg/mL;检测线性范围为0.078 1～2.500 0μg/mL,R7;Western blot鉴定4株mAb均能特异性识别HTNV PS-6;相对亲和力为4B2>5D7>3H8>2A7;抗体ELISA配对筛选后,选用5D7作为包被抗体,4B2作为标记抗体,包被抗体工作浓度为10μg/mL,HRP标记抗体工作浓度为1∶5 000。该方法对HTNV PS-6抗原检测限为0.039 1μg/mL;检测线性范围为0.078 1～2.500 0μg/mL,R²> 0.97;检测与I型肾综合征出血热疫苗生产主要原辅料成分、II型肾综合征出血热疫苗、森林脑炎疫苗及甲肝疫苗均无交叉反应;准确度验证,病毒抗原回收率在95.8%～110.5%之间;试验内和试验间精密度,CV分别在6.72%～8.03%、8.24%～9.70%之间。用该方法检测6批次I型肾综合征出血热灭活疫苗原液,结果均呈剂量依赖性。结论 成功制备HTNV PS-6株mAb,建立病毒抗原双抗体夹心ELISA抗原检测方法,方法准确、可靠,可初步应用于I型肾综合征出血热灭活疫苗科研、生产过程病毒抗原检测。     

Detection of Bluetongue Virus Group-specific Antigen Using Monoclonal Antibody Based Sandwich ELISA

A monoclonal antibody (MAb) specific for the bluetongue virus (BTV) group specific antigen (VP7) was characterized for its reactivity with purified virus and recombinant BTV VP7 (rVP7) protein and its suitability for use in the sandwich ELISA.The MAb,designated as 5B5 was specific to VP7 and belongs to IgG2a subclass and was selected for the development of the sELISA in this study.The MAb had a titer of 1:25 with BTV and 1:2 with the rVP7 protein.The sELISA is based on capturing of BTV antigen with VP7 spec...     

抗人beta-HCG单克隆抗体的制备及化学发光 检测方法的建立

目的：制备人绒毛膜促性腺激素（beta-HCG）单克隆抗体,建立人beta-HCG双抗体夹心CLIA 检测方法。方法：用人beta-HCG 抗原 免疫小鼠,通过细胞融合、筛选后得到杂交瘤细胞株,然后将细胞株扩大培养并纯化上清液获得抗体,测定抗体亲和力、特异性及 表位,最后建立双抗体夹心CLIA方法。结果：获得4 株抗人茁-HCG的杂交瘤细胞株(beta-1-1、beta-2-1、beta-3-1、beta-4-1)。用beta-1-1 和 beta-2-1 建立的双抗体夹心法的检测范围为0.5 mIU/mL-800 mIU/mL,灵敏度0.23 mIU/mL,检测结果的相对偏差均在± 10 %内,回 收率在90 %以上。结论：本研究最终成功制备了抗人beta-HCG mAb,建立了定量检测人beta-HCG 的双抗体夹心CLIA 方法,为 beta-HCG 检测及疾病的诊断奠定基础。     

口蹄疫病毒单克隆抗体的制备及检测应用

用纯化的口蹄疫病毒(Footandmouthdiseasevirus,FMDV)免疫BALB/C小鼠,将免疫鼠的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,采用有限稀释法进行克隆,经筛选获得多株能稳定分泌抗FMDV单抗的杂交瘤细胞株。选择其中一株(2G12)用于下列实验,其细胞培养上清液的效价是1:256,腹水效价是1:1280;以自行制备的兔抗FMDV高免血清IgG为捕获抗体包被酶联免疫吸附试验微量反应板,以单抗2G12为第二抗体,建立了快速检测FMDV抗原的双抗体夹心ELISA,该方法能检出90ng病毒,而且只与FMDV发生特异性反应,与猪瘟病毒(HCV)、猪蓝耳病病毒(PRRSV)、伪狂犬病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)和乙脑病毒(JEV)均不发生反应。本研究为检测口蹄疫病毒抗原提供了灵敏和特异的方法。     

Characterization of Mono- and Polyclonal Antibodies Against Highly Purified Choline Acetyltransferase: A Monoclonal Antibody Shows Reactivity in Human Brain

Choline acetyltransferase (ChAT) from porcine brain was purified by immunoaffinity chromatography, and the highly purified enzyme was subsequently used for immunization of mice and rabbits. After fusion of mouse spleen cells, 32 cultures producing monoclonal antibodies directed against ChAT were detected by an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) with immunoaffinity-purified ChAT. Of these original 32, the most active 11 cultures were cloned and used for ascites production. The 11 clones generated monoclonal antibodies of the immunoglobulin (Ig) M class (three), the IgG1 subclass (seven), and the IgG2b subclass (one). The isoelectric points of the antibodies of the IgG class were different in each case. The monoclonal antibodies exhibited different binding characteristics in the above ELISA and on western blots. Two monoclonal antibodies demonstrated excellent immunohistological results with neurons of rat brain and spinal cord. One of them reacted well immunohistochemically with neurons of human brain and also recognized partially purified human placenta ChAT in the ELISA.     

Nodal检测双单抗夹心ELISA法建立及应用

现已证实,Nodal参与了肿瘤恶性生物学过程,但对其高敏感检测法尚未建立。采用基因工程表达人源Nodal作为抗原免疫BALB/c小鼠,通过经典PEG诱导的细胞融合技术筛选出针对Nodal的特异性单克隆抗体7株。夹心ELISA确证7株抗体组成了15种可配对的抗体对。经筛选后选取抗体对AF12-DG5建立标准化夹心ELISA法,结合生物素-亲和素检测系统,DG5抗体标记生物素,采用链亲和素与辣根过氧化物酶标记的生物素(HRP-Biotin)按质量比4∶1预先混合孵育的ABC混合物进行检测,以提高ELISA法的灵敏度。棋盘滴定确定抗体工作最佳浓度为:捕获抗体(AF12)2μg/ml,检测抗体(生物素化DG5)2μg/ml。此条件下的夹心ELISA法线性范围为0~3 000pg/ml,检测限为68pg/ml,平均回收率为99.6%,精密度准确度良好。以正常人血清作为阴性对照,使用该夹心ELISA法测定结直肠癌、鼻咽癌和胆囊癌患者血清,发现三种肿瘤患者血清与正常人血清中的Nodal浓度均存在明显的统计学差异,可作为临床使用参考。     

抗埃博拉病毒核蛋白抗体的制备与双抗夹心ELISA检测方法的建立

目的:制备抗埃博拉病毒核蛋白(EBOV NP)单克隆抗体和多克隆抗体,建立针对EBOV NP的ELISA检测方法。方法:以重组EBOV NP免疫动物并制备多克隆抗体和单克隆抗体。在此基础上,通过优化抗体浓度、包被液等条件建立检测EBOV NP的双抗夹心ELISA方法。结果:制备出了兔多克隆抗体,筛选出2株可分泌单克隆抗体的鼠源杂交瘤细胞株。Western blot实验结果表明兔多抗与鼠单抗的结合区域均为N端1~35氨基酸。通过优化,建立了针对EBOV NP的双抗夹心ELISA检测方法。其线性范围是31.2~1 000 ng/ml,最低检测限为2.6 ng/ml。结论:制备出了抗EBOV核蛋白的高特异性多克隆抗体和单克隆抗体,建立了定量检测EBOV核蛋白的方法。     

双抗体夹心ELISA检测人C蛋白的研究

本文建立了检测人Ｃ蛋白的双抗夹心ＥＬＩＳＡ方法。该方法的最佳实验条件为：－抗浓度５－８．５μｇ／ｍｌ;二抗密度为１：２００－１：１０００倍稀释。制作了Ｃ蛋白浓度与ＯＤ值的关系的工作曲线,指出了用内插法测定Ｃ蛋白的最佳浓度范围为０－１００ｍｇ／ｍｌ之间。     

Detection of bluetongue virus group-specific antigen using monoclonal antibody based sandwich ELISA

A monoclonal antibody (MAb) specific for the bluetongue virus (BTV) group specific antigen (VP7) was characterized for its reactivity with purified virus and recombinant BTV VP7 (rVP7) protein and its suitability for use in the sandwich ELISA. The MAb, designated as 5B5 was specific to VP7 and belongs to IgG2a subclass and was selected for the development of the sELISA in this study. The MAb had a titer of 1:25 with BTV and 1:2 with the rVP7 protein. The sELISA is based on capturing of BTV antigen with VP7 specific MAb followed by detection using BTV polyclonal antiserum raised in rabbits. The assay was evaluated with six cell culture adapted serotypes of BTV that have been isolated from India, 1, 2, 15, 17, 18 and 23. The assay could detect BTV antigen as early as day 8 in blood. It was also successfully applied for the detection of BTV group specific antigen in clinical samples of blood, washed RBCs, buffy coat and plasma. A total of 102 field samples from animals, suspected of being infected with BTV, were tested and 29.42% were positive. The blood samples were also amplified in cell culture which improved the sensitivity of the assay. Results confirmed that the sELISA is rapid and specific.